中药何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子ⅰ及胰岛素样生长因子结合蛋白3表达的影响

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中药何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ及胰岛素样生长因子结合蛋白3表达的影响【摘要】目的探讨何首乌饮抗大鼠卵巢组织衰老的机理，为抗女性性腺的衰老研究提供理论指导和实验依据。方法将60只SD大鼠随机分为3组：正常组、模型组、预防组。采用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型，预防组在造模的同时以中药方剂何首乌饮灌胃。应用原位杂交方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）蛋白的表达，用RT-PCR方法检测各组大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）基因的表达情况。结果何首乌饮明显抑制了衰老大鼠卵巢组织中IGFBP3基因表达的上调趋势（P＜0.05），且明显提高了衰老大鼠卵巢组织中IGF-Ⅰ蛋白的表达（P＜0.05）。结论何首乌饮通过影响衰老大鼠卵巢中细胞因子IGF-Ⅰ 、IGFBP3的表达，起到抗大鼠性腺衰老的作用。【关键词】何首乌饮；衰老；大鼠；胰岛素样生长因子Ⅰ；胰岛素样生长因子结合蛋白3；RT-PCR；原位杂交EffectofTraditionalChineseMedicineHeshouwuyinontheExpressionofIGF-1andIGFBP3intheOvaryoftheAgingModelRatsZHANGNa,LIYali,GAOFulu1.DepartmentofReproductiveMedicine,TheForthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,050011,China;2.ThePeople'sHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang,050071,China;3.HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050017,ChinaAbstract：ObjectiveTostudythemechanismoftraditionalChinesemedicineHeshouwuyin(HSWY)inanti-agingoftheagingmodelratovary,soastoprovidetheoreticalandexperimentalevidencetoanti-aginginthefemalesexualgland.Methods60ratsweredividedintothreegroupsatrandom:normalgroup,agingmodelgroup,treatmentgroup.Theratsintreatmentgroupwereredividedintofourgroups:HSWYlowdosagegroup,HSWYmiddledosagegroup,HSWYhighdosagegroupandHeshouwan(HSWW)group.Thesub-acuteagingmodelratswereinducedbyD-galactose,andtherats intreatmentgroupwereadministeredintragastricaugwithHSWYandHSWW.Thegeneexpressionofinsulingrowthfactorbandingprotein3(IGFBP3)inovaryofeachgroupwasdetectedreversetranscriptionpolymerasechainreaction,andtheproteinexpressionofinsulingrowthfactor-1(IGF-1)wasexaminedbythemethodofin-situhybridization.　ResultsThegeneexpressionofIGFBP3wasup-regulatedandtheproteinexpressionofIGF-1wereinhibitedinovariesofagingrats.HSWYsignificantlysuppressedthegeneexpressionofIGFBP3(P＜0.01)andincreasedtheproteinexpressionofIGF-1(P＜0.01).　ConclusionHSWYhasanti-agingeffectonratsexualglandthroughregalatingtheexpressionofcytokinessuchasIGF-1andIGFBP3inovary.Keywords：Heshouwuyin(HSWY);Aging;Rats;IGF-Ⅰ;IGFBP3;RT-PCR;In-situhybridization 围绝经期是妇女从性成熟期过渡到老年期的一个必经的生理过程。在这一时期，卵巢机能活动的衰减是最为直接的表现。如何延缓卵巢的衰老，提高围绝经期妇女的生活质量已成为研究热点。传统中医学认为肾虚是衰老的主要原因。何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本研究应用D-半乳糖连续腹腔注射法制造雌性大鼠亚急性衰老模型，以大鼠卵巢为研究对象，应用原位杂交、RT-PCR方法检测并分析应用何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）表达的影响，探讨何首乌饮在细胞因子水平抗大鼠卵巢衰老的作用机制。