上游远端DNA序列对c-myb基因调控作用机制研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M140110255上海海洋大学硕士学位论文题目：上游远端DNA序列对c-myb基因调控作用机制研究英文题目：Regulationofc-mybexpressionbydistalupstreamDNAsequence专业：生物学研究方向：分子生物学姓名：李小霞指导教师：张俊芳教授二O一八年六月五日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包

2、含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密

3、□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注上海交通大学医学院洪洁教授/博导主席附属仁济医院中国科学院上海生命魏刚研究员/博导委员科学研究院韩兵社上海海洋大学副研究员/硕导委员上海市第六人民医院罗军涛硕士秘书东院水产与生命学院A楼答辩地点答辩日期2018.5.25211上海海洋大学硕士学位论文上游远端DNA序列对c-myb基因调控的作用机制研究摘要C-Myb是细胞内重要的转录因子，随着细胞分化表达量逐渐降低，其能够影响细胞的增殖、分化并且和

4、造血调控密切相关。另外，该基因被发现在多种恶性肿瘤细胞如T细胞白血病细胞和乳腺癌细胞中异常表达。关于该基因的转录调控有较多的报道，但是上游远端DNA序列对c-myb基因调控的作用机制还知之甚少。实验室前期已经对小鼠骨髓瘤M1细胞中c-myb基因远端调控做了初步研究，发现在该基因上游远端的慢病毒插入位点有转录因子及结构蛋白的结合，但是具体调控机制尚不清楚，因此我们设计了M1细胞中hoxa9和pu.1及ctcf、cohesin结构蛋白基因（rad21、smc3、smc1a）的慢病毒敲降实验，并从RNA水平和蛋白水平分别

5、检测其对c-myb的表达影响。结果如下：1)小鼠骨髓瘤M1细胞中hoxa9基因敲降之后，c-myb基因在RNA水平表达下降，蛋白水平表达也呈现下降趋势。2）当细胞中的pu.1基因敲降之后，c-myb基因在RNA水平表达升高，蛋白水平表达也升高。3)小鼠骨髓瘤M1细胞中结构蛋白基因被敲降之后，c-myb的RNA和蛋白表达水平也随之下降，说明c-myb的表达受到这些结构蛋白的调控。以上实验结果说明小鼠M1细胞中c-myb的表达受到这些转录因子和结构蛋白的调控。为了进一步探索人的c-myb基因上游远端DNA序列对该基因的

6、转录调控，实验室前期通过人的红白血病细胞K562中的染色质构象捕获技术测序技术（4C）实验发现，人的c-myb基因上游远端DNA序列与其启动子区域在空间上有相互作用，猜测这些非编码DNA可以远距离调控c-myb基因的表达。首先我们应用聚合酶链式反应（PCR）从人类基因组中分别扩增c-myb基因的启动子片段和上游远端非编码DNA片段-88k、-34k(-34ka、-34kb、-34kc)和-53k位点，将这些DNA片段1上海海洋大学硕士学位论文克隆到含有荧光素酶报告基因载体PGL4.10-basic质粒构建重组子，用

7、荧光素酶报告基因检测系统检测增强子的活性。我们用增强子标记性的组蛋白修饰H3K4me1和H3K27ac的富集，通过ChIP-qPCR进一步验证这些位点的增强子功能。另外，为了探索这些位点是否有转录因子的结合，通过查阅文献查找到与人红细胞系相关的转录因子GATA1、GATA2、TAL1、CEBP/B，用上述位点的引物通过ChIP-qPCR实验检测这些位点转录因子的富集。结果如下：1)将增强子重组子瞬时转染293T细胞系，Hela细胞系，NIH3T3细胞系和K562细胞系后，发现在不同的细胞系中，转染重组质粒-34ka

8、位点的增强子活性相对较高。而-88k位点在293T，Hela和K562细胞系中均有增强子功能，在鼠的细胞系NIH3T3中没有检测到增强子功能。另外-34kb和-34kc位点只有在293T细胞中发现有显著性差异，其他细胞并没有检测到增强子的功能。2)以H3K4me1和H3K27ac为实验组，IgG为对照组进行染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，以不同位点的引物进