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1、糖化血红蛋白检验张艳影杨静(哈尔滨市红十字中心医院150010)【中图分类号】R185【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)35-0421-02【关键词】糖化血红蛋白血糖检验(一)离子交换层析法1.原理用偏酸缓冲剂处理Bio-Rex70阳离子交换树脂，使之带负电荷。它与带正电荷的Hb有亲和力。HbA及HbA,均带正电荷，由于HbAl的两个β・链N■末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA少，两者对树脂的附着力不同。用PH6.7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbAl洗脱下来，用分光光度计测
2、定洗脱液中的HbAl占总Hb的百分数。2.试剂(1)0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:称取无水Na2HPO428.396g,溶于蒸憾水中，并加蒸镭水至1L(即试剂1)。(2)0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:称取NaH2PO4?2H2O31.206g,溶于蒸憾水中，并加蒸憾水至1L(即试剂2)。⑶溶血剂：pH4.62,取25ml试剂2,加0.2mlTritonX-100,加蒸偲水至100mlo(4)洗脱剂1(磷酸盐缓冲液，pH6.7)：取100ml试剂1150ml试剂2于1000ml容量瓶内，加蒸倔水至1L。(5)洗脱剂II(磷酸盐
3、缓冲液pH6.4)：取300ml试剂1及700ml试剂2,加蒸《留水300ml,混匀即成。(6)Bio-Rex70阳离子交换树脂，200〜400目，钠型，分析纯级。3.操作⑴树脂处理：称取Bio-Rex70阳离子交换树脂10g,加O.lmol/LNaOH溶液30ml,搅匀，置室温30分钟，期间搅拌2〜3次。然后加浓盐酸数滴，调至pH6.7,弃去上清液，用约50ml蒸憎水洗1次，用洗脫剂II洗2次，再用洗脱剂I洗4次即可。(2)装柱：将上述处理过的树脂加洗脱剂I,搅匀，用毛细滴管吸取树脂，加入塑料微柱内，使树脂床高度达30〜40m
4、m,树脂床填充应均匀，无气泡、无断层。⑶溶血液的制备：将EDTA抗凝血或毛细管血20μl,加于2.0ml生理盐水中，摇匀并离心，弃去上清液，仅留下红细胞，加溶血剂0.3ml,摇匀，置37°C水浴中15分钟，以除去不稳定的HbAI。(4)柱的准备：将微柱颠倒摇动，使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入15mm×150mm的大试管中，让柱内缓冲液完全流出。(5)上样：用微量加样器取100μl溶血液，加于微柱内树脂床上，待溶血液完全进入树脂床后，将柱移人另一支15mm×150m洁净的空试管中。⑹层析洗
5、脫：取3.0ml洗脫剂I,缓缓加于树脂床上，注意勿冲动树脂，收集流出物，此即为HbAl(测定管)。(4)对照管:取上述溶血液50μl,加蒸憾水7.5ml摇匀,此即为总Hb管。⑻比色：用分光光度计，波长415nm,比色杯光径10mm,以蒸镭水作空测定各管吸光度。(9)微柱的清洗和保存:用过的柱先加洗脫剂II3.0ml,使Hb全部洗下，再用洗脱剂I洗3次，每次3.0ml,最后加洗脱剂I3.0ml,加上下盖，保存备用。1.计算HbAl(%)二测定管A/(对照管A×⑸×100%。2.参考值成人HbAl(%)：
6、均值6.5%；范围5.0%〜8.0%。(二)亲和层析法1•原理用于分离糖化与非糖化Hb的亲和层析凝胶柱，是交联间■氨基苯硼酸的琼脂糖珠。2.试剂⑴洗涤缓冲剂(washbrffer,WB)：含250mmol/L醋酸钱、50mmol/L氯化镁、200mg/L叠氮钠，调节至pH8.0,贮于室温。⑵洗脫缓冲剂(elutionbuffer,EB)：含200mmol/L山梨醇、100mmol/LTris、200mg/L叠氮钠，调节至pH8.5,贮于室温。(2)0.1mol/L及1mol//L盐酸溶液。3操作(1)标本采集：EDTA或肝素抗凝
7、，静脉采血，充分混匀后置4°C可保存1周。⑵溶血液的制备：将抗凝全血离心，吸去血浆、白细胞及血小板层，吸100μl压积红细胞至小试管中，加2ml蒸憾水充分混匀，静置5分钟后,重新混匀后离心，上清液应清亮。⑶层析柱准备：层析柱装0.5ml固相凝胶(glycol-gelB),保存于4°C,防止直射阳光。如凝胶变为紫红色应弃去，测定前取出置室温，拔去顶塞，倾去柱中液体，再除去底帽，将层析柱插入试管中，加2ml洗涤缓冲剂(WB),让洗涤液自然流出并弃去，当液体水面在凝胶面上成盘状时即停止。(3)非结合部分(NB)的洗脱：将上述经平
8、衡洗涤过的层析柱插入15ml×150mm标为“NB”的试管中。加50μl清亮的溶血液至盘状液面的顶部，让其流出。加0.5mlWB液，让其流岀。此步应确保样品完全进入凝胶。加5mlWB液，让其流岀。以上洗脱总体积应为5.55ml,混合。(4)结合
