cea sirna载体的构建和转染人食管癌ec9706细胞的沉默作用论文

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1、CEAsiRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用论文【摘要】目的：应用RNA干扰技术，构建针对CEA的siRNA载体，抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法：依据设计siRNA的原则，针对人CEA的mRNA序列，设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列，经退火成互补双链，克隆入载体pRNATU6.2中构建重组体pRNATU6.2CEA，筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中.freelRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论：成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体，可有效抑制C

2、EA的表达，为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.【关键词】EC9706细胞系干扰RNA癌胚抗原0引言CEA（carcinoembryonicantigen）属于非器官特异性肿瘤相关抗原，它不仅作为一种单纯的肿瘤标志物存在,而且是与肿瘤恶性化有关的一种复杂的分子.但目前对于CEA分子水平的研究主要集中在肿瘤治疗前、治疗中、治疗后CEA表达的变化及其与肿瘤诊断、治疗、预后的关系［1-3］.CEA与肿瘤的发生发展及转移有无内在联系，对治疗过程有什么影响，文献中未见深入报道.本研究利用RNA干扰技术，构建针对CEA的小分子干扰RNA(smal

3、linterferingRNA,siRNA)表达载体，并转染EC9706细胞，旨在实现对CEA表达的抑制，为进一步从分子水平探讨CEA功能及对治疗的影响打下基础.1材料和方法1.1材料人食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠.大肠杆菌Top10,pRNATU6.2质粒由郑州大学免疫与微生物教研室提供.限制性内切酶、逆转录酶、RealTimePCR扩增试剂盒均为TaKaRa产品.鼠抗人CEA及βactinmAb和酶标羊抗鼠IgG为Sigma公司产品.CEA基因RNAi寡核苷酸，CEA基因和βactin

4、基因PCR引物均由上海生物工程公司合成测序.1.2方法1.2.1引物设计在GenBank中查找人CEA的mRNA全序列，通过Blast软件确定与其它非相关基因无同源性，按照pRNATU6.2载体的要求设计编码siRNA的寡核苷酸链.设计的siRNA两对寡核苷酸序列如下：SCEA1上游引物为5′TGATGGCAACCGTCAAATTATTCAAGAGATAATTTGACGGTTGCCATCTTTTTTC3′，下游引物为5′TCGAGAAAAAAGATGGCAACCGTCAAATTATCTCTTGAATAATTTGACGGTTGCCAT

5、CA3′；SCEA2上游引物为5′TGATGTAGGACCCTATGAGTTTCAAGAGAACTCATAGGGTCCTACATCTTTTTTC3′，下游引物为5′TCGAGAAAAAAGATGTAGGACCCTATGAGTTCTCTTGAAACTCATAGGGTCCTACATCA3′.RealTimePCR一对引物5′ACCACAGTCACGACGATCAC3′，5′CGCTGTGGTCAACACTTAAT3′.1.2.2siRNA表达载体的构建将合成的寡核苷酸单链稀释后退火成双链，连接到siRNA载体pRNATU

6、6.2，将重组载体转入感受态细菌（Top10），筛选，PCR验证后提取质粒，并做双酶切和测序鉴定.1.2.3细胞转染取pRNATU6.2SCEA1，SCEA2重组体及空载体分别转染对数生长期的EC9706细胞，转染方法参照LipofectamineTM2000转染试剂操作说明进行，转染24h后用G418(浓度400mg/L)筛选，待细胞稳定后收集，同时收集同批未进行转染的EC9706作为阴性对照，分别命名为干扰1组、干扰2组、空载体组及对照组.1.2.4RealTimePCR分析Trizol法提取转染细胞和对照细胞的总RNA（方法按试剂盒说

7、明），逆转录合成cDNA第一链（Gbico公司反转录试剂盒及说明）.标准曲线的建立：将βactin质粒标准品原液按梯度稀释成0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625拷贝/L.使用RealTimePCR扩增仪进行荧光定量PCR检测，反应条件中加入溶解曲线的制备.1.2.5arker加10μL，电泳；染色和脱色，切胶.电转；封闭，加1抗孵育，TBST洗后加酶标2抗；TBST洗后，显影，定影；用βactin作内参照验证蛋白的含量.统计学处理：组间比较采用单因素方差分析，P0.05认为差异有统计学意义.2结果2.1重组体鉴定结果2

8、.1.1酶切鉴定重组质粒经限制性内切酶双酶切后得到大于2000bp的条带和小于100bp的条带，与质粒和目的条带的大小相符(图1).1：pRNATU