核基质结合区（mar）调控胰岛素样生长因子-1表达载体构建和转化甘蓝的研究

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1、摘要胰岛素样生民因子一1(IGF-1)是由70个氨基酸组成的单链多肽，主要由肝脏分泌。人封研究表明。IGF．1是一种多功能细胞增殖和调控因子，具有广泛的生物学功能，介导生睦激素对细胞分裂和代∞捕g大部分作用。人体的几乎所有细胞都受]GF-1的影响，尤其是肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞、心脏细胞、肾细胞、神经细胞、皮肤细胞和肺细胞。近年来IGF-1已j{=『T治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合征、侏儒症、某些神经系统疾病和某些顽症．临床效果令人鼓舞。由于IGF-1在人和动物体内含攀非常坻，靠分离天然物质无法满足基础研究和临床利削需要，因此，通过重组DNA技术生产具有生物活性的IGF-1就成为一种必

2、然。IGF-1已在细卣和酵母表达系统中得到表达，但在这两种系统中，大多数重组蛋白不能正确折叠，常常以无活性的包涵体形式聚集。转基因动物和哺乳动物细胞培养体系也存在一些不利的因子，如存在人畜共患病传染的危险、表达产物妨碍宿主正常生长等。植物是一种IGF-I潜在的表达系统，它有可能用手重组IGF-I的规模化生产，但这方面的研究工作刚开始起步。本项目根据甘蓝(Brassicaoleraceavat．capitataL)基因密码偏爱性，对IGF-1基因DNA序列进行了修改，根据优化的序列，人工半合成了该基因。同时从烟草(NicotianambacumL)和甘蓝中各克隆了一段MAR分子，通过转

3、基因测定分析，两段MARs均能显著提高转基因表达水平，因此，被用于构建IGF．1高效植物表达载体，并首次将IGF-1基因导入甘蓝，成功获得了IGF-1转基因甘蓝新材料。为将甘蓝开发成一种具有治疗作用的药用蔬菜开辟了道路。研究工作主要包括以下几个方面：-1核基质结合区(Matrixattachmentregions,MARs)的分离核基质结合区(MAR)是能将染色质固定在核基质上(即能与核基质特异性结合)的一段DNA序列，长度通常为300-1000bp，广泛分布于真核生物基因组中．并将真核基因组在结构平¨功能上分成相对独立的loop单位。MAR不仅使染色质形成了环形结构，还能作为DNA

4、复制的起点，并能调节真核细胞中的基因表达。由于MAR在转基因动植物中能消除转基因沉默，提高转基因的表达水平，近年米已引起了人们极火的关注。本实验采用CrAB法提取了烟草和甘篮基因组DNA。根据报道的烟草MAR序列，设计引物P19?2，为便丁表达载体构建，在引物P1的5，端引入了HindlII-EcoRI酶切位点，通过PCR方法克隆这段MAR分子。为了比较不同来源MARs对转基因表达的影峒，根据油菜基因组中短散布元件(SINE)序列设计了引物P3／P4，引物P3的5’端添加了EcoRI-HindlII酶切位点，PCR方法分离该MAR片段。序列测定结果表明，来自烟草的MAR睦度为688b

5、p，AT含量为731％，而甘蓝MARK度为527bp，AT含量为74．8％，两段序列均舍有“90％ATbox”及其它MAR的特征基序。●2GUS表达载体的构建为r分析和比较不同米源的MARs对转基阏表达的效果，本实验构建了以CaMV35S为西南农业太学博士学位论文启动子tT-NOS为终jt子，携带了MAR的和不携带MAR的GUS表达载体。构建过程中亢J=IjHindlII／EcoRI消化质粒pBll21。切下表达盒，插入pBINPLUS的HindlII／EcoRI位点．得到新的植物表达载体pBGUS。通过单酶切，依次将烟草MAR插入pBGUS表达盒两侧的EcoRI位点和砌dIII位点

6、，每次连接之前载体先进行去磷酸化处理，以防自连环化。设计P-35S的F游引物(Pp)和T-NOS的上游引物(Pt)，插入MARs后用PCR方法鉴定其方向，选择MARs成顺式重复的转化子，经酶切和PCR鉴定为阳性克隆后，得到新的植物表达载体，命名为pBMGUSMl(MAR·P35S．GUS．TNOS-MAR)。用同样的方法，依次将甘蓝MAR插入pBGUS表达盒两端的Hindtll值点和EcoRl位点．选择MARs方向相同的重组质粒，酶切和PCR检测为掏】性的，命名为pBMOUSM2。3GUS转基因烟草的获得及活性测定为检测和比较不同MARs对转基因植株中转基因表达的效果．将所构建的携带

7、MAR和没携带MAR的3个GUS表达载体，用农杆菌介导的叶盘法转化烟草。在MS+2．5m∥LBA+0．5mg／LIAA+IOOmg／LIon．+250mg／LCb．上筛选培养，形成不定芽后转到相同的筛选培养基上再次进行筛选．淘汰掉少数述逸筛选的不定芽。为保证所获得的植株都是独立的转化体，每个外植体上只取一个芽。所获得的转化苗在MS附加lOOmg／Lkan．的培养基中生根。按照Jefferson方法，以四甲基伞形酮p．D-葡萄糖苷酸作底物，荧光分光光度计定量