黑斑蛙胰岛素样生长因子―2原核表达载体构建

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1、黑斑蛙胰岛素样生长因子―2原核表达载体构建　　摘要：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子，在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达，本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列，设计引物扩增IGF-2的完整基因，获得了全长为944bp、ORF长为651bp的序列；随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到pET-32a（+）质粒中，构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。

2、　　关键词：黑斑蛙；胰岛素样生长因子-2；表达载体构建　　中图分类号：S855.1文献标识码：B文章编号：1007-273X（2016）08-0005-02　　胰岛素样生长因子-2（insulin-likegrowthfactorsⅡ，IGF-2），又称生长调节素A，是一个单链多肽分子，与胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactorsⅠ，IGF-1）在氨基酸组成上具有同源性，并且二者都与胰岛素原（proinsulin）具有同源性[1]，故此得名。IGF-2是一个在细胞增殖、分化、程序性细胞死亡和

3、转化中具有重要作用的因子，对个体生长、发育具有重要作用[2]。　　黑斑蛙（Rananigromaculata）俗称“青蛙”、“田鸡”；隶属于两栖纲、无尾目、蛙科；是我国分布最广的两栖动物之一，也具有较高的商业价值[3]。主要生活于海拔10005m以下的平原丘陵地区，多栖息于稻田、菜园、池塘、山沟等地；对环境适应性极强。本研究以黑斑蛙为研究对象，对黑斑蛙IGF-2基因进行克隆并构建原核表达载体，为下一步获得其表达产物及生物学功能鉴定提供参考。　　1材料与方法　　1.1材料　　黑斑蛙生长在重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究

4、中心的流水养殖系统中，挑选健康的成蛙，采用双毁髓法处死后取其肝脏组织，立即放入液氮中保存。　　Trizol购自上海生工，Taq酶、pGEM-T质粒购自Promega公司，高纯质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收及纯化试剂盒购自博迈德生物公司，感受态BL21（DE3）购自北京天根生化有限公司，XhoⅠ、BamHI购自大连宝生物公司，酵母提取物、蛋白胨、Agar购自OXOID公司，pET-32a（+）由本室保存备用。氨苄青霉素50mg/mL为本室自己保存备用。　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成根据转录组数据库中I

5、GF-2序列的保守区，利用Primer5.0软件，设计一对特异性扩增引物（上游引物：5′-GCAACATCCAGC　　AATACCACAGACGA-3′，下游引物：5′-CTTTGGTG　　TCTCAGTTTGCTCGTTT-3′）。引物并交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。　　1.2.2cDNA制备5取液氮中保存的黑斑蛙肝脏。根据Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取，并利用Promega公司的cDNA合成试剂盒说明书完成cDNA的制备。　　1.2.3PCR扩增利用高保真DNATaq酶进行PCR扩增，产物经1%琼

6、脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒进行回收。阳性产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。　　1.2.4IGF-2亚克隆引物设计为了使IGF-2与pET-32a（+）质粒相连，在IGF-2片段上、下游引物分别引入BamHI和XhoI等限制性内切酶的识别位点并设计特异性引物（上游引物：5′-CGCGGATCC　　ATGGAGCAACTAAGATGCAAAACCA-3′；下游引物：5′-GGCGAGCTCTCAATTATGGGAGGACTCTGAGTCT-3′）。引物交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。　　1.2.5表达载

7、体的构建对1.2.3中获得的IGF-2全基因片段用高保真DNATaq酶进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收及纯化试剂盒回收，用BamHI和XhoI对扩增的IGF-2片段与pET-32a（+）质粒分别进行双酶切，酶切产物使用T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌BL21（DE）。阳性重组子用高纯质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定；酶切结果送苏州金唯智生物科技有限公司测序鉴定。　　2结果　　2.1IGF-2全基因序列克隆结果　　从黑斑蛙肝脏cDNA中克隆到约950bp大小的基因片段，与

8、预期产物一致，电泳结果见图1。该片段包含IGF-2基因全序列，包含651bp的完整ORF。5　　2.2IGF-2原核表达载体构建结果　　由图2可知，提取的阳性重组质粒子经BamHI和XhoI双酶切后，出现约700bp和5900bp的片段，与预期结果一致。　　3讨论　　动物GH/IGF轴相关激素的效应对于机体生长发育具有至关重要的作