空肠弯曲菌感染人和鸡体内表达抗原的筛选及其生物学特性初步鉴定

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1、Screeningofinvivoinfection-·relatedantigensfromCampylobacterjejuni。humanandchickenhqcampylobacterlelUnlinUmanandChickenhostsand—analysisofbiologycharactersByYuanqingHuAdvisor：Prof．JianpinTaoProf．XinanJiaoADissertationSubmittedtoYangzhouUniversityInPartialFu

2、fillmentoftheRequirementfortheDoctorDegreeinPreventiveVeterinaryMedicineCompletedinNovember,2012CommencementinDecember,2012胡元庆：空肠弯曲菌感染人和鸡体内表达抗原的筛选及其生物学特性初步鉴定一1空肠弯曲菌感染人和鸡体内表达抗原的筛选及苴生鬻黧步鉴定㈣煳研究生：胡元庆o‘uo‘，O了导师：陶建平教授焦新安教授中文摘要空肠弯曲菌是全球性分布的主要细菌性肠道病原菌，也是一种重要的食源性病原菌。

3、近年来，空肠弯曲菌引发的人类感染病例在全球范围内逐年增加，尤其在发达国家，该菌对人类的威胁超过了沙门菌和志贺菌而跃居首位。空肠弯曲菌可以定植于多种动物的肠道内，包括鸡、牛、羊、犬和野鸟，定植于人的大肠中可导致自限性腹泻。世界范围内空肠弯曲菌引发的人感染病例多呈散发。由于该菌在鸡群中广泛分布，禽肉及其制品是人类消费的主要肉食品之一，污染的禽肉成为人类弯曲菌病的主要来源，这给控制人感染弯曲菌的工作带来巨大的压力。疫苗是防控动物传染病的有效手段之一，但目前对防控空肠弯曲菌感染却没有十分理想的商品化疫苗可用。寻找控制

4、该菌的关键性保护抗原，深入了解弯曲菌的生物学特性，尤其是对其致病机制的解析，将为防控空肠弯曲菌对人的威胁提供重要的理论依据。由于没有合适的动物模型可用来研究空肠弯曲菌感染人的相关机制，因此很多学者尝试用分子生物学方法并结合细胞模型等手段来探讨其毒力特性。体内诱导表达抗原技术(invivo．inducedantigentechnology,IVIAT)是一项新型的病原菌毒力基因筛选策略，因其不需要动物模型而备受关注。将IVIAT用于空肠弯曲菌的研究在国内外尚属空白。本文用IVIAT筛选了人和鸡被空肠弯曲菌感染后

5、体内表达抗原，并用荧光定量PCR技术验证其体内表达特性。在此基础上借鉴IVIAT的原理，设计并建立了一种新型的免疫蛋白组学技术，同时解析了空肠弯曲菌在人体内感染时表达的抗原，取得了满意的结果。1．人源和鸡源空肠弯曲菌分离株主要毒力基因的分布分析空肠弯曲菌基因组序列中含有高变量序列，且在不同菌株的毒力基因之间变异较大。本研究选取39株人源空肠弯曲菌分离株，31株鸡源分离株进行主要毒力基因分布调查。2扬州大学博士学位论文首先选择与细菌黏附、定植、入侵、外毒素和脂多糖合成等相关的27个毒力基因为检测靶基因，然后参考

6、已公布的空肠弯曲菌NCTC11168标准株全基因组序列，分别设计特异性PCR引物，最后分别对人源株和鸡源株进行PCR检测。结果显示：鸡源空肠弯曲菌分离株中，黏附相关基因peblA和cadF的阳性率较高，分别为100％和97％；定植因子中阳性率最高的是eheY，鸡分离株为100％，人分离株为92％；入侵相关基因中，鸡源株的分布阳性率均小于90％，最小的为virBll(9．7％)；人源株的阳性率最高为92％(iamA)，最低的virBll仅为5％；外毒素相关基因cdtA、cdtB和cdtC在人源株与鸡源株间并无明

7、显差异，均以cdtB为最高，分别是97％和94％；脂多糖合成相关基因wlaN、waaF、neuBll检出率在人源和鸡源空肠弯曲菌的分离株中均不高。人源和鸡源空肠弯曲菌分离株中毒力基因的分布总体没有明显差异，但不同功能基因略有不同，人源株中入侵和脂多糖合成相关的基因分布较高。本部分对空肠弯曲菌已知毒力基因在人和鸡源分离株中的分布分析，有助于为体内毒力基因的筛选提供参考。2．空肠弯曲菌全基因组表达文库的构建及鉴定空肠弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，鸡是其主要的贮存宿主，人感染后多表现为自限性胃肠炎。本研究旨在构

8、建空肠弯曲菌NCTC11168株的基因组表达文库，为研究空肠弯曲菌体内表达抗原及其致病机制奠定基础。首先将该菌的基因组DNA用Sau3AI部分酶切后，切胶回收大d',400"-'3000bp的片段。然后用BamHI酶切原核表达pET30a(b，c)系列载体，用SAP去磷酸化后，切胶回收线性质粒载体。接着将回收的基因组DNA片段与线性载体按10：1摩尔比例连接，转化DH5a感受态细胞，用载体特异性引物