n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-v调控多药耐药小细胞肺癌的放射敏感性与机制

《n-乙酰氨基葡萄糖转移酶-v调控多药耐药小细胞肺癌的放射敏感性与机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、硕士学位论文0Gy、6Gy放射细胞后继续培养24小时。采用术端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口术端标记法(TUNEL)原位细胞凋亡检测试剂盒，按试剂盒说明进行TUNEL实验，检测细胞凋亡时的特征性DNA链断裂。荧光显微镜下观察，随机选5个视野计数处理或转染细胞中TUNEL阳性的细胞。利用特异底物通过比色法检测Caspase．3的活性。待细胞贴壁后接受x线(0Gy、6Gy)放射后24小时。胰酶消化离心收集待测细胞，重悬细胞，冷PBS洗一次。加入细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育10分钟。裂解液16，000转离心10分钟，取上清于检测缓冲液中测定Caspase．3活性；加入Ca

2、spase-3底物Ac．DEVD．pNA37oC孵育1小时。然后用分光光度计测定在405nm的吸光值。通过比较放射组和相应的对照组的吸光值来检测Caspase-3活性的增加。3．7双萤光素酶报告基因检测NF．r,B活性为确定放射或GnT-V抑制在放射诱导的NF．r,B转录活性，细胞接种到24孔板24小时后长满70—80％。参照Lipofgctamine2000(Invitrogen，美国)说明书，共转染pNF．r,B．Luc和pRL．CMV(由澳大利亚墨尔本彼得·麦卡勒姆癌症中心的转移研究实验室馈赠)到待测细胞中。转染24小时后，0Gy、6Gy放射细胞后继续培养24小时

3、，收集细胞，裂解后检测荧光素酶的活性确定NF．r,B转录活性。荧光素酶活性检测使用的试剂盒为Dual．LuciferaseReporterAssaySystem(Promega，美国)。BertholdLumatLB9507化学发光检测仪检测萤光素酶活性。3．8细胞免疫荧光0Gy、6Gy放射细胞后继续培养24小时。NF-1出p65、Cy3标记的二抗染色待测细胞，DAPI染核。通过莱卡DMIRE2荧光显微镜(Leica，德国)观察和拍照染色细胞。分别拍摄Cy3标记染色的NF-r,Bp65和DAPI染核的图片，再将两张图片重叠组合。3．9WesternBlot分析V摘要X线

4、(0Gy，6Gy)放射细胞后继续培养24小时，收集细胞(107)。加入蛋白裂解液提取蛋白，用标准的BCA方法(BCATM蛋白检测试剂盒，美国)测定蛋白浓度。耿蛋白样品和上样缓冲液，离心混合后煮沸5min，离心后吸取依次上样，同一实验不同上样孔之间蛋白含量相等(20lag／孑L)。lO％SDS一聚丙烯酰胺凝胶(SDS．PAGE)电泳分离蛋白，并半干电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5％脱脂奶粉37oC封闭PVDF膜2小时。一抗(Bd．2、Bax一抗稀释浓度为1：200，Bcl．xl稀释浓度为1：300，均购自美国SantaCruz公司；GAPDH蛋白单克隆抗体稀释浓度l

5、：1000，购自中国Abmart公司)与PVDF膜4oC孵育12小时，TBST(10mMTris，pH值8．0，150mMNaCI和0．1％吐温20)洗膜。通过与辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体稀释浓度1：4000，购自北京博奥森生物科技有限公司)室温孵育45分钟，再次洗涤。增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ECL)显影，在PVDF膜上面覆盖X-线胶片，根据发光情况曝光数秒至数分钟，冲洗胶片。QuantityOne软件分析条带强度。3．10统计学分析至少三次独立重复实验的结果用均数4-标准差来表示。两个样本之间均数的比较用Student’s

6、t检验，多组进行统计比较使用单向方差分析(ANOVA)，多重比较用最小显著差异法(LSD)。结果分析P

7、6细胞在任何放射剂量时的存活率显著降低(P<0．05)。结果表明耐药株H69AR细胞对放射抵抗。VI硕士学位论文4．2比较小细胞肺癌细胞中GnT-V的表达qRT-PCR法和WesternBlot法评估了H69AR、H69细胞和H446细胞中GnT-V的mRNA和蛋白表达水平。结果显示与H69或H446细胞相比，H69AR细胞中GnT-V的mRNA和蛋白表达量显著升高(P<0．05)。H69AR细胞高表达GnT．V和对放化疗抵抗，这表明GnT．V可能参与小细胞肺癌的放化疗抵抗。4．3通过GnT-VshRNA建立低表达GnT-V的H69AR为