衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达

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1、衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达任文君,王群义,吕小凤,毛泽斌,蒋晓刚【摘要】　　目的:研究在衰老细胞中调控胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）表达增加的影响因素。方法:用Northernblot的方法显示IGFBP3基因的表达在年轻和衰老的2BS细胞中存在差异;PCR扩增出人类IGFBP3上游包括5＇UTR区的2kb的序列并用酶切得到4组不同长短的IGFBP3启动子片段;将各片段用EffecteneTransfectionReagent试剂盒转染到年轻和衰老细胞中,测出几组构建基因片段的启动活性,确定可调控转录活性的区域;通过重叠寡核苷酸凝胶阻滞

2、实验确定在该活性区域中的增强子元件。结果:与年轻的2BS细胞相比,衰老的2BS细胞中IGFBP3基因的表达升高;在IGFBP3启动子+59到-58序列之间存在着蛋白结合位点;5＇ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3＇是IGFBP3的增强子元件。结论:在衰老的2BS细胞中IGFBP3基因上游-37到-8的30bp序列存在一个新的增强子元件IEE(IGFBP3enhancerelement),对IGFBP3的表达起到调控作用。【关键词】胰岛素样生长因子结合蛋白3;IEE(IGFBP3enhancerelement);2BS细胞　　〔Abs

3、tract〕AIM:TostudytheinfluencingfactorsoftheincreasedexpressionofthecontrollinginsulingroanIGFBP3upstreamsequenceincludingtheseriesofthe5＇UTRareaplifiedbyPCR,andfourgroupsofIGFBP3promoterfragmentsofdifferentlengthsedigestion.TheEffecteneTransfectionReagent(Qiagen)kitentsintotheyoungandsenesc

4、entcells.Thepromotingactivityofseveralgroupsofconstructinggenefragmentsined.Theenhancerelementintheactivityareaposingtheoligonucleotidegelblockingexperiment.RESULTS:paredentsitefromsite+59to58oftheIGFBP3enhancer.5＇ccagcctgccaagcagcgtgccccggttgc3＇entofIGFBP3.CONCLUSION:Inthe30bpfragmentfr

5、omsite37to8oftheIGFBP3geneupstream,thereisaneentIEE,ent);2BScells　　胰岛素样生长因子（insulingroacI,XhoI,SmaI,NheI,BglII,pGEMTEasy质粒,Corefootprintingsystemkit均购于Promega公司;RNA提取试剂盒RNeasytotalRNAkit和转染试剂盒EffecteneTransfectionReagent购于Qiagen公司;〔γ32P〕ATP购于北京福瑞公司;poly(dIdC)购于AmershamPharmaciaBiotech公司

6、。　　1.2方法　　1.2.1Northernblot检测　　用RNeasytotalRNA试剂盒提取总RNA。DNA片段通过randomprimingkit(Promega,Madison,hybridizationsolution(Clontech)进行杂交,放射自显影。　　1.2.2IGFBP3基因5＇调控区片段的构建　　用高保真Taq酶扩增出人类IGFBP3上游包括5＇UTR区的2kb的序列。上游引物是:5＇GCTAGCACCTGGGACCTCAAGAATTGCATTT3＇,（5＇端加入了NheI酶切位点）;下游引物是:5＇AGATCTCGGAGCAGCACCAGCAG

7、AGTCAG3＇,（5＇端加入了BglII切位点）。将扩增片段转化到pGEMTEasy质粒当中(Promega),并进一步转化到pGL3Basic质粒中,用限制性内切酶从5＇端对片段进行酶切,酶切位点分别在-1303（SacII）、-778（PmacI）、-305（XhoI）、-141（SmaI）,这样用SacII/NheI、PmacI/NheI、XhoI/NheI和SmaI/NheI酶切得到四组不同长短的IGFBP3启动子片段。将酶切后的质粒用T4DNA酶进行酶切,并用