脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响及加味补阳还五汤的改善作用研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响及加味补阳还五汤的改善作用研究姓名：李锦灵学号：2111548066院系：中药学院学位类型：专业学位专业：中药学研究方向：中药药效评价与临床应用研究导师：王晖教授张钰研究员论文提交日期：2018年5月24日论文答辩日期：2018年5月21日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文Theeffectofsepsisinmiceonglymphaticclear

2、ancepathwaysandtheimprovementofJiaweiBuyangHuanwuDecoctionCandidate：LiJin-lingStudentID：2111548066Affiliation：SchoolofTraditionalChineseMedicineAcademicDegreeApliedfor：ProfessionaldegreeofTraditionalChineseMedicineSpeciality：TraditionalChineseMedicineSupervisor：Prof.H

3、uiWangAssistantSupervisor：Prof.YuZhangDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversity052018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响及加味补阳还五汤的改善作用研究摘要目的脓毒症相关性脑病（sepsisassociatedencephalopathy,SAE）是脓毒症的常见并发症，它的出现与脓毒症患者的病死率增高、远期认知功

4、能、生活质量密切相关。这种远期认知损伤的机制尚不明确，预防和改善SAE疾病还没有有效的方法。因此本研究采用经典的盲肠结扎穿孔法（cecalligationandpuncture,CLP）构建脓毒症小鼠模型，通过对存活小鼠的行为评价，利用双光子显微镜检测脑类淋巴清除通道功能，以及靶向代谢组学研究相关代谢物，探讨SAE的脑损伤机制，为SAE的治疗提供理论基础。同时，基于所建立的SAE疾病模型，初步评价加味补阳还五汤（JBH-5）对SAE的治疗作用以及对脑代谢物清除的影响。方法1.脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响采用CLP手术诱发小鼠脓毒

5、症，对急性脓毒症存活小鼠进行术后11d及30d的行为学分析及术后30d脑组织的病理变化及神经元的损伤情况；通过双光子荧光活体成像技术对术后30d小鼠的脑血管旁通道进行活体监测；同时利用免疫荧光检测48h和30d小鼠脑组织中神经元（Neun）、小胶质细胞及星形胶质细胞的表达和水通道蛋白4（AQP4）的极化水平；基于液质联用技术（LC-MS/MS），采用靶向代谢组学的研究手段，挖掘I广东药科大学硕士研究生学位论文CLP术后30d存在认知损伤的小鼠脑组织的生物标志物。2.JBH-5对小鼠脓毒症脑病的改善作用将9～10W的C57/B6雄性

6、小鼠随机分成Sham组、CLP组、阳性对照组（头孢哌酮0.2275g/kg）、JBH-5高剂量组（50g/kg）、JBH-5中剂量组（25g/kg）、JBH-5低剂量组（12.5g/kg）。采用CLP法建立小鼠SAE模型，术后连续给药30d后，对不同组小鼠进行Morris水迷宫测试行为学指标，HE染色及尼氏染色观察脑组织病理学变化；利用双光子活体成像技术测定小鼠脑旁血管清除通路功能，以及免疫荧光技术检测各组小鼠脑组织小胶质细胞、星形胶质细胞及AQP4的变化。结果1.脓毒症对小鼠脑类淋巴通道的影响CLP手术12d后小鼠的存活率为35

7、%；术后24hCLP组小鼠神经行为学评分显著降低（P<0.05）；术后11d及30d的行为学分析结果表明CLP组小鼠出现空间记忆认知能力的损伤。术后30d的HE染色及尼氏染色显示CLP组小鼠的脑组织出现损伤及海马体神经元数目减少。术后30d的双光子活体成像结果表明，脑脊液荧光示踪剂在CLP小鼠脑实质和脑血管周围间隙中出现堆积，且在脑实质组织中的清除速率明显减慢。术后48h及30dCLP小鼠脑组织的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增多，而胶质纤维酸性蛋白（Iba1）在术后48h显著活化，到术后30d则为静息状态，且AQP4主要表达在

8、星形胶质细胞胞体区域，即其极化水平显著降低（P<0.05）。术后30d的靶向代谢组学结果显示存在认知损伤的CLP小鼠脑内存在15个差异代谢物，其中腺嘌呤核苷酸（AMP）、次黄嘌呤II广东药科大学硕士研究生学位论文核苷酸（IMP）、黄嘌呤核苷、鸟苷、