rna干扰p70s6k表达对食管鳞癌ec9706细胞影响的体内外研究

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterInviroandinvivostudyofp70S6KknockdowninesophagealsquamouscarcinomacellEC9706By：WeijuanBeiSupervisor：Pro￡GuiqinHouPharmacology一一SchoolofpharmaceuticalSciencesApril2013原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是

2、本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库

3、进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日本研究由国家自然科学基金(No．30901778)资助在此深表感谢摘要背景与目的食管癌是一种由食管鳞状上皮或腺上皮异常增生导致的恶性肿瘤。不同国家与地区食管癌的发病率不一。据统计，世界上每年约有20万人死于食管癌。在我国因肿瘤死亡的人数最多的是胃癌，其次就是食管癌。对于食管癌的治疗手段主要是放

4、射治疗、化学治疗及手术切除。目前，除在癌症发生的早期阶段切除肿瘤组织能达到根治外，其他的治疗效果并不理想。但是，人们尚未完全弄清楚食管癌确切的发病机制，这使得食管癌的早期诊断与抗肿瘤药物的研发面临着巨大的挑战。目前，已有报道mTOR信号通路在食管癌细胞中是异常激活的，推测也许可以从mTOR通路中寻找到食管癌分子治疗的靶点。现在很多研究都集中于mTOR分子，因为雷帕霉素可以直接与其结合，抑制该通路的激活，阻滞细胞周期并诱导细胞产生凋亡。但是mTOR分子量较大(289kDa)，与其作用的蛋白也较多，因此，我们选择了m

5、TOR最重要的下游底物之一p70S6K作为研究对象，利用RNA干扰其表达，通过体内外方法检测干扰前后食管癌细胞对雷帕霉素的敏感性变化，为食管鳞癌的基因治疗提供实验依据。方法1．以p70S6K为研究对象，用WesternBlot方法从Ecal09、EC9706、KYSR450、TE．1四株食管癌细胞中筛选出p70S6K及P．p70S6K蛋白表达较高的细胞株，然后将p70S6K特异性小片段干扰RNA(p70S6K-siRNA)转染高表达的细胞，通过RT-PCR分析siRNA对细胞@p70S6K的干扰效果，并用MTT法

6、及流式细胞术分别分析干扰前后雷帕霉素对细胞增殖及细胞周期的影响。2．采用p70S6K-shRNA质粒转染EC9706细胞，经嘌呤霉素筛选得到稳定表达细胞株。通过RT-PCR方法及荧光显微镜检测其干扰效果，然后采用MTT法检测干扰p70S6l湔后雷帕霉素对EC9706细胞增殖的影响。3．将转染p70S6K-siRNA的EC9706细胞、能稳定表达p70S6K-shRNA的EC9706细胞和EC9706细胞分别接种至裸鼠体内，建立动物模型。除对照组外，其余各组用雷帕霉素或顺铂连续治疗18天，记录荷瘤裸鼠体重及肿瘤体积

7、变化，摘要计算抑瘤率。另外，利用WesternBlot方法检测不同治疗后肿瘤组织qbp70S6K及P．p70S6K蛋白表达的变化。结果1．EC9706细胞qbp70S6K及P．p70S6K蛋白表达相对较高，转染p70S6K-siRNA后，p70S6KmRNA及蛋白的表达水平随着转染时间的增加而降低。与各自的对照组相比，转染后的细胞更多地被阻滞在G1期，并且雷帕霉素对转染后细胞的增殖抑制作用更加明显。2．与未转染的细胞和转染对照shRNA的细胞相比，转染p70S6K-shRNA的细胞qbp70S6KmRNA的表达明

8、显降低。p70S6K-shRNA稳定表达株的细胞形态发生了明显的变化：细胞变得更细长，并呈现不规则的长梭形。此外，转染p70S6K-shRNA后，雷帕霉素对细胞增殖的抑制作用更加明显。3．体内实验中，EC9706雷帕霉素单独治疗组能明显抑制肿瘤生长，p76S6K-siRNA组对肿瘤生长抑制作用不太明显，但二者联用肿瘤生长最慢，效果最好。]而p70S6K-shRNA组肿瘤生