下调n乙酰氨基葡萄糖转移酶v增强人鼻咽癌细胞cne2放射敏感性

《下调n乙酰氨基葡萄糖转移酶v增强人鼻咽癌细胞cne2放射敏感性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、硕士学位论文下调N一乙酰氨基葡萄糖转移酶一V增强人鼻咽癌细胞CNE-2放射敏感性指导教师：张健教授硕士研究生：卓恩清摘要一、研究背景鼻咽癌作为一种上皮来源的肿瘤，在东南亚尤其是我国华南地区发病率极高，达15．50／100．000。放射治疗是其最主要的治疗手段。然而，很多病人发生了放射抵抗性，一些病人往往在放疗后1．5年内就发生了局部复发或远处转移。目前研究表明，某些分子，比如gp96，GDFl5与ATlR对鼻咽癌细胞放射敏感性有着重要作用。蛋白的糖基化是最重要的翻译后修饰，其影响细胞生长，分化和肿瘤转

2、移。位于高尔基体内的N．乙酰氨基葡萄糖转移酶对蛋白糖基化起着至关重要的作用。N．乙酰氨基葡萄糖转移酶至少有6种，分别为GnT-I-VI。其中N．乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(N—acetylglucosaminyltransferaseVGnT-V)是公认的糖基转移酶家族的主要成员。研究发现，GnT-V催化形成的Bl，6葡萄糖N．糖链分支，是细胞恶性转化相关的关键结构。其通过不同的方式，如促进细胞增殖和抑制细胞凋亡参与此过程。目前的研究表明，下调N．乙酰氨基葡萄糖转移酶．V有利于全反式维甲酸诱导的人肝癌细

3、胞凋亡；然而，在神经母细胞瘤细胞中，GnT-V的抑制导致维甲酸诱导的细胞凋亡。以上的研究表明在不同的肿瘤细胞中，GnT-V扮演着不同的角色。虽然已有的研究表明，GnT-V在肿瘤的恶性潜能中起着重要作用。目前为止尚未有文献报道关于GnT-V基因对鼻咽癌放射敏感性影响方面的研究。在本实验中，我们利用干扰RNA技术，下调鼻咽癌细胞CNE．2中GnT．V的表达量，I中文摘要得到了低表达GnT-V的细胞株CNE．2GnT-V／2224。分别在体外和体内水平，通过对鼻咽癌细胞CNE．2和低表达G1lT．V的鼻咽癌

4、细胞CNE．2的放射敏感性比较，从而探索GnT-V和鼻咽癌细胞放射敏感性的关系，同时还进一步探讨其潜在的机制。二、研究目的利用RNA干扰技术，下调鼻咽癌细胞CNE．2中GnT-V的表达量，在体外及体内水平观察GnT-V对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响及其潜在的机制，为鼻咽癌放射治疗联合分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供理论依据。三、实验方法1、pGPU6／GFP／NeoCmT-VshRNA质粒的构建及鉴定已由本课题组成员完成。pGPU6／GFP／NeoGnT-V／l564和pGPU6／GFP／NeoGnT

5、-V／2224为靶向抑制GnT-V表达的质粒；pGPU6／GFP／NeoCmT-V／NC为对照质粒。2、细胞培养和转染人低分化鼻咽癌细胞株CNE．2培养于37℃5％C02条件下，含10％新生牛血清的RPMI．1640中，每周传代2"-'3次。细胞培养至对数生长期，用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入CNE．2细胞。利用G418筛选转染成功的细胞。转染成功的人鼻咽癌细胞株培养于含10％新生牛血清及2000ug／rniG418的RPMI一1640中。3、pGPU6／GFP／NeoGnT

6、-VshRNA干扰效果检测a．qRT-PCR测定GnT-VmRNA用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA，采用AMV逆转录合成cDNA．GnT-V上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGoGTTC3’，下游引物为5’TTGCTGC朋GGGTGGGTT3’。合成cDNA的反应条件为：15分钟37℃，5秒85℃。PCR的反应条件为：预变性95℃30秒，PCR反应95℃5s，60℃20s(40个循环)，溶解曲线分析95℃0秒，65℃15秒，95℃0秒。计算出2-aact，代表每组mRN

7、A的相对表达量。每组重复例数为3。b．Westemblot检测GnT-V蛋白表达Ⅱ硕士学位论文分别收集各组细胞，用预冷的的PBS洗涤，加入RIPA裂解缓冲液中提取细胞蛋白，并用标准BCA法测得蛋白总浓度。每个蛋白样品(20微克I-孑L)，用上样缓冲液匀浆后，煮沸5分钟，然后在8％SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)分离，并采用半干转移装置转移到PVDF膜上。提取总蛋白，测定蛋白浓度，吸取总蛋白，去离子水补至20“L，加入上样buffer煮沸5min，离心后吸取25pL上样，经不连续SDS．P

8、AGE电泳分离后，用半干法电转移至PVDF膜上，5％的非脂肪奶粉封闭2小时，TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗体(1：200)、兔抗人13．actin蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜，洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1：6000)，羊抗兔IgG(1：6000)，室温下摇动lh，洗膜后用ECL化学发光系统检测，暗室曝光X线片，冲洗胶片，UVI凝胶成像系统摄像，QuantityOne软件分析条带灰度值，用CmT-V／13．acti