胰岛素样生长因子Ⅰ对其受体在肿瘤细胞中表达调节的实验研究

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1、南京医科大学硕士学位论文胰岛素样生长因子Ⅰ对其受体在肿瘤细胞中表达调节的实验研究姓名：王俊宏申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：潘世扬;章明庆20030418南京医科大学硕士学位论文胰岛素样生长因子I对其受体在肿瘤细胞中表达调节的实验研究中文摘要I胰岛索样生长因子I受体(IGF．IR)是一跨膜受体，由oc和p两个亚单位组成，它广泛表达于多种类型的细胞的表面，介导了IGF—I(胰岛素样生长因子I)和大部分IGF．II的生物学活性，它可以促进机体的蛋白质和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代谢。而且它与细胞的生长分化

2、，胚胎的发育密切相关，当其表达过度时，细胞则可以向恶性表型转化。在多种肿瘤中(包括乳腺癌、结肠癌、小细胞肺癌等)都已检测到IGF。IR及其配体的表达异常。本实验通过研究，比较了非小细胞肺癌细胞株A549细胞和淋巴细胞在外源性rIGF．I的作用下，在细胞转录水平上，其自身IGF．IR的表达变化。本实验同时研究了这两种细胞在血清撤除情况下，其IGF—IR的表达情况，并初步探讨了IGF．IR在肺癌发生及发展过程中的作用。、／[目的】研究肺腺癌细胞株A549细胞和淋巴细胞在外源性胰岛素样生长因子I作用下，各自IGF．I受体(IGF

3、—I鼬mRNA的转录情况。同时研究血清撤除对两者rlGF．I受体表达变化的影响，探讨在肺癌发生过程中IGF．IR表达失控的机理，为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供一定的理论依据。【材料和方法】实验分两个部分来研究外源性rIGF．I对A549细胞和淋巴细胞IGF．IRmRNA表达的影响。在实验第一部分中研究了在一固定浓度的rlGF．I的刺激下，细胞IGF．IR的表达情况。卜实验采用RPMI1640+10％小牛血清(完全1640培养液)体外培养7非小细胞肺癌A549细胞，待细胞处于指数生长期时用2,5g／L的胰南京医科火学硕士学位

4、论文酶消化细胞，用完全1640培养液稀释细胞，计数后接种于6孔细胞培养板，培养24h待细胞贴壁生长后弃去培养液，改用无血清的1640培养液(不全1640培养液)培养12h后，每孔加入一定量的rlGF—I至终浓度为20n∥ml，按0、2、4、8、16h不同的时间点收集细胞。淋巴细胞采用RPMI1640+4％人“AB”血清直接培养于6孔培养板，培养24h后弃去培养液，改用不全1640培养液，培养12h后同样加入rlGF．I至每孔中终浓度为20ng／ml，按上述相同的时间点收集细胞。实验同时设不加rIGF．I的空白对照，在相同的

5、时间点收集细胞。细胞收集后用Tripure提取RNA，以细胞内表达恒定的天冬氨酰合成酶基因(AS)作为内参照，采用一步法RT．RCR试剂盒同时扩增AS和IGF．IR基因。扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳，摄像后采用Kodak凝胶图象分析软件分析两者表达强度，利用公式积分光密度(IOD)1GF-。R／IODAs对IGF．IRmRNA进行相对定量。，实验第二部分按第一部分相同的方法培养淋巴细胞和A5459细胞，按终浓度为0、5、20、80、160、320ng／ml各孔加入相应的rlGF．I，并根据第一部分实验结果确定的最佳作用时间

6、点收集细胞，提取RNA，进行RT．PCR基因扩增定量分析观察不同浓度rIGF．I作用对淋巴细胞和A549细胞各自IGF．IRmRNA表达的影响。[结果]1．淋巴细胞和A549细胞在撤除血清的无血清培养液中培养后IGF．IRmRNA的转录均呈反应性上调，至血清撤除16h后这种作用达到平台期。血清撤除刺激可以上调淋巴细胞IGF—IRmRNA的转录至4倍于基础水平，而对于A549细胞，这种作用可以使其IGF．IRmRNA升高至2倍于其基础水平。2．rIGF．I的作用迅速，20ng／ml的rIGF．I作用8h后即可以下调淋巴细胞I

7、GF．IRmRNA至接近于基础水平。3．无血清培养的A549细胞与20ng／ml的rIGF．I孵育16h后，其IGF．IRmRNA的转录与无rIGF—I作用的空白对照相比无明显改变。4．淋巴细胞和A549细胞被不南京医科大学硕士学位沦文同浓度的rlGF．I的作用后出现不同的反应。对淋巴细胞而言，其IGF．IRmRNA对rlGF．I的反应呈剂量负相关，当rlGF．I浓度增加至20ng／ml后，IGF．IRmRNA即出现显著降低。而A549细胞IGF．IRmRNA的转录水平则与IGF．I的刺激无明显相关性，即使rlGF—I的浓

8、度增加§320ng／ml，其IGF．IRmRNA的转录水平仍未发生明显改变。f[结论】1．rlGF．I不能上调A549细胞自身受体的表达，说明对于A549细胞，IGF—I并非引起其自身IGF—IR过度表达的一个因素。2．淋巴细胞可以通过负反馈调节机制在转录水平下调细胞tGF—I受体的表达来对抗过度rlG