外源性人胰岛素样生长因子ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究

《外源性人胰岛素样生长因子ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第一军医大学博士学位论文外源性人胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究姓名：朱志刚申请学位级别：博士专业：骨外科学指导教师：金大地20060501博士学位论文外源性人胰岛素样生长因子I基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究博士生：朱志刚导师：金大地教授摘要外伤或退变等疾患引起的关节软骨损伤在临床上很常见，但软骨组织中不具有血管与神经，其损伤后不易自我修复。对于关节软骨损伤的修复在目前的骨科临床、基础研究中仍是一个重要的课题。许多研究表明，生物活性因子在关节软骨的损伤、修复机制中，起着重要的调节作用。某些生长

2、因子如胰岛素样生长因子(IGF)可刺激软骨细胞分化的表型。表皮生长因子(EGF)具有很强的促有丝分裂和刺激合成代谢的作用。通过细胞生长因子的调控，在体外可以促进软骨细胞的分裂增殖，尽管通过这些因子对体外培养的软骨细胞进行作用，促进了软骨细胞的分裂增殖，但机体对软骨细胞作用的内环境是多种因子相互作用、相互调节的结果。局部应用生长因子时，有效成分容易被稀释或在机体对软骨细胞作用的内环境中丢失。IGF—I是一种th70个氨基酸组成的多肽，分子量为7．6kDa，其结构与胰岛素同源，受生长激素调节。它是第一个被确认对关节软骨具有自分泌调节作用的生长因子，在关节软

3、骨中的作用有：(1)刺激细胞分裂增殖。IGF—I显著促进多种来源的软骨细胞增殖，而不影响软骨细胞的分化状态。(2)促进蛋白多糖的合成，阻止基质金属蛋白酶的表达，减慢蛋白多糖的降解。体外研究发现，在白介素-1B和肿瘤坏死因子存在的条件下，IGF—I仍能促进软骨细胞的蛋白多糖合成。(3)刺激II型胶原蛋白的合成。在无血清的体外培养中，IGF—I能显著刺激II型胶原蛋白的合成。无论对于未成熟或者己分化成熟的软骨细胞，IGF—I在促进软中文摘要骨细胞合成代谢方面的作用是相似的，在生长发育期间，刺激关节表面的增大；在肢端肥大症患者，组织中IGF-I水平增高可引起

4、成人关节软骨的肥大和增生。应用IGF—I与软骨细胞联合移植能促进缺损软骨的修复，但外源性IGF—I半衰期短，需大剂量反复使用，而且价格昂贵。研究表明，利用转基因技术将生长因子基因转入种子细胞后可在局部缺损区持续高表达具有生物活性的内源性生长因子，调控其自身的增殖与分化。将含有IGF—I基因的腺病毒载体直接注射到兔膝关节腔内，关节灌洗液中IGF—I的表达水平明显升高，但这种在体基因转染方式不能确定基因是否转染软骨细胞，更不能确定转基因细胞的生物学作用。将IGF—I基因转入人软骨细胞，体外研究比较转基因软骨细胞的生物学行为，再将转基因细胞移植体内，更能为软

5、骨组织工程的研究提供可靠的实验依据。在本实验中，我们利用重组腺病毒将IGF—I基因转染入人软骨细胞中，对IGF—I转移入人软骨细胞的可行性和IGF—I对软骨细胞增殖的影响进行了初步的探讨。第一部分：Ad-hIGF-I的构建和鉴定目的：构建、鉴定Ad—hIGF—I。方法：①构建Ad—hIGF—I：PCR合成hIGF-I基因，用pMDl8一T载体克隆hIGF—I目的基因，酶切、测序并进行NCBIBLAST分析。将pMDl8一TMGF-I和pDNR—Ir质粒合成中间载体pDNR—hlGF—I，酶切鉴定。Cre—loxP系统介导pDNR—hIGF—I和pInt

6、．AVI．SpaT同源重组形成pInt．AV1．SpaT-hIGF—I重组表达质粒，艮。RI酶切鉴定。复苏293细胞，将p]nt．hVI．SpaThIGF—I和pint．B．B质粒在293细胞内进行同源重组成Ad—hIGF—I．②鉴定Ad—hIGF-I，倒置显微镜观察293细胞病变样效应(cytopathogenicefect，CPE)：Ad—hIGF—I进行PCR鉴定。用半数组织培养感染法测定第3代重组腺病毒滴度。结果：克隆的hIGF—I基因证实与基因库中序列完全相同。转染293细胞12—14d后，大部分细胞出现肿胀，脱落等CPE现象。PCR鉴定重组

7、Ad-hIGF—I含有MGF—I目的基因。第3代重组腺病毒滴度为70×10。PFU／L。结论：成功构建出Ad-hIGF—I。获得大量高滴度的重组腺病毒。II博士学位论文第二部分：IGF_I基因转染人关节软骨细胞及其在软骨细胞中的表达目的：探讨IGF—I基因转染人关节软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：将收集好的Ad—hlGF—I转染人关节软骨细胞，分别转染1，10，100及500不同感染复数单位(multiplicityofinfection，MOI)的Ad—hlGF—I，用PBS做阴性对照，采用MTT法检

8、测不同时间、不同组别软骨细胞吸光度。用SPSS10．O统计分析实验数据。通过RT-PCR和EL