cxcr4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响地实验研究

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1、论文扉页简明摘要侵袭和转移是影响黑色素瘤患者生存的首要因素，也是其治疗的最大障碍。SDF．1／CXCR4生物轴作为少数具有点对点精确传导生物信息的生物轴系统之一，在多数肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。越来越多的研究表明，趋化因子受体CXCR4(ChemokinereceptorCXCR4)参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。本研究利用RNA干扰技术下调趋化因子受体CXCR4基因的表达，探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤及细胞系体外侵袭及转移的影响及机制。设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilcncer载体，转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3，RT-PCR和Weste

2、rnblot检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT检测细胞增殖状况。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，构建黑色素瘤转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤转移能力的影响。研究证实，在人转移性黑色素瘤细胞系、人黑色素瘤原发灶及转移组织内均存在CXCR4选择性高表达；实验成功构建并筛选出CXCR4特异性shRNA质粒载体，结果表明，以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达，降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。提示CXCR4是黑色素瘤侵袭和转移过程中的重要调控因子，为黑色素瘤的生物治疗提供了新的靶分子并奠

3、定实验基础。【关键词】黑色素瘤，趋化因子受体CXCR4，shRNA，基因沉默，肿瘤侵袭，转移CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究摘要【研究背景】恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM)在整形外科临床所遇见的体表肿瘤类型中相对少见，但其恶性程度极高。在所有原发于皮肤的恶性肿瘤中，皮肤恶性黑色素瘤虽然只占4％，而其致死率却占79％。黑色素瘤的发病率正以每年5％～7％的速度逐年上升，在男性是发病率增长最快的恶性肿瘤。黑色素瘤早期即可通过血行传播发生远处转移，对放／化疗均不敏感，预后较差。侵袭和转移是黑色素瘤最显著的特征和影响患者生存的首要因素，也是其治疗困难的一

4、个重要原因。所以，阐明黑色素瘤侵袭转移的机理，探索有效控制黑色素瘤侵袭和转移的途径，对进一步改善黑色素瘤疗效、防止其复发、转移和提高患者生存率均具有重要意义。近年研究表明，趋化因子受体CXCR4参与肿瘤侵袭和转移的多个关键环节。基质细胞衍生因子．1(stromalcellderivedfactor，SDF—1)与其特异性受体CXCR4所构成的SDF．1／CXCR4生物学轴在多种肿瘤播散、细胞选择性和非随意转移过程中发挥重要作用。然而，CXCR4在黑色素瘤侵袭转移过程中所起的具体作用和调控机制，以及沉默CXCR4基因对黑色素瘤侵袭和转移有何影响尚待深入研究。【目的】探讨SDF．1／CXCR

5、4信号通路在黑色素瘤侵袭和转移过程中的作用，以及利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因表达后对黑色素瘤侵袭和转移的影响及机制，以寻求一条黑色素瘤基因治疗的新途径。【方法】(1)应用Westernblot和RT-PCR检测CXCR4基因在高转移性黑色素瘤MV3细胞系中的表达，利用EnVision免疫组织化学法观察人黑色素瘤原发灶及转移组织中CXCR4的表达。(2)设计合成CXCR4特异性shRNA，将其插／X,．pSilencer质粒载体，并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株，抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测3第二

6、军医大学博士学位论文shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4mRNA表达，用FCM法检测细胞周期的分布情况，应用Westernblot法检测CXCR4蛋白变化。(3)采用Transwelld、室模型检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测黑色素瘤细胞增殖情况。(4)用MV3细胞注射构建裸鼠皮下移植瘤动物模型，评价CXCR4．shRNA瘤体内直接注射对黑色素瘤的抑瘤效应。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射方法，建立黑色素瘪定向肺转移模型，检测CXCR4基因沉默对黑色素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移能力的影响。运用RT-PCR和EnVision免疫组织化学方法检测瘤细胞株和瘤体内MMP．2表达变化。【结果】(

7、1)Westernblotting检测结果显示：MV3细胞中CXCR4的蛋白片段表达量较高；免疫组化结果显示：转移性黑色素瘤原发灶组织及转移灶内CXC4高表达。(2)成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳证实CXCR4．shRNA插入pSilence载体，成功筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆，实验组和无关对照组均有抗性细胞生长。阳性克隆测序结果表明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定