sirna沉默食管癌ec9706细胞中livin表达生物学效应初步的分析论文

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1、郑州大学200／届硕士学位论文中文摘要siRNA沉默食管癌EC9706细胞中Livin表达的生物学效应初步分析硕士学位申请人郭斌推荐导师陈宗德赵国强郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室(郑州450001)中文摘要背景和且的肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受细胞内外多种因素控制。凋亡抑制蛋白(inldbitorofapoptosisproteins,taP)是一类内源性细胞抑制因子。在很多物种中IAP起抑制凋亡的作用，其过度表达引起凋亡不足与肿瘤发生密切相关。因此以lAP为靶点，寻找有效的lAP抑制剂有广泛的应用前景。Livin作为一种新发现的凋亡抑

2、制蛋白(IAP)抑制细胞凋亡，其存在于胚胎组织、胎盘组织和一些恶性肿瘤组织中，并在包括食管癌在内的多种肿瘤组织中呈现异常表达，与肿瘤的发生、发展、预后及耐药相关，将可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。在基因治疗方面，RNA干扰技术和反义核苷酸技术也日趋成熟，被使用来达到干扰细胞内某些基因的表达，抑制和杀伤肿瘤细胞。Livin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白(IAP)，抑制其在细胞内的表达，能否起到抑制食管癌细胞作用。为此，本实验拟构建针对人Livin基因的小干扰gNA(siRNA)表达载体，观察RNA干扰对食管癌细胞Livin基因表达的沉寂作用。通过调控食管癌EC970

3、6细胞株Livin基因的表达，观察对食管癌细胞生长速度、细胞凋亡情况的影响。方法利用Takara、Ambion和promegasiRNA靶序列分析设计系统，扫描人Livin(1ivina和livinlj)eDNA编码序列，依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析选择确定19个碱基的siRNA靶序列，同时随机组合出一条对照序列。分别合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火成双链DNA；用BamHI郑州大学2007届硕士学位论文中文摘要和ClaI双酶切siRNA表达载体pSUPER-neo；将双粘livina和livinl3发卡样siRNA片段分

4、别连接入siRNA表达载体pSUPER-neo中；利用BamHI和ClaI双酶切筛选鉴定重组子，并对重组子命名pSUPER-neo-Slil、pSUPER-neo．Sli2和pSUPER．nco-C：对插入序列进行DNA序列分析。用脂质体包裹分别转染沉默Livin表达的siRNA载体以及livina和livinlB表达载体入食管癌细胞EC9706。荧光定量RT-PCR检测LivinmRNA表达情况，测定细胞生长曲线和Caspase-3活性，检测细胞凋亡的影响。结果1．通过筛选并通过同源序列检索和进一步优选，最后确定19个碱基为siRNA靶片咧：GcGTcTGG

5、c(x℃crI℃TAT(44m458)和GTcI'GGccTc(HTcTATGA(442-460)。2．siRNA发卡DNA的退火后，电泳可见明亮条带，均位于约60bp处，与设计完全一致。3．用BamHI和ClaI双酶切对重组质粒进行鉴定，得到pSUPER-neo．Slil、pSUPER-neo—Sli2和pSUPER-neo—C。4．对重组子pSUPER-neo—Slil、pSUPER-neo-Sli2ffllpSUPER—neo—C插入片段DNA序列测序，结果与设计完全一致。5．转染LivinsiRNA载体的EC9706细胞经RT-PCR检测显示Livin

6、基因的表达水平明显降低。6．转染siRNA载体沉默“vin吖B表达，细胞凋亡率、Caspase-3活性显著增加。结论1．设计出针对Livina、Livinp的发卡样siRNA寡核苷酸片段。2．成功构建出针对Livina、Livinp的siRNA表达载体pSUPER-nc0．Slil、pSUPER-neo·Sli2。Ⅱ郑州大学2007届硕士学位论文中文摘要3．siRNA表达载体转染食管癌细胞后能显著降低细胞Livina或uvi邮表达。4．调控食管癌EC9706细胞的Livin表达，可有效改变食管癌EC9706细胞生物学行为；Livin基因可能成为肿瘤治疗上有前途

7、的分子靶点。关键词：Livin：RIgA干扰；基因沉默；食管癌IH郑州大学2007届硕士学位论文英文摘要TheinitialanalysisonbiologicaleffectofLivingenesilencedbysiRNAinesophagealcarcinomaEC9706cellspostgraduateguobinDeparmentofMicrobiologyandImmumology,BasicMedicalSchool，ZhengZhouUniversity,ZhengZhou,450001AbstractBackgroundandobject

8、ivesCanceriscausedb