1材料与方法1.1动物选用8周龄清洁级SD雌性大鼠（由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号605106）60只，随机分为正常组、模型组、预防组。预防组又分为何首乌饮低剂量组、何首乌饮中剂量组、何首乌饮高剂量组、何首乌丸组。每组动物各10只。1.2药物　何首乌饮组成：何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓，各药用量比例为3∶2∶3∶2∶5∶3。何首乌丸组成：何首乌、肉苁蓉、怀牛膝，各药用量比例为3∶2∶3。两药分别加5倍蒸馏水浸泡2h，文火煮沸30min，滤过。药渣再加3倍量水继续煎煮20min，滤过。两次滤液混和，水浴浓缩至520ml，4℃低温保存备用。所制的何首乌丸含生药1.1kg/L，低剂量何首乌饮含生药2.4kg/L，中剂量何首乌饮含生药4.8kg/L，高剂量何首乌饮含生药9.6kg/L。1.3模型的建立及各组动物的处理 用生理盐水将D-半乳糖配成6%的溶液，按300mg/(kg.d)进行腹腔注射，连续用药60d，从而建立亚急性衰老大鼠模型。预防组在腹腔注射D-半乳糖的同时给药何首乌饮或何首乌丸，每组均按4ml/(kg.d)灌胃给药，连续用药60d。同期正常组腹腔注射以及灌胃同量的生理盐水，1次/d。1.4标本的采集及处理连续用药60d后，每组随机抽取5只大鼠，在3%戊巴比妥麻醉下开胸，经左心室快速灌注生理盐水250ml后，再灌注含0.1%DEPC的4%多聚甲醛250ml，1h内灌流完毕。然后取卵巢，再以含0.1%DEPC的4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，以备用作原位杂交检测。余下5只大鼠以断颈法处死，迅速取出卵巢组织，置于液氮中保存备用。1.5原位杂交（in-situhybridization）1.5.1IGF-Ⅰ探针合成序列由天津灏洋生物制品科技有限公司提供。上游引物5'-GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC3'下游引物5'GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC3'1.5.2检测方法石蜡包块连续切片，切片脱蜡至水，置打孔液中室温10min，使探针快速穿透细胞膜。0.1MPBS冲洗，3次。3.3%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5min灭活内源性酶。0.1MPBS冲洗，3次。暴露mRNA核酸片断：切片上滴加复合消化工作液，37℃消化20min，0.1MPBS冲洗，3次，室温0.2×SSC洗涤3min，1次。后固定：含有1∶1000DEPC的1%多聚甲醛室温固定10min，蒸馏水冲洗3次。预杂交：每张切片加预杂交液20μl，恒温37℃1.5h。室温0.2×SSC洗涤5min，3次。杂交：每张切片加杂交液20μl，恒温37℃杂交3h。杂交后洗涤：37℃2×SSC洗涤5min，3次，37℃0.2×SSC洗涤5min，3次，37℃0.1molTBS洗涤5min，4次。滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃45min，0.1MPBS冲洗5min，3次。滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，37℃45min，0.1MPBS冲洗5min，3次。DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。1.5.3结果判定以PBS替代一抗作为阴性对照，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性结果。每组选5只动物的组织，每个标本取3张切片，光镜下放大400×，随机选取组织结构比较完整的部位，通过光学显微镜和Motic6.0数据医学图像分析系统测定每张切片中10个视野阳性细胞的平均光密度（MOD）值，并计算其平均值，代表IGF-ⅠmRNA的表达。1.6RT-PCR1.6.1 卵巢组织总RNA的提取将卵巢组织从液氮中取出，剪碎后置匀浆套管中，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度。1.6.2引物的设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，见表1。表1RT-PCR分析的引物（略）1.6.3PCR过程以总RNA为模板，以Oligo(dT)16为引物，按反转录酶AMV（Promega）说明书反转录合成cDNA。以cDNA为模板，加入IGFBP3cDNA上、下游引物，以β-actin为内参照，进行PCR。PCR扩增反应体系：取5μl反转录产物作为PCR反应模板，依次加入dNTPs混合物（终浓度0.2mmol/L），MgCl22.5mmol/L，上、下游引物（终浓度50pmol/L），10×PCR缓冲液2.5μl，TaqDNA聚合酶2U，加无菌去离子水至总体积25μl，置PCR仪上进行扩增。设定反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸7min。最后取10μlPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，运用凝胶成像系统对条带进行吸光光度值分析。以IGFBP3/β-actin平均吸光度比值分别表示IGFBP3的mRNA水平，进行半定量分析。1.7统计学处理实验结果采用±s表示，组间资料应用多因素方差分析，各项统计均用SPSS11.5软件在计算机上完成。