中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cdna克隆及其原核表达载体构建

《中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cdna克隆及其原核表达载体构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中国林蛙抗菌肽分离鉴定、cDNA克隆及其原核表达载体的构建中文摘要背景与目的；抗菌肽(antibacterialpeptides)又叫抗微生物肽(antimicrobialpeptides)，肽抗生素(peptideantibiotics)，是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系统的重要组成部分。两栖动物皮肤裸露、潮湿，这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。但在长期的自然选择过程中，它们逐渐形成了防御机制，即由背部及腹部皮肤的分泌抗菌类物质来抵御有害环境因子的侵袭。蛙类皮肤生物活性肽是抗菌肽家族的重要成员，其不但种类繁多，而且数

2、量庞大。通过结构与同源性分析表明这些抗菌肽属于Magainin、Bombinin、Bombinin-like、Brevinin，Esculentin、Rmmmerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin等抗菌肽家族。两栖类抗菌肽具有高效、广谱的抗菌作用，且不易产生耐药性等特点，其这些特性激起了人们极大的兴趣，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，抗菌肽有望成为新一代的临床抗菌药物。本研究已成功克隆中国林蛙抗菌肽基因全长cDNA序列，在GenBanK中进行登录(登录号：DQ673105)，并采用生物信息学的方法对核酸序列以及氨基酸序列进

3、行分析，进而对蛋白的结构和功能进行预测、分析，为中国林蛙抗菌肽分子生物学水平研究奠定了基础。同时，将编码成熟抗菌肽基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX-3X中，构建重组表达质粒进行IPTG诱导表达。方法：(1)利用反相高效液相色谱(reversephasehighperformanceliquidchromatographyRP—HPLC)和质谱(massspectromeU7)检测技术对中国林蛙皮肤分泌物中抗菌肽进行分离纯化和分析，并以革兰氏阴性菌大肠埃希氏杆菌(G．E．coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(G+S．aureus)为测试菌株，通过琼脂扩散法对分离出的多肽进行

4、抑菌活性测定。应用Edman降解法对有抑菌活性的多肽物质进行结构鉴定。(2)以N末端氨基酸测序结果(Mm依KsMLL)为递交序列，结合NcBI中blasm比对结果设计蛙属抗菌肽简并引物。(3)采用异硫氰酸胍法在无№的环境条件下制备中国林蛙皮肤组织总RNA．(4)以提取的中国林蛙皮肤总RNA。为模板，采用3’RACE(RapidAmplificationOfcDNAEnds)技术进行中国林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆，测序分析。同时，运用生物信息学软件对其全长eDNA序列进行阅读框架、同源性比较和相关的生物学功能分析。(5)根据eDNA克隆所获得的中国林蛙抗菌肽基因中编码成熟肽的序

5、列设计合成引物，以全长eDNA序列为模板，通过PCR扩增，获得带有限制性酶切位点的目的片段。(6)采用T／A克隆法将目的序列插,入pNIDl8-Tsimple克隆载体，测序，正确后将酶切的目的序列亚克隆至经相应限制性内切酶消化处理的原核表达载体pGEX-3X上，构建原核重组表达载体。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，用彤I．G进行诱导表达，采用SDS-PAGE电泳进行分析检测。结果：(1)应用RACE技术成功的获得了一条中国林蛙抗菌肽基因的全长cDNA序列。序列全长为297bp，其中包括213bp完整的开放阅读框(openreadingframeORF)，含有8

6、4bp的3’非转译区(3’UTR)，推测编码71个氨基酸的多肽，分子量(MW)为7810．9Da，等电点(pI)为5．08。经生物信息学分析表明，中国林蛙CAMPs-3氨基酸序列N末端均含有一个相对保守的由22个氨基酸组成的信号肽(signlepeptide)序列，还包含有一个拷贝由个33氨基酸组成的成熟肽(maturepeptide)，在信号肽和成熟体之间，是一段富含酸性氨基酸的酸性间隔序列(acidicspacerdomain)。经同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，该序列已被GcnBanK收录，登录号为DQ673105．(2)将编码成熟肽的目的序列亚克

7、隆至pMDIS-Tsimple克隆载体中，经测序显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。将酶切后的目的序列插入PGEX-3X原核表达载体中构建重组表达质粒pGEX-chensirin-3，经IPTG诱导后。表达出相对分子质量为30kDa的GST融合蛋白．结论：(1)从中国林蛙皮肤组织中分离出一条新的编码抗茵肽前体CAMPs·3的全长cDNA序列，经NCBI网站中的blastp服务器分析发现与ranamefin和brevinin家族抗菌肽具有较高的同源性，分别为90％-72％，70％-53％。