土茯苓多糖的提取分离、结构表征及抗炎活性的研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名僭．支幺’同期：加伽年岁月矽同关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版

2、，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名丝论文导师签名同期：加缈年厂月罗闩摘要目的：土茯苓，又名刺猪苓，是一种可入药又可作为食料的植物根茎，在我国分布于长江流域以及南各省区，北到甘肃，西至云南，南达海南、台湾等地。土茯苓为菝葜属，性甘平，具有利湿热、解毒、通利关节的功效，因其富含淀粉，可用来酿酒或制糕点。目前对土茯苓的研究主要是对黄酮类为主的小

3、分子物质进行药理研究以及土茯苓的工艺优化，对土茯苓多糖等大分子物质的研究甚少。本文以土茯苓为原料，对土茯苓多糖进行提取工艺，提取分离纯化、结构表征及抗炎活性等方面进行了相关研究，为开发此药拓宽了思路，也为临床治疗提供了研究依据。方法：1．本文通过对提取温度，提取时间，料液比以及提取次数的因素考察，以单因素试验和响应面法优化土茯苓多糖的最佳提取工艺。2．按照最佳提取工艺提取对土茯苓多糖进行乙醇醇沉，Sevag法除蛋白、色素和SephadexG-150凝胶层析柱进行分离纯化。3．通过对纯化分离出的多糖

4、部位进行相对分子质量测定、单糖组成测定，初步研究其结构表征。4．抗炎活性研究a．MTT法检测土茯苓多糖对RAW264．7巨噬细胞生长的影响；b．Griess法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264．7巨噬细胞释放NO的影响；C．ELISA法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264．7巨噬细胞释放TNF—Q的影响；d．RT—PCR法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264．7巨噬细胞IL一6、TNF-Q及iNOSmRNA达的影响；e．WesternBlot法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264

5、．7巨噬细胞NF—KB和MAPK信号通路的影响。结果：1．单因素结果表明，最佳提取次数为3次，最佳提取温度(℃)为90。C，最佳提取时间(h)为2h，最佳料液比(g／m1)为1：35，响应面分析的提取最佳工艺条件为：提取温度为88。C，提取时间为2．3h，料液比为1：36，最佳工艺的多糖得率平均值为6．41％。2．在土茯苓多糖最佳提取工艺条件下提取的多糖通过乙醇醇沉，Sevag法除蛋白、色素和SephadexG一150凝胶层析柱纯化分离得到两个多糖部位tfl-1和tfl-2。3．本文通过平均分子质

6、量测定和单糖组成测定，求出多糖tfl一1的平均分子质量为377Kd，tfl一2的平均分子质量244Kd，确定tfl-1和tfl-2均由鼠李糖(Rha)和半乳糖(Glc)2种单糖组成。4．生物活性结果显示，多糖tfl一1和tfl-2对RAW264．7巨噬细胞生长没有抑制作用，对LPS诱导的RAW264．7巨噬细胞N0和TNF—Q的分泌具有一定抑制作用，能够抑制RAW264．7巨噬细胞IL一6、TNF—Q和iNOSmRNA的表达，并对MAPK信号通路相关的P-JNK、P-ERKl／2蛋白的表达也有抑制

7、作用。结论：本论文通过对土茯苓多糖的提取工艺研究，得出了可以用来预测和分析土茯苓多糖提取工艺的模型，并通过回归方程得出土茯苓多糖的最佳提取工艺；按照最佳提取工艺，通过提取、分离、纯化方法，得到的土茯苓多糖部位tfl—l和tfl-2相对分子质量均一，纯度较高；结构表征研究发现此2种多糖部位不是同一种多糖。土茯苓多糖tfl一1和tfl一2对巨噬细胞生长无抑制作用，可以抑制巨噬细胞分泌N0和TNF-Q，具有良好的抗炎活性，而这种活性可能与抑制IL-6、TNF-Q和iNOSmRNA的基因表达和抑制MAPK

8、信号通路相关的P—JNK、P-ERKl／2蛋白的表达有关。关键词：土茯苓；多糖；提取分离；结构表征；生物活性；Separation，structureandanti—infIammatoryeffectstudyofpoIysaccharidesfromsmilaxglabraRoxbSpeciaIty：PharmacyAuthor：CHENWenIongTutor：CHENYanfenAbstractPurposeSmilaxglabraRoxb，alsoknownasthorn