2结果 2.1原位杂交结果IGF-ⅠmRNA阳性细胞主要为卵巢泡膜细胞、间质细胞和黄体细胞，颗粒细胞未见IGF-ⅠmRNA的表达。与正常大鼠相比，衰老模型大鼠卵巢组织中IGF-ⅠmRNA表达明显降低（P＜0.01），给予不同剂量的何首乌饮及何首乌丸预处理后，IGF-ⅠmRNA表达显著升高（P＜0.01），预防组间未见明显差异（P＞0.05）（图1及表2）。表2IGF-ⅠmRNA在大鼠卵巢组织中表达水平的分析结果（略）2.2PCR结果衰老模型大鼠卵巢组织IGFBP3基因表达上调，在正常组大鼠卵巢组织中，IGFBP3表达较低，D-半乳糖造模后，IGFBP3表达明显升高（P＜0.01）；而给予不同剂量的何首乌饮和何首乌丸预处理后，与模型组相比，IGFBP3基因表达均明显降低（P＜0.05）（图2及表3）表3IGFBP3基因mRNA在大鼠卵巢组织中转录水平的分析结果（略）3讨论 祖国医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因。肾为先天之本，肾藏精，其精气是构成人体和促进人体生长发育的基本物质，所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。本研究所用何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年，于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主，起到补肾益髓等功效。IGF-Ⅰ是卵巢局部调节系统中重要的生长因子［1，2］，以自分泌、旁分泌形式参与调节卵泡膜细胞和颗粒细胞的下列功能：DNA合成、甾体激素生成、芳香化酶活性、LH受体生成和抑制素分泌等。在人卵巢细胞中，IGF-Ⅰ和FSH共同促进蛋白质和甾体激素生成。IGF-Ⅰ增强促性腺激素的作用，并协调卵泡膜细胞和颗粒细胞的功能。IGF-Ⅰ与FSH的协同作用，强烈地促进排卵前卵泡的芳香化酶活性，从而明显促进雌激素的生成。有资料证实IGFBP可能作为IGF的抑制剂与卵泡发育受阻有关［3］。IGFBP-3不仅通过内分泌更主要是通过自分泌和旁分泌方式对卵泡的形成及发育起着重要作用。Wang等［4］发现卵泡液中IGFBP-3浓度在健康卵泡发育中逐渐下降，与Amato［5］研究结果一致，他们发现卵巢功能正常者自然周期晚卵泡期血清IGFBP-3水平明显低于早卵泡期水平，超促排卵治疗后血清IGFBP-3水平也明显低于治疗前水平。有研究显示，增龄及卵巢去势均可使血液中IGF-Ⅰ浓度降低［6，7］。本研究原位杂交结果显示，IGF-ⅠmRNA在衰老大鼠卵巢中表达减弱，这与先前学者研究相一致，衰老使IGF-Ⅰ分泌减少。应用何首乌饮增加了大鼠卵巢中IGF-ⅠmRNA的表达水平，起到抗卵巢衰老的作用。 本研究PCR结果显示，在衰老大鼠卵巢中IGFBP3的表达明显高于正常大鼠，说明在衰老大鼠卵巢中成熟卵泡发育减少。而预防性给予何首乌饮后，大鼠卵巢中IGFBP3的表达降低，由此推测，何首乌饮通过降低IGFBP3的水平，进而间接增加了IGF-Ⅰ的表达，使卵巢的功能恢复。而这与原位杂交结果相吻合，进一步说明何首乌饮同时对IGF-Ⅰ及其结合蛋白IGFBP3发挥作用，起到抗卵巢衰老的作用。【参考文献】［1］夏天,沈嵘,侯莉莉,等.补肾调冲方对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌及其IGF-1mRNA表达的影响［J］.辽宁中医杂志,2006，33(9):1084.［2］GintherOJ,BergfeltDR,BegMA,etal.Invivoeffectsofanintrafollicularinjectionofinsulin-likegrowthfactor1onthemechanismoffollicledeviationinheifersandmares［J］.BiolReprod,2004，70(1):99.［3］SpicerLJ.Proteolyticdegradationofinsulin-likegrowthfactorbindingproteinsbyovarianfollicles:acontrolmechanismforselectionofdominantfollicles［J］.BiolReprod，2004，70(5):1223.［4］WangTH,ChangCL,WuHM,etal.Insulin-likegrowth factor-II(IGF-II),IGF-bindingprotein-3(IGFBP-3),andIGFBP-4infollicularfluidareassociatedwithoocytematurationandembryodevelopment［J］.FertilSteril,2006，86(5):1392.［5］AmatoG,IzzoA,TuckerA,etal.Insulin-likegrowthfactorbindingprotein-3reductioninfollicularfluidinspontaneousandstimulatedcycles［J］.FertilSteril,1998，70(1):141.［6］GiovanniniS,MarzettiE,BorstSE,etal.ModulationofGH/IGF-1axis:Potentialstrategiestocounteractsarcopeniainolderadults［J］.MechAgeingDev,2008，129(10):593.［7］姜学明,凌泽喜.补肾健脾活血方对卵巢大鼠血清IGF-1的影响［J］.湖北中医杂志,2005,27(11):5.作者：张娜，李亚丽，高福禄作者单位：1.河北医科大学第四医院，河北石家庄050011；2.河北省人民医院，河北石家庄050071；3.河北师范大学，河北石家庄050017