pten表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系ec9706

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1、PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706作者：侯桂琴，鲁照明，薛乐勋，田芳，范天黎，刘兰琦，许培荣【摘要】目的筛选稳定表达野生型PTEN基因的食管鳞癌细胞株EC9706。方法提取胎盘总RNA，设计引物，PCR扩增人野生型PTEN基因，经测序鉴定后，连接于pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建pcDNA3.1PTEN，用脂质体介导的方法将其转染EC9706。而后加抗生素G418筛选稳定表达株，用RTPCR方法检测稳定表达株PTEN基因的mRNA水平，通过绘制生长曲线观察细胞生长情况。结果PCR产物的电泳结果显示，在1500bp左右有一明显亮带，测序结果与Ge

2、nBank上PTEN序列完全一致；稳定表达PTEN基因的细胞株RTPCR结果显示，PTEN的mRNA水平比对照细胞株相比明显升高；生长曲线结果显示，转染后的细胞生长速度明显减慢。结论所扩基因为野生型PTEN基因，所构建的载体为野生型PTEN基因真核表达载体，并筛选出PTEN基因稳定表达的食管鳞癌细胞株。【关键词】PTEN；食管鳞癌；mTOR；转染14　　Abstract：ObjectiveToestablishstableexpressioncelllinetransfectedwitheukaryoticexpressionvectorofPTEN.MethodsTocl

3、onethewildtypePTENgene,totalRNAwasisolatedfromhumanplacentatissues.AcDNAofhumanPTENwasobtainedbyoptimizedRTPCRandsequenced,andthenthecDNAfragmentwasputintotheeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1(+)toconstructpcDNA3.1PTEN.CellsofesophagealsquamouscellcancercelllineEC9706weretransferredwith

4、pcDNA3.1PTENusinglipofectamine.ThestableexpressioncellswerescreenedbyG418.RTPCRandgrowthcurveweredoneforidentifyingthescreenedcells.ResultsThecDNAfragmentproducedbyRTPCRhad100%homologywithwildtypePTENgenesequenceonGenBankbyBLAST.ThemRNAlevelofPTENincreasednotablyinthecelllinewescreened

5、,andthegrowthofthecelllinewasverysolelycomparedwithcontrolcelllines.ConclusionBecauseofcellsofesophagealsquamouscellcancerwhichstablyexpressPTENweresuccessfullyscreened,itisconcludedthataPTENeukaryoticvectorforstableexpressioninesophagealsquamouscellcancercelllinehasbeenconstructed.14　　Keyw

6、ords：PTEN；Esophagealcancer；mTOR；Transfection　　0引言mTOR(Mammaliantargetofrapamycin)是一种进化上高度保守的丝/苏氨酸蛋白酶。越来越多的证据显示，mTOR信号转导在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，其通路的异常与多种恶性肿瘤有关[1]，已成为肿瘤治疗的新靶点[2,3]，雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂[4]。抑癌基因PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosome10)是1997年发现并被克隆的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,并被

7、证实与十几种人类肿瘤的恶性增殖和转移有关[5]。据报道，PTEN的缺失或突变可以使mTOR信号通路异常激活[6,7]。目前国内对PTEN的研究仅集中在肿瘤中PTEN蛋白的表达情况，PTEN基因突变检测及PTEN基因的抑癌效果方面[8,9]，而其表达水平变化对mTOR通路的影响及其引起的细胞对雷帕霉素敏感性的变化在国内外均未见报道。由于河南省是食管癌的高发区,故本研究以食管鳞癌为研究对象，从胎盘中克隆野生型PTEN基因，构建真核表达载体并转染食管癌细胞，筛选出稳定的表达株，为进一步研究PTEN与mTOR通