shrna对食管鳞癌ec9706细胞p70s6k1表达影响

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1、中文摘要shRNA对食管鳞癌EC9706细胞p70S6KI表达的影响郑州大学第一附属医院肿瘤学中国郑州450052食管鳞癌是我国北方最常见的消化道恶性肿瘤之一，尤其是河南省林县发病率最高。手术治疗、化学治疗、放射治疗以及生物治疗为主的综合治疗，使食管癌治疗有了较快的发展。但是，食管鳞癌发生的确切机理仍然不清楚。因此，如何提高食管鳞癌的早期诊断率，以及抗肿瘤药物的开发仍然是个巨大的挑战。70kDa核糖体S6激酶l(70kDaribosomalS6kinasel，p70S6K1)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋I

2、兰t(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)的一个重要的下游靶蛋白，能够调节肿瘤细胞生长、周期进展和存活。在细胞信号通路网络中发挥着复杂的作用。当前研究的热点主要是mTOR抑SfJ齐U，现在有多种mTOR抑SfJ齐U已经进入临床试验，并取得了初步成效。mTOR抑制剂也能够改变肿瘤的放化疗敏感性。而针对p70S6K1的阻断策略的研究还很少，且p70S6K1的活化水平与mTOR抑制剂的敏感性的关系还有待进一步研究。因此，本课题试图构建p70S6KI特异性抑制的短发夹RNA(sh

3、orthairpinRNA，shRNA)表达载体，并检测其对食管鳞状细胞癌细胞(Esophagealsquamouscellcarcinomacell，ESCCC)株EC9706细胞p70S6K1mRNA和磷酸化p70S6K1(phosphatedp70S6K1，p-p70S6K1)蛋白表达的影响，而能够选择出干扰效果较好的p70S6K1特异性shRNA表达载体，为进一步研究p70S6KI在细胞内的生物学功能提供有效地工具。，方法IshRNA表达载体构建根据siRNA设计原则，在Ambion公司网站

4、设计并选取3个p70S6K1特异性靶序列，而设计合成正反义DNA片段，3’端添加5个T，作为RNA聚合酶III的终止子，两端加酶切位点。合成的正反义65nt寡核苷酸链经退火形成双链DNA中文摘要(doublestrandDNA，dsDNA)，并与线性的pSIREN-RetroQ—DsRed—Express载体连接，得到重组质粒，分别命名为plshRNA-p70S6KI、p2shRNA—p70S6K1和p3shRNA—p70S6KI。转化感受态细菌，在氨苄抗性培养基中37℃过夜培养，挑取阳性克隆，送菌

5、液测序鉴定。2转染EC9706细胞根据LipofectamineTM2000转染试剂说明书步骤，将重组质粒plshRNA-p70S6K1转染EC9706细胞。实验分两组①对照组(无质粒脂质体转染)：②实验组(质粒转染组)；转染24h时在荧光显微镜下观察红色荧光表达。3RT-PCR应用RT-PCR实验分别检测转染后24、48、72、96和120hp70S6KImRNA表达的变化情况，实验重复三次。4Westernblotting一采用Westernblotting实验检测转染后24、48、72、96和

6、120hp-p70S6K1表达的变化情况，实验重复三次。5图像处理和统计学分析使用图像处理软件IPP5．0．2对RT-PCR和Westernblotting实验图片进行灰度值分析。应用SPSS10．0软件，采用单因素方差分析方法(one．wayANOVA)，雅

7、ss载体连接序列与设计序列完全相符。2荧光表达重组质粒转染EC9706细胞24h后，在荧光显微镜下观察到红色荧光表达。3RT-PCR结果与对照组相比，p70S6KImRNA表达在转染后24h、48h和72h下调(P值均

8、H中文摘要讨论本研究应用RNA干扰技术构建p70S6K1特异性干扰载体。实验已经初步证实：所构建得p70S6K1特异性shRNA表达载体，转染食管鳞癌细胞株EC9706细胞后，能够在mRNA水平和蛋白水平对p70S6K1表达实现抑制。这就为我们进一步研究p70S6K1在细胞中的复杂作用提供了工具。转染食管癌细胞后p70S6KI的表达从mRNA水平和蛋白水平都经历了先下降，至48h是降至最低，后又上升至对照组水平。在这个过程中可能是由于随着转染时间的推移，转染进入细胞的