军曹鱼类胰岛素生长因子-i的克隆、表达及其原核表达载体构建

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1、分类号：S963.73密级：公开UDC：639.3学号：2111201137广瘃海洋太#,■,.、-**-•_--硕士学位论文军曹鱼类胰岛素生长因子-I的克隆、表达及其原核表达载体构建常会婦指导教师：谭北平教授"*/>»■-串请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产经济动物营养与饲料学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月军曹鱼类胰岛素生长因子-I的克隆、表达及其原核表达载体构建摘要本论文以军曹鱼为研究对象，采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR

2、），成功克隆了军曹鱼类胰岛素生长因子-I（Insulin-likeGrowthsFactors-I，IGF-I）基因序列，并对该基因序列进行生物信息学分析和功能鉴定，同时研究了不同饲料糖水平对军曹鱼IGF-I基因组织特异性表达的影响，进而通过质粒重组技术构建了军曹鱼IGF-I体外原核表达系统，并成功获得重组蛋白，为深入研究IGF-I基因对军曹鱼的成长和代谢调控，提供了坚实的理论基础和科学依据。实验结果如下：1.军曹鱼类胰岛素生长生长因子-I（IGF-I）cDNA克隆和序列分析根据已经克隆出的鲈形

3、目鱼类IGF-I基因序列设计简并引物，采用PCR技术成功克隆了军曹鱼类胰岛素生长因子-I序列。其cDNA序列长558bp，编码185个氨基酸，其中信号肽含有44个氨基酸，成熟肽含有67个氨基酸，IGF-ImRNA属于Ea-4亚型。预测分子量为8.58kDa，理论等电点为7.4。同源氨基酸序列比对分析发现，军曹鱼IGF-I成熟肽结构和人类一样，都包括B、C、A、D区，其中B区和A区保守性较高，C区和D区保守性较差。军曹鱼IGF-I基因与人类的同源性高达74%，与黄鳍棘鲷的同源性高达99%。采用泊松

4、校正法构建的IGF-I系统进化树表明，军曹鱼IGF-I跟海洋鱼类亲缘性较近，跟淡水鱼类和无脊椎动物亲缘性较远。通过实时荧光定量PCR（RealTimePCR，RT-PCR）方法，检测分析IGF-I基因在军曹鱼5个组织中的表达情况，结果发现IGF-I基因在军曹鱼肝脏中表达量最高，在其他组织较低。2.军曹鱼类胰岛素生长因子-I原核表达系统构建根据分析得到的军曹鱼IGF-I成熟肽序列设计引物，克隆得到军曹鱼IGF-I成熟肽，采用pEASY无缝克隆技术将其克隆到pEASY载体上构建pEASY-IGF-I

5、重组质粒，测序正确后，插入表达载体pET-21a，转化到表达菌株Rosetta（DE3）pLysS中进行表达，经IPTG诱导后，表达菌液产生重组蛋白。通过SDS-PAGE检测发现其为分子量为8.6kDa的蛋白条带，经过westernblot检测后发现目的蛋白与His抗体特异性结合，表明目的基因IGF-I在大肠杆菌中成功表达。产物以包涵体形式存在，可溶性较差，通过盐酸胍变性，His-Tag纯化和醋酸钠洗脱复性得到可溶性体外重组的目的蛋白。3.军曹鱼进食不同糖水平饲料对IGF-I基因组织表达的影响I

6、以糊精为糖源设置三种不同糖水平的饲料饲喂军曹鱼，养殖八周后通过实时荧光定量PCR技术检测IGF-I在各组织中的表达情况，结果发现在中糖组（21%，M），肝脏中IGF-I的表达量是肠道的13倍左右，而低糖组（7%，L）和高糖组（35%，H）的表达量分别是肠道的75倍和470倍，可以得出饲料中糖含量的过高和过低都能影响IGF-I基因在肝脏中的正常表达。关键字：军曹鱼；类胰岛素生长因子；分子克隆；原核表达；蛋白纯化IIClongingandexpressionanalysisofinsulin-lik

7、egrowthfactorIintissueofcobia（Rachycentroncanadum）andexpressioninEscherichiacolisystemAbstractInthisstudy,wesuccessfullyclonedtheinsulin-likegrowthfactorI（IGF-I）cDNAssequenceinthecobiaRachycentroncanadum,byusingPolymeraseChainReaction（PCR）techniques.

8、ThecDNAsequencewasanalysedbyusingbioiformaticssoftware,suchasBLAST,MEGA.Atthesametime,wealsoanalysedtheexpressionofIGF-Iindifferenttissuesthoughtquantitativereal-timePCRmethods.AnE.colisystemwasthenconstructedbasedonthematuredpeptideofIGF-Itoattainth