rnai沉默食管癌ec9706细胞dna聚合酶β表达的初步的研究

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1、郑州大学2007届硕士学位论文中文摘要RNAi沉默食管癌EC9706细胞DNA聚合酶p表达的初步研究研究生孙萨迦导师董子明教授郑州大学基础医学院病理生理教研室郑州450052摘要背景肿瘤的发生发展是环境因素与宿主因素相互作用的结果，细胞对致癌物的敏感性和自身突变的修复能力直接影响细胞癌变的几率。DNA聚合酶B(DNApolymerase[3)是一条39KD的单条肽链小分子蛋白质，该聚合酶高度保守，结构上可分为两部分：8KD的氨基末端和31KD的羧基末端。DNApoll3被认为主要是在碱基切除修复(baseexcifionrepair,BER)的过程中填

2、补单核苷酸缺口，包括短片段BER和长片段BER，是目前DNA聚合酶中错配率最高的一种酶，并且在氧化损伤的过程中发挥重要作用。由于DNA聚合酶[3(DNApolp)在催化碱基时的高错误率，故它的表达水平过低、过高、或突变的形成都可引起遗传的不稳定性，造成突变积累，促使细胞的癌变。DNAPol8的高表达干扰了体内多种修复系统，从而导致DNA突变率和癌症易感性增加；高表达的DNApoll3与肿瘤细胞耐药性以及基因组不稳定性有一定关系。DNApoll3缺陷会降低细胞的DNA碱基切除修复(BER)能力，导致对甲基甲磺酸(MMS)的高敏感性，同时甲基甲磺酸或氧化剂

3、等均可诱导DNAp0113的表达。除了在碱基切除修复中发挥作用外，DNApol[，还涉及细胞周期和细胞分化，可能参与DNA复制、重组、与基因组稳定性的维持、癌细胞对某些药物的耐药性等有关。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，在基因功能研究和郑州大学2007届硕士学位论文中文摘要基因治疗方面已经显示了巨大的应用前景。目的本研究旨在探讨RNA干扰表达载

4、体(smallinterferenceRNAexpressionvector)对食管癌EC9706细胞中DNApoll3基因的抑制作用，通过肿瘤细胞体外实验了解siRNA表达载体能否沉默食管癌细胞中DNApoll3基因及沉默效果，为今后提高肿瘤细胞对药物的敏感性提供了理论依据和实验依据。实验方法利用Invivog既l公司提供的计算机设计软件，根据DNApolpcDNA编码序列0v113140)，从DNApolpmRNA基因中选择2段19个碱基的特异性序列GGAAG邢TAGAl’GAAGG和1肖rGAGAGCTCATGCCAAG，分别设计2对66nt的寡

5、核苷酸；每对66nt寡核苷酸退火后形成两端各带BglII和nindm酶切位点的双链；分别将STLI(退火形成的双链DNA片断siRNApolIM48)、STL2(退火形成的双链DNA片断siRNApolJ3954)用2．O％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，；分别与pGEM·Teasy载体连接，得到克隆重组子pGEM-T-STL2和pGEM-T-STLl；用T4连接酶将目的片段pGEM-T-siRNApol[M48和pGEM-T-siRNApoIp954与线性化的表达载体pSuper．gfp／neo连接；利用PCR扩增法筛选鉴定得到重组的siRNA表达载体pS

6、uper．gfp／neo-siRNApolJM48和pSuper．gfp／neo·siRNApollB954，并对其进行DNA序列分析。将表达载体pSuper．gfp／neo-siRNApoll3448和pSupcr．gfp／neo-si鼢妊polp954以及空白载体pSupcr．gfp／nco分别转染入食管癌EC9706细胞中，用荧光定量PCR方法检测未转染细胞与转染细胞中DNApolpmRNA表达水平的变化；用流式细胞仪检测未转染细胞与转染细胞的细胞周期变化；用台盼蓝拒染实验检测顺铂、博莱霉素、甲基蓝、双氧水影响下未转染细胞与转染细胞死亡比率的变化

7、。实验结果1．遵循siRNA片段的设计原则，最终确定DNApollM48-466位(GG从Gr兀’G1AGATGAAGG)和954．972位(CCTTCArCl'ACAAACTTCC)为靶序列。2．siRNA表达质粒载体pSuper．gfp／neo-siRNApolB448和n郑州大学2007届硕士学位论文中文摘要pSuper．gfp／neo-siRNApol[B954经bglII和hilldm双酶切后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定出现特异性条带，与预先估计的片断大小一致。3．转染后的EC9706细胞在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在细胞内广

8、泛表达，经G418筛选得到稳定表达的细胞。4．DNA聚合酶p基因的mRNA表达水平在转染靶向s