空肠弯曲菌生物膜形成特性及相关基因的初步探析

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1、张明：空肠弯曲菌生物膜形成特性及相关基冈的初步探析空肠弯曲菌生物膜形成特性及相关基因的初步探析研究生：张明导师：焦新安教授黄金林副教授中文摘要空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是一种重要的人兽共患病原菌，在全球范围内它是引起人类细菌性腹泻的主要食源性病原菌之一，更重要的是特定血清型的空肠弯曲菌引起的肠炎是诱发格林一巴利综合症(GuffiamBarreSyrdrome)的重要前驱因子。其致病机制目前还不完全清楚，但它在环境中的存活和较高的发病率与其能够形成生物膜密切相关，生物膜的形成在空肠弯曲菌传播感染中扮演了重要的角色。生物膜是微生物在生长过程中为适应生存环境而吸附于生物

2、材料、．机体腔道表面以及其他一些介质上，分泌黏性胞外基质(extraeellularpolymericsubstance，EPS)将其自身包裹成微菌落，并相互融合形成的高度组织化、系统化的微菌落膜性聚集物。生物膜的特殊结构可以使细菌耐受消毒剂、冷热等而得以残存，造成持续感染和重复感染，因此对于生物膜的基础研究具有极其重要的现实意义。本研究首先确定了空肠弯曲菌形成生物膜的最佳条件，建立了空肠弯曲菌生物膜形成检测方法，对179株分离株的生物膜形成能力和生物膜形成相关基因进行检测，同时利用二维电泳技术对空肠弯曲菌生物膜状态的蛋白质进行初步分析，并运用荧光定量PCR技术对鉴定出的蛋白点进行mRNA

3、水平表达差异的分析，为进一步深入研究空肠弯曲菌生物膜奠定一定的基础。研究中，首先采用聚丙乙烯微孔板定量检测法对空肠弯曲菌生物膜进行测定，利用结晶紫染色法测定在不同培养时间、氧气浓度、温度、培养基条件下生物膜的形成情况，结果表明：在37℃、10％02培养条件下，用MH肉汤培养72h的空肠弯曲菌能够形成较为成熟的生物膜。随后还通过试管法、普通显微镜法和扫描电子显微镜法来检测观察空肠弯曲菌生物膜的形成，结果显示：空肠弯曲菌在试管的气液交界面容易形成生物膜，且通过结晶紫染色后能够清楚地观察到生物膜的形成；利用刚果红／石碳酸品红染色后用普通光学显微镜能够直接观察到生物膜的结构；通过扫描电子显微镜可以

4、观察到更为直观、立体的生物膜的结构，甚至细微的结构。在实际检测时可以根据不同的情况来选择不同的检测方扬州大学硕士学位论文利用聚丙乙烯微孔板定量测定法对179株不同源空肠弯曲菌分离株进行生物膜形成能力的测定，根据OD值将菌株分为：弱生物膜形成能力、中等生物膜形成能力和强生物膜形成能力。结果显示：弱生物膜形成能力的菌株共有60株，中等生物膜形成能力的菌株有69株，50株具有强生物膜形成能力。而不同源的分离株生物膜形成能力分布与总体趋势类似，不同源菌株之间生物膜形成能力没有显著差异。利用空肠弯曲菌的两种敏感抗生素：头孢噻肟和链霉素，分别测定其对空肠弯曲菌悬浮菌和生物膜状态的MBC(最低杀菌浓度)

5、，并进行比较。结果显示：生物膜状态下的空肠弯曲菌较悬浮状态，两种抗生素的MBC均呈数倍提高。这也一定程度上说明生物膜的形成也是空肠弯曲菌耐药的一个重要因素。研究中根据文献报道选择9个与生物膜形成相关的基因：f／aa(鞭毛蛋白基因)、f／／a(鞭毛生物合成因子)、Luxs(与群体反应有关的基因)、rpoN(类似于影响肠炎沙门菌生物膜相关基因rpoS的RNA聚合酶因子)、cmec(外膜通道蛋白)、cadF(黏附基因)、racR(黏附定植相关基因)、peblA(黏附蛋白基因)、Peb4(细胞间结合蛋白相关基因)。对179株不同源空肠弯曲菌分离株进行生物膜相关基因的检测，选定的9个基因在各个生物膜

6、形成能力类别中均有较高的检出率，单独基因和生物膜形成能力之间没有绝对直接的正负表达关系，这也从一定程度上揭示了生物膜的形成是多种基因协同表达调控的结果。另外，本研究制备了空肠弯曲菌NCTClll68悬浮状态和生物膜状态的细菌，并提取菌体蛋白，应用固相pH梯度二维凝胶电泳获得了重复性较好的2-DE凝胶图谱，利用PDQuest软件筛选出差异蛋白质，选取了部分差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI．TOF／TOF．MS)分析获得肽质量指纹图谱，利用MASCOT数据库进行搜索，获得所鉴定蛋白质的生物学信息。通过质谱鉴定，得到的10个差异蛋白，涉及生物合成类的有4个，氧化还原酶类

7、有2个，转移酶类有4个。通过荧光定量PCR对10个基因转录水平的表达进行分析，其中groEL蛋白质水平和mRNA水平表达量在生物膜状态下均较高，其功能主要是促进外膜蛋白的折叠，可能与生物膜的形成密切相关。关键词。空肠弯曲菌；生物膜；检测：结晶紫染色法；基因；二维凝胶电泳张明：空肠弯曲菌生物膜形成特性及相关基冈的初步探析3BiofilmformationandrelevantgenesofCampylobacterjeju