促泌素参与调节小细胞肺癌多药耐药性的分子机制研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文促泌素参与调节小细胞肺癌多药耐药性的分子机制研究ThemolecularmechanismthatSecretagogin(SCGN)regulatesthemulti-drugresistanceinsmallcelllungcancer课题来源：自选学位申请人白义凤导师姓名郭琳琅、郭洪波专业名称肿瘤学培养类型学术型培养层次博士研究生所在学院第二临床医学院2013年3月29日广州博士学位论文促泌素参与调节小细胞肺癌多药耐药性的分子机制研究博士研究生：白义凤指导教

2、师：郭琳琅、郭洪波教授摘要研究背景肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，是导致死亡的主要原因。小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)是支气管肺癌中未分化癌分型，约占全部肺癌的15％。由于较早发生较强的侵袭性和早期发生血行转移及淋巴转移，预后极差。小细胞肺癌的治疗以放化疗为主，虽然早期对一线化疗方案(足量EP方案：依托泊式或伊立替康+顺铂／卡铂)敏感，但由于极易出现多药耐药(multidrugresistance，MDR)现象而导致治疗失败。MDR导致的小细胞肺癌复发率很高，临床预

3、后差，因此，多药耐药已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的重要问题之一。课题组通过基因表达谱芯片对小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中21，522个基因进行分析，结果发现H69AR细胞中包含促泌素(SCGN)在内的1252个基因表达上调，1131个基因表达下调，免疫组化发现SCGN在小细胞肺癌组织中的表达较正常肺泡上皮的表达增高。促泌素(Secretagogin，SCGN)是新近发现的一种新型的EF钙结合蛋白，包含6个并行的EF．hand钙结合结构域，属于钙结合蛋白感受器家族。近年的

4、研究显示，SCGN为一种神经内分泌标记物，除在正常神经内分泌组织和脑组织中有表达外，在神经内分泌源性肿瘤中也呈高表达，如具有神经内分泌功能的胰腺癌，前列腺癌，。肾上腺瘤，垂体腺瘤和结肠癌以及一些类癌和类癌转移的肿摘要瘤。虽然最近的研究表明，EF钙结合蛋白参与多种细胞生物学过程，包括细胞周期调控、增殖、凋亡、转录和分泌调节等过程。然而，据我们所知，SCGN在小细胞肺癌耐药性中的作用目前国内外尚未见相关研究。miRNAs是近年来在真核生物中发现的一类由18．24个核苷酸组成的非编码RNA，代表了一个新

5、层次的基因表达调控方式，为癌症分子机制的研究提供了新的机遇。主要通过转录抑制或降解转录产物在转录和转录后水平调节靶基因的表达。大约50％得到注解的miRNA在基因组上定位于与肿瘤发生相关的区域和脆性位点，可能发挥着癌基因和抑癌基因的双重作用。miRNA在多种J下常组织与癌组织之间的差异表达谱，表明miRNA在影响肿瘤的分类和疗效预测中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明miRNA在调节肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药方面发挥着重要作用，如miR．21，miR．195，miR．455．3p和miR．10a与

6、胶质瘤的发生、发展和多药耐药密切相关。而miR．128．2，miR．494的表达与非小细胞肺癌细胞耐药性的形成有关。我们采用miRNA芯片比较分析小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中miRNAs的表达谱差异性，结果发现miR．494在SCLC多药耐药株H69AR中的表达较敏感细胞株H69中降低，然而关于miR-494在小细胞肺癌多药耐药中的作用及其分子机制，目前尚未见相关报道。进一步通过生物信息学分析发现促泌素(SCGN)可能是miR-494的潜在靶基因之一。本课题的研究目的为探讨mi

7、R．494与SCGN在小细胞肺癌多药耐药中的作用及其相互关系，进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制，为小细胞肺癌耐药的研究提供依据，为解决临床棘手的小细胞肺癌耐药问题提供一种新策略。材料和方法1．临床标本收集收集2008．1至2011．8间在南方医科大学附属珠江医院接受治疗的77例小细胞肺癌石蜡包埋标本和42例SCLC患者化疗前后血液标本，组织标本为小细胞肺癌纤维支气管镜检查及活检组织，经病理学检查确诊为小细胞肺癌，所有组织标本患者均尚未接受放化疗治疗，血液标本为患者化疗前后的标本。本研究经珠江医院

8、伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。II博士学位论文2．细胞培养人小细胞肺癌敏感细胞株NCI．H69和耐药细胞株NCI．H69AR均购自美国ATCC。分别采用含10％和20％胎牛血清和青链霉素双抗的RPMI1640培养基，在37℃，5％C02、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验。实验前耐药细胞株至少在不含药物的培养基中培养2周。3．细胞转染细胞瞬时转染：采用阳离子脂质体法进行，miR-494模拟物、抑制剂、阴性对照(miRNA的转染量均为100nmol／L)