空肠弯曲菌感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基因的筛选

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1、商宇伟：空肠弯曲菌感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基凶的筛选三空肠弯曲茵感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基因的筛洗达研究生：商宇伟导师：黄金林教授焦新安教授中文摘要空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,9)是一种重要的食源性人兽共患病原菌。人感染C，后主要引起细菌性胃肠炎(Bacterialgastroenteritis)和急性腹泻，免疫力低下者会导致心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病。但迄今为止，对C，致病性方面的研究尚不很清楚，其主要原因是缺乏合适的动物模型。本研究尝试建立空肠弯曲菌感染仔兔腹泻模型，探索该菌在仔兔模型体内的动态分布、免疫应答规律及可

2、能的感染机制；并利用选择性捕获转录序列方法鉴定了空肠弯曲菌在感染兔体内转录的基因，取得了满意结果。一、空肠弯曲菌致仔兔腹泻模型的建立本研究选用初生仔兔为实验动物，因为相比啮齿类动物，兔在系统发育和生理构造上更相似于人类，初生动物还具有体内清洁、体型小、方便饲养和易于管理等优点。根据实验所得最佳建模条件，使用空肠弯曲菌NCTClll68为攻毒菌株，灌胃1×109CFU剂量感染经西咪替丁(50mg／kg)预处理的2日龄，体重为40-x2g的仔兔。通过收集临床症状、病理变化、病原分离和致病性资料评价模型建立情况。结果显示空肠弯曲菌可人工感染仔兔并引起自限性的、水样腹泻症状；剖检发现主要病变

3、是小肠积液、肠壁出现出血点，盲肠、结肠肿大，肠腔内充满水样内容物；组织病理切片显示盲肠黏膜出现坏死脱落，固有层小血管扩张、充血。病原分离鉴定结果证实各脏器感染菌株均为C，。剂量反应实验显示腹泻疾病的程度与攻毒剂量、肠道细菌定植量正相关，至少106CFU细菌可引起仔兔可观察的腹泻症状和各肠道的定植；至少104CFU细菌可引起盲肠和结肠的定植。不同来源空肠弯曲菌分离株对仔兔致病性存在明显差异，说明该模型能够有效评价。的毒力强弱。二、空肠弯曲菌仔兔体内感染动态分析本研究在建立上述模型的基础上，分别在攻毒后12，24，36，48和60hr剖检仔兔，扬州大学硕士学位论文利用细菌分离及PCR方法

4、分析C，在体内各组织中的分布情况和变化规律；应用电子显微镜技术观察C，侵入小肠上皮细胞后引起细胞形态变化规律；应用real．timeRT-PCR技术检测C，感染后仔兔小肠黏膜炎症趋化因子、细胞因子、抗菌物质和酶类的分泌量变化规律。研究结果显示a侵入血液的速度很快，对肝脏、肾脏等实质器官的黏附性无明显差异，并在4811r后被清除；cj在盲肠和结肠中定植时间大于60llr，定植量高达108CFU／g。扫描和透射电子显微镜结果显示C，可黏附在肠绒毛，并在攻毒后24～3611r侵袭破坏部分上皮细胞；48～6011r可见部分上皮细胞脱落、凋亡，大量上皮内淋巴细胞浸润。Real．timeRT-P

5、CR结果显示感染后12hr可见IL．10和抗菌肽CAP．18的大量分泌，3611r时IL．18、CCL20分泌增加；60hr时IFN．Y、IL．10、IL．8、iNOS发挥重要免疫作用。三、选择性捕获空肠弯曲菌仔兔体内转录序列本研究以空肠弯曲菌NCTClll68菌株为研究对象，采用选择性捕获转录序列(Selectivecaptureoftranscribedsequences，SCOTS)方法鉴定空肠弯曲菌NCTCl1168在感染兔盲肠过程中细菌转录的基因序列。经过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增、SCOTS、阳性克隆测序。结果共获得9个转录序列，按照其编码蛋白的功能分为4大

6、类：新陈代谢蛋白、细胞表面蛋白、复制相关蛋白和应激相关蛋白。利用real．timeRT-PCR对表达基因进行转录水平的验证，结果表明：pnp、katA、cj0609c、∥1481c和acs等5个基因与正常CCDA培养基中培养的11168菌株的基因转录水平相比，在感染兔盲肠组织中转录水平上调4．49116倍，为进一步阐明筛选到的体内表达基因在C，致病过程中的作用奠定了基础。关键词：空肠弯曲菌；仔兔模型；组织分布；免疫应答；SCOTS；致病性商宇伟：空肠弯曲菌感染仔兔模型的建立及动物体内诱导基凶的筛选三TheestablishmentofCampylobacterjejuniinfect

7、ionininfantrabbitmodelandinvestigationoftheivi--genesinmodelanimalsM．S．candidate：YuweiShangAdvisors：Prof．JinlinHuangProf．Xin’anJiaoAbstractIIlrllliiiIiiiI[1lIrllllIlllIIIIIrllJY2632992Campylobacterjejuni(cj)isanimportantzoonoticfo