金钱鱼胰岛素样生长因子(IGF)的克隆及雌二醇对其表达的影响.pdf

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1、分类号：Q959.483密级：UDC：597.556学号：2111501007硕士学位论文金钱鱼胰岛素样生长因子(IGF)的克隆及雌二醇对其表达的影响张克伟指导教师：李广丽教授申请学位类别：理学硕士专业名称：海洋生物学研究方向：海洋经济动物发育生物学学院名称：水产学院中国·湛江2018年6月金钱鱼胰岛素样生长因子(IGF)的克隆及雌二醇对其表达的影响摘要胰岛素样生长因子（Insulin-likegrowthfactor，IGF）是由肝脏分泌的一种肽类激素，可促进细胞的分化和有丝分裂，对动物生长具有非

2、常重要的作用。影响IGF合成和分泌的因素有很多，在哺乳动物，雌二醇（E2）也可以通过雌激素受体（EstrogenReceptors，ERs)调节IGF的合成与分泌。本研究克隆了两种包含ORF的金钱鱼IGF基因cDNA序列（(IGF-1和IGF-2)；采用RT-PCR方法检测了IGFs在11种组织（垂体、胃、下丘脑、性腺、肾脏、肝脏、肠、脾、鳃、心和肌肉）中的表达；应用荧光定量PCR检测了金钱鱼胚胎9个不同发育阶段（4细胞期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、眼囊形成期、尾牙期、晶体形成期和肌肉效应期），以

3、及性腺不同发育时期（II期、II期和IV期）IGFs的表达水平，检测了注射雌二醇（E2，4ug/g体重）对垂体GH、肝脏IGFs、ERs和GHRsmRNA表达的影响，以及E2、广谱型雌激素受体拮抗剂（Fulvestrent）、α型雌激素受体拮抗剂（MPP）、β型雌激素受体拮抗剂（PHTPP）离体（0.1、1和10μM）孵育对肝脏IGFs、ERs和GHRsmRNA表达的影响。主要结果如下：1、金钱鱼IGF基因克隆及序列分析克隆获得金钱鱼两种IGF亚型，其中IGF-1的开放阅读框（Openreading

4、frame，ORF）为561bp，编码个186氨基酸，包含15个结合蛋白结合位点、四个poly核酸结合位点、一个信号肽区域和一个家族活性肽区域；IGF-2的ORF为648bp，编码215个氨基酸，包含14个结合蛋白结合位点、五个poly核酸结合位点、一个信号肽区域和一个家族活性肽区域。两种IGF氨基酸序列同源性比对表明，金钱鱼IGF具有较高的保守性。进化树分析发现，金钱鱼IGF-1和IGF-2与鲈形目中花鲈（Lateolabraxmaculatus）的亲缘关系最近，分别达95%和91%。2、金钱鱼类

5、IGF基因的时空表达在所检测的11种组织中，IGF-1mRNA在雌、雄金钱鱼肝脏中高表达，而IGF-2mRNA在雌、雄金钱鱼所有组织中均有表达；在胚胎发育各个发育阶段均能检测到IGF-1mRNA表达，且随胚胎发育表达水平持续上升，而IGF-2mRNA在受精后至囊胚期表达极低，原肠胚和神经胚期表达上调，眼囊形成期表达开始下调。雌、雄鱼肝脏中IGF-1表达随性腺成熟逐渐升高，而IGF-2mRNA的表达呈相反趋势。3、腹腔注射E2对金钱鱼GH/IGFmRNA表达的影响腹腔注射4ug/g体重E26h后，雌性

6、金钱鱼垂体GHmRNA的表达显著上调，但I对雄鱼GHmRNA的表达无显著影响；雌鱼IGF-1mRNA显著上调，而IGF-2mRNA显著下调，雄鱼肝脏中IGFsmRNA均显著上调。4、E2离体孵育对肝脏IGFs、ERs和GHRsmRNA表达的影响不同剂量的（0.1、1和10μM）E2离体孵育金钱鱼肝脏碎片6h，发现E2以明显剂量依存效应显著促进雌鱼IGF-1和ERα，抑制IGF-2和ERβ1mRNA的表达，而对ERβ2和GHRsmRNA的表达无显著影响；在雄鱼，E2以明显剂量依存效应显著促进IGFs，

7、ERα，抑制ERβ1mRNA的表达，但对ERβ2和GHRsmRNA无显著影响。5、雌激素受体拮抗剂离体孵育对肝脏IGFs、ERs和GHRsmRNA表达的影响广谱型雌激素受体拮抗剂Fulvestrent能明显抑制雌、雄鱼肝脏中IGFs和ERsmRNA的表达（P<0.05），对GHRs无显著作用。α型雌激素受体拮抗剂MPP显著抑制雌鱼肝脏中IGF-1和ERα、促进IGF-2和ERβ1mRNA的表达（P<0.05），抑制雄鱼IGFs和ERα、促进ERβ1mRNA的表达。β型雌激素受体拮抗剂PHTPP抑制雌

8、鱼肝脏中IGFs和ERβ，促进ERαmRNA的表达，但促进雄鱼IGF-2和ERαmRNA的表达，抑制IGF-1和ERβmRNA的表达。结果表明，IGF-1、IGF-2在金钱鱼生长、胚胎发育及性腺发育中发挥重要作用。E2可通过GH/IGF轴调控IGF的表达，也可通过ER调控IGF的表达。此外，E2对雌、雄鱼IGF-1的调控作用通过ERα和ERβ共同介导，而E2对雌、雄鱼IGF-2的调控通过不同通路，雌鱼通过ERβ1介导，而雄鱼通过ERα介导。关键词：金钱鱼；IGF；雌二