猪、鸡弯曲菌的分离鉴定和耐药性分析及空肠弯曲菌环介导等温扩增检测方法的研究

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1、分类号：墨墨5主：!密级：公珏单位代码：学号：!Q鲣鱼2010476猪、鸡弯曲菌的分离鉴定和耐药性分析及空肠弯曲菌环介导等温扩增检测方法的研究Isolation，IdentificationandAntimicrobialSusceptibilityofCampylobacterinPigandChickenandDevelopmentofaLoop··mediatedIsothermalAmplificationAssayforDetectionofCampylobacterjejuni学位申请人：许紫建指导教师：孙继国教授徐福洲副研究员学科专业：预防兽医

2、学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二O一三年六月一日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得泣宴垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：许鼗签字吼歹p／了年多月／

3、日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑些盛些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论

4、文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权通皇垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：许学§芝签字日期：歹汐／罗年／月／日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导燃：弧轨新词签字日期：夕汐序年／月f日电话：邮编：摘要弯曲菌(Campylobacter)是一种微需氧、菌体呈弧形或螺旋形的革兰氏阴性细菌，在世界范围内广泛存在，可感染人和动物引起发病，但感染家禽后不引起临床症状，但成为人感染弯曲菌的主要污染源。目前弯曲菌

5、属中已鉴定19个种，其中以空肠弯曲菌(C]ejuni)和结肠弯曲菌(Ccoli)对人的感染最为普遍。为调查畜禽肠道内弯曲菌特别是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的流行状况，本试验自北京郊区畜禽养殖场和屠宰场采集畜禽肠道粪便样品，经增菌培养后利用三重PCR进行弯曲菌属、空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检测，进而对PCR检测阳性样品进行弯曲菌的分离鉴定，最后对分离鉴定的弯蓝菌分离株进行药敏试验鉴定。本试验共采集鸡肠道和肛门拭子132份，经PCR检测共6份呈空肠弯曲菌阳性，但细菌分离鉴定未获得空肠弯曲菌分离株。采集猪肠道和肛门棉拭子样品241份，PCR检测结肠弯曲菌阳性样品数为17

6、8份，阳性率为73．9％，而空肠弯曲菌阳性样品数5份，阳性率仅为2．1％。经分离鉴定后共获得结肠弯曲菌菌株63株，分离率为35．4％，未分离获得空肠弯曲菌菌株。对26种抗生素的药敏试验结果显示结肠弯曲菌分离株对氯霉素(100％)、丁胺卡那(93．7％)、强力霉素(91．5％)、庆大霉素(82．5％)和阿莫西林(82．5％)等抗生素比较敏感，而对头孢哌酮(100％)、头孢氨苄(100％)、头孢拉啶(100％)、头孢唑啉(98．4％)、头孢克肟(92．1％)、萘啶酸(92．1％)、链霉素(90．5％)、环丙沙星(90．3％)、诺氟沙星(88．9％)和青霉素(87

7、．3％)具有显著的耐药性；而且分离株多重耐药现象比较普遍，主要集中于14．20耐。本试验结果显示猪肠道内普遍存在结肠弯曲菌，而且菌株对多种抗生素产生了显著的耐药性。环介导等温扩增(LAMP)方法是近年来出现的一种简便快速检测病原的方法，为自动物源性产品中快速检测空肠弯曲菌的污染，本试验建立了检测空肠弯曲菌的LAMP方法。首先根据检测空肠弯曲菌的文献报道，选择特异性的mapA基因设计LAMP引物，建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同影响因子分别进行筛选和优化，筛选的最佳结果为内外引物浓度分别为1．6lxM和0．2州、M92+浓度为8m

8、M、dNTP浓度为1．4mM、Betaine浓度为0．8M、反应时间为60min、反应温度为65℃。最后特异性检测结果显示对其它13种细菌扩增结果均为阴性；敏感性检测结果显示对空肠弯曲菌基因组DNA的检测灵敏度为100fg，对空肠弯曲菌菌液检测灵敏度为7．5cfu。本试验建立的LAMP检测方法为实现快速简便检测空肠弯曲菌奠定了坚实的基础。关键词：空肠弯曲菌；结肠弯曲菌；分离；药敏试验；环介导等温扩增方法Isolation，IdentificationandAntimicrobialSusceptibilityofCampylobacterinPigandCh

9、ickenandDevelopmentofaLoop