鲤胰岛素样生长因子的克隆与表达研究

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1、华中农业大学硕士学位论文鲤胰岛素样生长因子的克隆与表达研究姓名：商汉桥申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：龙良启20070601华中农业大学2007届硕士学位论文摘要胰岛素样生长因子(Insulin．1ikegrowthfactors，IGFs)，包括IGF．I和IGF．II，是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的单链多肽。可促进细胞的增殖、分化、迁移、生长和代谢。研究表明，IGFs在鱼类生长、繁殖、发育、渗透压调节及免疫等方面具有重要的作用。但由于血清中1GFs含量较低且与IGF结合蛋白结

2、合存在，因此提取有活性的天然lGFs蛋白较困难。为了获得足量的、具有生物学活性的重组鱼类IGFs蛋白，以利于鱼类IGF系统的基础和应用研究的不断深入，本研究在克隆鲤IGF．I和IGF．II的基础上，运用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统对鲤IGF-I和IGF．II的基因工程表达进行了研究。1．运用R1：PCR技术，从鲤肝脏总RNA中扩增出IGF-I成熟肽cDNA序列，IGF-II前肽cDNA序列，连接至pMDl8-T载体，测序结果表明，与已报道的序列相比，克隆的鲤IGF．I与其完全相同，IGF

3、．II基因有1个位点发生同义突变。2．构建原核表达载体pGEX-KG．IGF-Im和pET．32a-IGF．Ilm，重组质粒转化大肠杆菌BI．,21并进行LPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳分析，重组菌可表达分子量分别约为34kDa和28I①a的重组蛋白，且目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经0．3retool／LIPTG诱导3h后，表达量均出现最高，占菌体总量的300／o--35％。提取包涵体，并进行SKL变性及透析复性处理，由此初步纯化了原核重组蛋白IGFs。3．以初步纯化的原核重组蛋白IGF．I

4、和IGF．II为抗原，分别免疫新西兰大耳兔，制备了兔抗鲤IGF-I／IGF．II抗血清。抗血清经间接ELlSA检测效价分别为3200．}416400，Western-blot显示抗血清均能与重组蛋白发生特异性反应。4．构建酵母表达载体pPIC9K-IGF-Im，LiCI法转化巴新德毕赤酵母菌．经表型分析、(3418筛选及PCR鉴定，得至；JHis+Mut+型抗2．0mg／mLG418的多拷贝转化子。以o．5％甲醇诱导培养，Dot-Blot及THcine．SDS．PAGE电泳显示培养上清含大小约7。5k

5、Da的重组IGF-I蛋白，在诱导3d后，表达量最高。Western-blot分析表明，此真核表达蛋白能与兔抗IGF．1多克隆抗体发生特异性免疫反应。关键词：鲤；胰岛素样生长因子；基因克隆；大肠杆菌；巴斯德毕赤酵母；基因表达；多克隆抗体鲤胰岛素样生长因子的克隆与表达研究AbstractInsulin-likegrowthfactors(IGFs)，includingIGF·IandIGF-II，aresingle-chainpolypeptidehormones，whichpossessbiologic

6、alactivityofgrowthstimulatingactivityandhassimilarmetabolicfunctionsofinsulin．Atthecellularlevel．1GFScouldstimulatecellproliferation,differentiation，migration,metabolism，ere．ManystudiesshowthatIGFsplayveryimportantregulatedrolesinthedevelopment,growth,r

7、eproduction,osmoregulationandimmuneoffishes．BecausetheconcentrationofIGFsintheextraceUularenvironmentislowandmostofIOFsaleboundtoIGF-bindingproteins，obtainingsufficientfishIGFsisverydifficult．Inordertogetsufficientquantityofbiologicallyactive#seineIGFs,

8、ThisresearchstudiedthegeneticengineeringexpressionofIGFsintheE．coliandP．pastorisexpressionsystemsatthebaseofcloningCommoncarpIGF-IandIGF—lI．Whathavebeendoneinthisresearchwillbeusefullforthecontinualprogressofbasicandapplicationre