dna聚合酶β、gst-π基因表达调控对食管癌细胞耐药性作用论文

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1、郑州大学硎届博士学i安论文中文摘要DNA聚合酶p、GST-冗基因表达的调控对食管癌细胞耐药性的作用博士研究生：李敏导师：董子明郑州大学基础医学院河南郑州450052摘要食管癌是中国(尤其河南省林州市及辉县)最常见的恶性肿瘤之一，该地区食管癌的发病率、死亡率均极高。化疗是食管癌主要的I临床治疗手段之一，然而肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance，MDR)现象的产生常影响化疗药物的疗效，MDR是导致肿瘤化疗失败的主要原因，资料表明，90％以上肿瘤患者的死因与MDR有关。MDR指的是肿瘤细胞在接触某一种化疗药物后，不仅对此种药物产生耐受性，而且对其它的结构和

2、功能不同的多种药物也产生交叉耐受性。MDR是恶性肿瘤难治和复发的重要原因之一，是肿瘤细胞在生存压力之下建立起来的一种适应过程。肿瘤细胞可以通过多种机制产生MDR，如细胞膜上表达的药物排流泵通过泵机制把药物从细胞内排出细胞外、细胞解毒能力的增强(如谷胱甘肽转移酶GST-n)、DNA修复能力的增强(如DNA聚合酶9)、药物靶蛋白(如拓扑异构酶TopoII)量或活性的改变、蛋白激酶C各种同工酶活性和表达水平的改变等。不同肿瘤细胞可通过不同的途径导致MDR的发生，一种肿瘤细胞可同时存在多种耐药机制。因此体外建立食管癌耐药细胞系，筛查食管癌耐药相关基因，从基因表达水平寻找在耐药产

3、生中具有关键作用的分子改变，对于全面了解肿瘤细胞的耐药机制，寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的理论和现实意义。本研究首先用食管癌细胞EC9706作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系EC9706／cDDP。在此基础上，用RT．PCR方法筛选食管癌耐药相关基因，之后选取po职GST-叮【基因进一步研究其与食管癌耐药的相关性。通过调控其表达水平郑州大学2007届{毒=L学位论文中文摘要观察对食管癌细胞耐药性的作用，即分别构建这2个基因的真核表达载体，转染入EC9706细胞，初步观察其生物学效应，尤其对耐药指数的影响：并构建靶向这2个基因的siRNA重组慢病毒，探讨其体外对食管癌细

4、胞耐药性逆转的效果以及在裸鼠体内逆转移植瘤耐药性的效果。论文分4部分：第一部分人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706／cDDP的建立及相关耐药基因的筛选方法：采用顺铂(eDDP)中等浓度、间歇作用方法历时9个月建立耐药细胞系EC9706／eDDP，光学显微镜观察耐药细胞的形态学特点；M州去测定其对cDDP、5-FU、长春新碱、紫杉醇的敏感性，观察冻存、撇药对耐药性的影响；比较耐药与亲本细胞生长曲线、群体倍增时问、贴壁率的不同；流式细胞仪测细胞周期：软琼脂实验测细胞的恶性增殖能力；罗丹明摄入／排出实验测定P·gp功能；RT-PCR半定量方法测定亲本细胞及耐药细胞耐药相关基因

5、如DNA聚合酶(polp)、多药耐药相关基因(MRP)、谷胱甘肽转移酶．n(GST-n)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、拓扑异构酶(TopoII)和多药耐药基因(mdrl)等基因的mRNA表达水平。结果：人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706／cDDP在形态学上与亲本细胞无明显差别，但对cDDP的敏感性降低，耐药指数为15．7，同时对未接触过的5．FU、长春新碱、紫杉醇等有交叉耐药性，耐药指数分别为：3．2、2．8、1．8。冻存对耐药性影响不大，撤药培养可使细胞耐药性降低，耐药细胞群体倍增时间延长(29．79-士-0．48hVS25．79a：0．45h)，生长缓慢，G0／G

6、1、S期细胞比例增加，克隆形成率明显高于亲本细胞，二种细胞对罗丹明摄入／排出的差异无统计学意义。pollj、DHFR、GST-g基因mRNA的表达比亲本细胞显著增加(P0．05)。第二部分po堆、Gsl研真核表达载体的构建及转染EC9706细胞的生物学效应研究．方法：1．设计带有接头的GST-Tt全cDNA引物，提取EC9706细胞mRNA，RT-PCR扩增出GST．兀全基因，插入T载体，进行序列分析，亚克隆入真核表达载体plRES2-AcGFPl中。2．设计带有接头

7、的pollB全eDNA引物，从野生型polp的重组质粒pcDNA3．1一poIpⅡ郑州大学2007届博龇论文中文摘要中扩增出poll，的放阅读框序列，插入T载体，亚克隆入真核表达载体pIRES2一AeGFPI中。3．将构建好的2种重组载体脂质体转染法分别导入EC9706细胞，(3418筛选获得分别稳定高表达GST-呱、pollj的EC9706细胞。细胞形态学观察、生长曲线测定，用半定量RT-PCR和Western-blot测定转染细胞GST-x、pollj的表达，MTT法测细胞对顺铂敏感性的变化，双层软琼脂试验检测细胞恶性程度。结果：1．