前列腺癌dna聚合酶β基因突变、表达及其调控研究

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1、郑州人学2006年博j。学位论文前列隙痛DNA聚含酶B基因突变、表达发其洲控硎。究前列腺癌DNA聚合酶B基因突变、表达及其调控研究博士研究生王明臣导师董子明教授郑州大学基础医学院郑州450052摘要前列腺癌是欧洲居第二位的常见男性恶性肿瘤，在美国则超过肺癌居首位。我国前列腺癌的发病率虽远低于西方国家，但随人均期望寿命的延长，生活方式及膳食结构的改变，前列腺癌的发病率呈现日益增多趋势。该肿瘤的特点是潜伏性癌，早期诊断困难；治疗上化疗药物难以进入前列腺癌组织；确诊病例因多已转移，手术根治效果较差。目前其发生的确切分子事件尚未充分阐明，因此从分子水平揭示前列腺癌发生发展的机制，对于从基因水

2、平上干预防治前列腺癌具有重要的理论和实用意义。分子肿瘤学研究表明：肿瘤发生发展的根本原因在于基因的损伤和修复失灵。DNA损伤修复基因、癌基因、肿瘤抑制基因并称肿瘤三大基因，存在于人类正常细胞中，三者相互制约，共同维持细胞的正常生长、分化和增殖。任何一种或～类基因的损伤和，或表达异常均有可能直接或间接干预其它基因的表达和功能呈现，进而关联细胞的恶性转化。许多研究表明，除癌基因突变或／和过表达，肿瘤抑制基因的突变或缺失的致癌途径外，DNA损伤修复基因的突变及功能异常，将导致DNA损伤积累，基因组不稳定性增加，使细胞获得突变表型，亦可能是介导肿瘤发生的重要分子机制。DNA聚合酶p(DNAp

3、0Iynlel粥ebe执DNApolp)广泛分布于哺乳类细胞中，是真核细胞主要的DNA损伤修复基因，其DNA序列高度保守，为一看家基因。DNApolD的主要功能是参与DNA的碱基切除修复(baseexcisionrcpa虹BER)。其表达水平在整个细胞周期中相对稳定且不受细胞周期增殖调控。许多研究者在多种肿瘤组织和细胞系中发现了DNApolp的基因突变或／和过表达。有关前列腺癌吼qApolp基因突变的研究国外仅见日本学者一篇报道。国人前列腺癌发生与DNAp01p的基因突变、表达及功能状态的系统研究尚未见诸报道。本研究利用分子生物学方法，检测了12例前列腺癌组织、人前列腺癌pc3细胞株

4、及20例良性前列腺增生组织中的DNApolB基因突变及mI斟A表达水平；郑州人学2006年博士学位论文前列腺痛DNA聚台酶B基凶突变、表达及扎训控研究构建了前列腺癌特异突变DNApolp真核表达载体，并将其转入NI捌3T3细胞，初步观察了其生物学效应。同时基于前列腺癌组织和细胞系DNApolp的高表达，本研究还采用RNA干扰(RNAj)技术，成功构建了DNAp01p靶向siRNA真核表达载体，并转染人前列腺癌PC3细胞株，观察了其对PC3细胞DNApolp基因表达的沉默抑制作用、功能状态以及相应的细胞生物学行为的变化。第一部分前列腺癌组织及细胞系中DNApolp基因突变的研究方法1．

5、提取组织及细胞系中的总心淞，逆转录出cDNA；2．PcR扩增DNApolp全基因，插入T载体构建T_A克隆，DNA序列测定。3．利用分子生物学软件分析发现突变形式和突变位点，推导基因突变对应的氨基酸改变，模拟突变的DNApolB蛋白二级和二级结构的变化。结果1．首次揭示国人前列腺癌组织和人前列腺癌Pc3细胞系中存在DNApolp的基因突变；12例前列腺癌癌组织标本中DNApolp的突变率为33．3％(4／12)。2．首次发现前列腺癌组织和人前列腺癌Pc3细胞系DNApoIp基因的多种新的突变形式和位点。①58bp片段缺失突变(165-222m缺失I岣，并导致移码突变及提前终止，产生2

6、7个氨基酸长度截短的DNApolB蛋白。②点突变：272眦A．÷G转换(53位ne—Met)；72lmA—G转换(203位Glu-÷Gly)；768ntC_÷T转换(219位Glll一终止码，产生219个氨基酸长度截短的DNApolp蛋白)：80IntA—G转换(230位Lys—Glu)；388ntA-+G转换(92位Asp4Gly)；107IntA—G转换(320位Phc—Leu)第二部分前列腺癌组织及细胞系中DNApolp、P’rEN、Ha_ns及soD2基因的mRNA表达及相互关系研究方法1．提取组织和细胞系中的总RNA，通用引物逆转录出cDNA；2．以p。actin为内参照对

7、组织细胞的DNApol良P他N、Ha．r鹪及SOD2基因进行半定量PcR扩增；分析前列腺癌组织、人前列腺癌Pc3细胞株及良性前列腺增生组织这些基因的相对表达水平。3．应用SPSS12．0统计软件进行统计学处理，资料用均数士标准差表示，两组均Ⅱ郑州人学2006年博一I：学位论文前列腺癌DNA聚合酶B基吲突变、表达及其调拄研究数的比较采用独立样本的t检验，多组均数的比较采用方差分析，检验标准以p