甘蓝型油菜BnClo1基因克隆,表达载体的构建及原核表达

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1、中国农业科学2010,43(2):252-258ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.004甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达121丁勇，常玮，刘小烛12（西南林学院资源学院，昆明650224；中国科学院昆明植物研究所，昆明650204）摘要：【目的】克隆甘蓝型油菜（Brassicanapus）油体钙蛋白（caleosin）基因BnClo1，并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上，根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物，以

2、甘蓝型油菜种子总RNA为模板，通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段，T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中，构建融合表达载体pTYB12-BnClo1，转化到EscherichiacoliER2566（DE3）中进行表达。【结果】测序结果显示，RT-PCR获得的cDNA全长768bp，包含完整的开放阅读框738bp，编码245个氨基酸残基，caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明，以20℃、-14mmol·LIPTG诱导该基因表达效果最好，诱导产物为一个与理论值相符的83.1k

3、D的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因，并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白，及研究其功能奠定了试验基础。关键词：甘蓝型油菜；油体钙蛋白；BnClo1基因；原核表达；pTYB12MolecularCloning,ExpressionVectorConstructionandProkaryoticExpressionofBnClo1GenefromBrassicanapus121DINGYong,CHANGWei,LIUXiao-zhu12(SchoolofNaturalResources,SouthwestFore

4、stryUniversity,Kunming650224;KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650204)Abstract:【Objective】BnClo1geneclonedfromBrassicanapuswasexpressedinEscherichiacoliER2566.【Method】AcDNAfragmentabout750bpwasamplifiedfromthetotalRNAofrapeseedsbyreversetranscriptionPCR(RT-PCR)withap

5、airofspecificprimersbasedonthesequencesoftheBnClo1gene.TherecombinantprokaryoticexpressionvectorpTYB12-BnClo1wasconstructedbyinsertingthecDNAfragmentencodingthematurepeptideofcaleosinintotheprokaryoticexpressionvectorpTYB12,andthentransformedintoE.coliER2566(DE3).【Result】Sequenceanalysissh

6、owedthatthefragmentlengthwas768bpcontainingafullcodingregionof738bpencoding245aminoacidresidueswithamolecularmassof28.1kD.TheSDS-PAGE-1electrophoresisanalysisshowedthatthebestexpressionwasinducedby20℃and4mmol·LIPTG,underwhicharelativemolecularweightof83.1kDrecombinantproteinintein-caleosin

7、wasproduced.【Conclusion】ABnClo1geneofrapewasclonedandoptimizingexpressedinE.coli.Theseresultsshouldprovideafoundationforfurtherpurifyingandidentifyingtargetproteinandfunctionstudyofrapecaleosinprotein.Keywords:rape(Brassicanapus);caleosin;BnClo1gene;prokaryoti