外源性核心蛋白聚糖对人关节软骨细胞胞外基质影响实验的研究

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1、第三军医大学硕士学位论文外源性核心蛋白聚糖对人关节软骨细胞胞外基质影响的实验研究术摘要背景骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的破坏，软骨下骨改建和滑膜炎为特征的慢性退行性疾病，被认为是最普遍的慢性关节疾病，并且其发病率由于人口老龄化和肥胖症的流行还在不断上升。其主要临床特征是疼痛和关节功能丧失。目前的治疗主要集中在缓解症状，包括非药物，药理，外科手术的方法，但这些方法都不能控制这种疾病的进展。关节软骨属于透明软骨，自身没有血供，无淋巴引流，无神经分布，作为承重材料，能承受冲击力和剪切力。软骨细

2、胞是关节软骨唯一的细胞成分，这些细胞合成并维持着细胞外基质，包括胶原蛋白和蛋白聚糖。胶原蛋白提供了软骨组织的抗拉强度，而蛋白聚糖主要是软骨聚集蛋白聚糖(aggrecan)H⋯匕在软骨基质维持大量水分子，使软骨组织能够抵御压力和分散负荷。有大量证据表明，软骨基质的合成代谢和分解代谢的不平衡，细胞外基质的分解代谢增强导致软骨的丢失在骨关节炎起着重要作用。核心蛋白聚糖(DCN，Decorin)是小的富含亮氨酸的蛋白聚糖，是小分子蛋白聚糖家族(smallleucinerichproteoglycans，SLRP)中的一员，是第一

3、个从人类胚胎成纤维细胞系克隆的小蛋白多糖当时被称为PG40，后因在电子显微镜下显示其能够修饰胶原纤维，故改称核心蛋白聚糖。DCN广泛存在于I型和II型胶原的基质中，参与重要的生物学功能如：基质的组构，调控细胞的黏附、迁移和增殖。DCN通过其核心蛋白与转化生长因子13l，2’3(TGF—B1,2,3，transforminggrowthfactorbetas1，2and3)结合，并抑制其活性。有研究表明DCN的分解片段在退化的关节软骨中明显增多。在骨关节炎早期，关节软骨的DCN的基因表达受到抑制；而在骨性关节炎晚期，关节软

4、骨中的DCN含量减少而DCN的转录和翻译水平上调。这些结果提示，DCN在骨性关节炎的发生、发展中有重要作用。本实验通过对人正常软骨细胞进行体外原代培养，观察不同浓度的外源性DCN对软骨细胞胞外基质降解蛋白酶(MMPl3，ADAMTS．5)的基因表达变化以及软骨细胞肥大化(CollagenX)的基因表达变化，探讨其潜在机制。’本课题受第三军医大学青年人才基金资助(项目编号：2009XQN40)8第三军医大学硕士学位论文目的通过对人正常关节软骨进行体外原代细胞培养，观察不同浓度的外源性核心蛋白聚糖(DCN，decorin)对

5、软骨细胞胞外基质降解蛋白酶(MMPl3，ADAMTS．5)的基因表达变化以及软骨细胞肥大化(Collagenx)的基因表达变化。方法1．标本来源施行股骨颈骨折人工全髋关节置换术中切除，全层关节软骨标本5例，患者年龄63～87(77．2±9．01)岁，其中男性2例，女性3例。标本获取得到医院伦理委员会批准，并经患者本人知情同意。2．人关节软骨的细胞分离与培养参照单层细胞培养方法分离关节软骨细胞，从上述患者获得关节软骨组织，在无菌条件下浸入1×PBS中漂洗数次，2．5gm胰蛋白酶消化15min后，再次去除关节软骨周围多余组织

6、。1×PBS漂洗后剪碎关节软骨组织呈1mm3碎块，用含10％胎牛血清的O．2％II型胶原酶(Gibco公司)消化15—20h，消化后将细胞悬液以150目不锈钢滤网过滤，1000r／min离心5min后1×PBS漂洗再离心后台盼蓝染色计数以5．5×105／孔的细胞密度接种于盛有适量DMEM／F12(其中含10％胎牛血清，100IU／ml青霉素，100lag／ml链霉素)培养液的12孔细胞培养孔板，置于C02培养箱中培养(温度37℃，饱和湿度，体积分数5％C02)。24h后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两三天换液1次。倒置

7、显微镜下观察细胞生长情况。培养细胞至80％融合时(第5天)，分别加入外源性DCN(Sigma公司)溶解液，使其培养液浓度为0，2．5，25，250ug／ml，24h后备用。3人关节软骨细胞体外培养鉴定3．1阿尔新蓝染色取培养5d原代软骨细胞，PBS洗2遍，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗2遍，1％阿尔新蓝染液染色15min，蒸馏水冲洗。3．2II型胶原免疫组化取分离提纯计数后的原代软骨细胞种在可放入12孔板的盖玻片上，5d后取出固定，固定方法同阿尔新蓝染色。正常山羊血清封闭液，室温封闭20min。滴加1：50稀释的I

8、I型胶原单克隆抗体(Sigma公司)，4。C孵育过夜。滴加生物素化二抗，室温孵育lh。滴加SABC试剂，室温20min。DBA显色剂显色，显微镜观察控制染色时间，脱水，封片。第三军医大学硕士学位论文4．原代软骨细胞的RNA的提取及反转录在无RNA酶污染条件下，分别用Trizol提取培养6d原代软骨细胞RNA，按照Ta