衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达

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1、衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达：任文君,王群义,吕小凤,毛泽斌,蒋晓刚【摘要】目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP3上游包括5′UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段;将各片段用EffecteneTransfectionReagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性

2、的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中IGFBP3基因的表达升高;在IGFBP3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5′ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3′是IGFBP3的增强子元件。结论:在衰老的2BS细胞中IGFBP3基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件IEE(IGFBP3enhancerelement),对IGFBP3的表达起到调控作用。【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白3;IEE(IG

3、FBP3enhancerelement);2BS细胞［Abstract］AIM:TostudytheinfluencingfactorsoftheincreasedexpressionofthecontrollinginsulingroanIGFBP3upstreamsequenceincludingtheseriesofthe5′UTRareaplifiedbyPCR,andfourgroupsofIGFBP3promoterfragmentsofdifferentlengthsedigestion.TheEffecteneTransfe

4、ctionReagent(Qiagen)kitentsintotheyoungandsenescentcells.Thepromotingactivityofseveralgroupsofconstructinggenefragmentsined.Theenhancerelementintheactivityareaposingtheoligonucleotidegelblockingexperiment.RESULTS:paredentsitefromsite+59to58oftheIGFBP3enhancer.5′ccagcctgcca

5、agcagcgtgccccggttgc3′entofIGFBP3.CONCLUSION:Inthe30bpfragmentfromsite37to8oftheIGFBP3geneupstream,thereisaneentIEE,ent);2BScells胰岛素样生长因子（insulingroacI,XhoI,SmaI,NheI,BglII,pGEMTEasy质粒,Corefootprintingsystemkit均购于Promega公司;RNA提取试剂盒RNeasytotalRNAkit和转染试剂盒EffecteneTransfec

6、tionReagent购于Qiagen公司;［γ32P］ATP购于北京福瑞公司;poly(dIdC)购于AmershamPharmaciaBiotech公司。1.2方法1.2.1Northernblot检测用RNeasytotalRNA试剂盒提取总RNA。DNA片段通过randomprimingkit(Promega,Madison,hybridizationsolution(Clontech)进行杂交,放射自显影。1.2.2IGFBP3基因5′调控区片段的构建用高保真Taq酶扩增出人类IGFBP3上游包括5′UTR区的2kb的序列。上游引

7、物是:5′GCTAGCACCTGGGACCTCAAGAATTGCATTT3′,（5′端加入了NheI酶切位点）;下游引物是:5′AGATCTCGGAGCAGCACCAGCAGAGTCAG3′,（5′端加入了BglII切位点）。将扩增片段转化到pGEMTEasy质粒当中(Promega),并进一步转化到pGL3Basic质粒中,用限制性内切酶从5′端对片段进行酶切,酶切位点分别在-1303（SacII）、-778（PmacI）、-305（XhoI）、-141（SmaI）,这样用SacII/NheI、PmacI/NheI、XhoI/NheI和S

8、maI/NheI酶切得到四组不同长短的IGFBP3启动子片段。将酶切后的质粒用T4DNA酶进行酶切,并用T4连接酶连接,将连接好的几组