n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-v调控多药耐药小细胞肺癌的放射敏感性及机制

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文N．乙酰氨基葡萄糖转移酶．V调控多药耐药小细胞肺癌的放射敏感性及机制TheMechanismofGnT-VregulatesRadiosensitivityinMultidrugResistantSmallCellLungCancer课题来源：自选学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人贺蛟名张健教授称肿瘤学型学术型次硕士研究生院第二临床医学院2013年3月30日广州硕士学位论文N一乙酰氨基葡萄糖转移酶一V调控多药耐药小细胞肺癌的放射敏感性及机制硕士研究生：贺蛟指导教师：张健摘要一、研究背景肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。小细胞肺癌(SCL

2、C)占所有肺癌的15％左右。它的特点是快速增长，早期扩散和和对一线化疗或放疗显著敏感。然而，由于治疗过程中放化疗的耐受，目前三分之二的患者具有高复发率，随后的预后较差。虽然一些分子如Bmil、MDRl／ABCBl等与放化疗相关，但它们不能有效地应用于临床。因此，小细胞肺癌的治疗仍然具有挑战性，靶向与耐受相关的更有效的治疗的研究是必要的。细胞表面糖蛋白的异常糖基化与很多人类肿瘤高度相关。位于高尔基体内的葡萄糖基转移酶在糖蛋白的合成中起关键作用。N．乙酰氨基葡萄糖基转移酶叫一acctylglucosaminyltransferascs，GnTs)至少有6种，分别是GnT-I、GnT-

3、II、GnT-III、GnT-IV、GnT-V和GnT-VI。N．乙酰氨基葡萄糖转移酶．V叫-acetylglucosaminyltransferaseV，GnT-V)是目前研究最多的，是多支N链糖蛋白合成过程的关键酶。研究显示，GnT-V催化在N．聚糖的B1，6乙酰葡萄糖酰胺分支，通过促进细胞增殖，抑制细胞凋亡等与细胞的恶性转化相关。在一些研究中，探索了治疗耐受性和N．聚糖之间的关系。例如，用衣霉素抑制N链糖蛋白合成提高了人头颈部肿瘤细胞对顺铂的敏感性。人类胶质母细胞瘤细胞株表面蛋白糖基化的改变可降低耐药。我们的实验室曾报道下调GnT-V后人鼻咽癌CNE．2细胞在体外和体内的放

4、射敏感性增强。然而，GnT-V在多药耐药的(multidrugresistant，MDR)d'细胞肺癌细胞中的放射耐受的作用还不清楚。摘要为了进一步研究GnT-V在MDR小细胞肺癌中放射耐受的作用，建立了低表达GnT-V的SCLC亚系细胞(H69ARGnT-W1564和H69ARGnT-V／2224)。研究表明下调GnT-V显著提高了小细胞肺癌细胞对药物和放射的敏感性。此外，NF．1(B和凋亡相关分子参与了GnT-V调控放射抵抗性。这些结果表明，GnT-V可能是小细胞肺癌放化疗抵抗性的一个潜在的靶点。二、研究目的1．本实验选择人小细胞肺癌细胞株H446、H69与其多药耐药细胞株H

5、69AR作为研究对象，分析细胞对放化疗敏感性的差异。2．分析小细胞肺癌细胞株H69AR、H69与H446在蛋白水平GnT-V表达的差异，研究GnT-V是否参与多药耐药小细胞肺癌细胞株的放射耐受。3．运用shRNA将高表达GnT-V的H69AR细胞株中的GnT-V进行沉默后，检测沉默效果，观察H69AR细胞株放化疗敏感性的变化。4．阐明在多药耐药小细胞肺癌H69AR细胞的放射耐受中GnT-V的作用和其潜在的机制。三、实验方法3．1细胞系和细胞培养人的小肺癌细胞株NCI．H446，NCI．H69和耐药亚系NCI．H69AR均购自美国ATCC细胞库。H69细胞悬浮聚集生长，传代通过轻轻

6、机械吹打均匀按适当比例稀释后分装至新培养瓶中；而H69AR或H446单层贴壁生长，需要使用含0．02％EDTA的0．25％胰蛋白酶消化传代。所有细胞均常规培养在含胎牛血清(FBS)(H69AR培养基含20％胎牛血清；H69和H446细胞株培养基含10％胎牛血清)和谷氨酰胺的RPMI1640培养基中，置于37oC5％C02的孵箱中培养。高表达MRPl／ABCCl的H69AR用不含和含O．8州阿霉素(ADM)的培养基交替培养。用药物定期检查耐药株H69AR的耐药性。每周监测所有细胞的形态和生长状态。3．2CCK．8法检测药物和放射敏感性II硕士学位论文通过细胞计数试剂盒(CCK-8)

7、势!U定化疗或放疗引起的效应。抗癌药物阿霉索(ADM，中国深圳)，顺铂(DDP，中国Ijl东)和依托泊营(VP．16，中国iil5)!j；)根据说明书溶解，用5个浓度测试。药物的浓发范闭基于以．

8、j矿的研究，R在获得高度敏感和耐药细胞的IC50值(导致50％生长抑制的药物浓度)。通过赶线加速器(Clinae2300C／D，美国)给予6mVX射线放射细胞。用CCK．8水溶性四唑盐一WST@一8[2-(2．甲氧基．4．硝苯基)．3．(4．硝苯基)．5．(2，4．二磺基苯)．2H．四唑