补阳还五汤对雪旺细胞氧化损伤保护作用机理的实验研究

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1、山东大学硕士学位论文补阳还五汤对雪旺细胞氧化损伤保护作用机理的实验研究姓名：邢三丽申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：李振华20050510山东大学硕十学位论文原创性声明．本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明．本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：型兰塑关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子

2、版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文．(保密论文在解密后应遵守规定)论文作者签名：翌墨亟导师签名：茎丛日期：oJ-．j-．功山东大学硕士学位论文中文摘要补阳还五汤对雪旺细胞氧化损伤保护作用机理的实验研究目的：长期以来，周围神经病变严重影响着人们的生活质量，是神经科学领域中的一个十分复杂的病变过程，近年来的研究发现其发病机理之一为氧化应激引起氧自由基增多，从而导致雪旺细胞的凋亡。雪旺细胞是周围神经系统特有的一种胶质细胞，能包绕轴突形成或不形成髓鞘，并分泌多种与神经系统的

3、发育和再生有密切关系的神经因子．近些年来，应用外界因素(如神经生长因子、中药、电磁场、硅胶管及其它物质的移植等)通过对体内雪旺细胞的作用进而治疗周围神经损伤的研究日渐增多．中药对周围神经的作用，一直是我国医疗工作者和科研工作者研究的热点，中药促进周围神经再生已经得到人们的广泛认可。补阳还五汤是清代名医王清任创制的补气活血名方，由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花组成，对于脑中风等疾病有良好的治疗效果，近年来此方用于治疗周围神经病变，可改善、消除临床症状．现代医学研究表明，它不仅具有扩张血管、增加脑血流量、改善微循环的作用，还有抗自由基氧化损伤作用．在我们以往的在体实验研究中，已

4、证实了补阳还五汤能促进坐骨神经损伤后的结构修复和功能恢复。并且观察到再生神经有髓纤维多且结构成熟，血管含量也比对照组明显多，提示了补阳还五汤对雪旺细胞有一定的促进作用。关于补阳还五汤的抗氧化作用已有初步研究，但对雪旺细胞氧化损伤保护作用的机理尚未见报道。本课题通过建立过氧化氢诱导雪旺细胞氧化损伤的模型，并在此模型的基础上，观察补阳还五汤对氧化损伤的雪旺细胞的保护作用。通过MTT、生化检测、免疫组化、RT-PCR测定、激光扫描共聚焦显微镜进行荧光定量山东大学硕士学位论文分析等方法进行细胞活力测定、酶活力分析、细胞内蛋白含量、GDNFmRNA表达水平及钙离子浓度定量测定等，探讨补阳还五汤

5、抗氧化损伤的作用机理，为更好的指导临床用药提供理论依据。方法：本课题从Wistar新生大鼠的坐骨神经和正中神经取材，进行体外培养雪旺细胞。培养48小时后，分为3个实验组，另设一空白对照组。1．补阳还五汤提取液的制备：补阳还五汤由黄芩60克，当归、川芎、桃仁、红花、地龙、赤勺各10克组成，用水煎醇沉法(75％乙醇)提取，生药含量为29／ml，4"C保存，在使用时过滤除菌。2．雪旺细胞的纯化及鉴定：加入阿糖胞苷以去除成纤维细胞，在培养3d时做S-100蛋白免疫组化染色，鉴定雪旺细胞。3．氧化损伤及药物处理：细胞培养时分三组：过氧化氢损伤组：H202终浓度为O．5％；补阳还五汤保护组：O．

6、5％H202+600pg／ml补阳还五汤提取液；正常组(不加任何因素)；同时设仅加培养液的空白对照组。4．MTT法进行补阳还五汤抗过氧化氢氧化损伤的作用分析。5．生化检测法进行细胞内脂质过氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平的检测。6．应用免疫组织化学方法，对过氧化氢损伤组、补阳还五汤保护组及正常对照组三组细胞进行C邪pase．3蛋白酶变化的测定。7．Fluo-3／Am对细胞进行荧光染色后，应用激光扫描共聚焦显微镜对不同实验组细胞内钙离子的浓度变化进行图像采集及定量分析。8．正常对照组、过氧化氢损伤组及补阳还五汤保护组用RT-PCR法检测GDNF玎1RNA的表达变化情况。通过以上的

7、实验，建立过氧化氢诱导雪旺细胞的氧化损伤模型，在此模型的基础上探讨补阳还五汤对雪旺细胞抗氧化保护作用的机理。结果：刚接种的原代雪旺细胞呈圆形，悬浮在培养液中，次日观察可见绝大多数细胞已经贴壁，胞体较小，呈梭形，饱满立体感强，有两个细长的突起，在培养24小时后加终浓度为10"5mol／L的阿糖胞苷，48小时后换液去除阿糖胞苷后，镜下观察免疫化学染色显示80％以上的细胞S-100呈阳性反应．加入H20212小时后，在倒置显微镜下观察发现细胞的形态发生改变，细胞