海岛棉再生体系的建立及农杆菌介导转化bt基因的研究

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3、4、28和33)下胚轴体细胞胚胎发生进行差异研究，探讨5个品种组织培养过程中各时期的差异，并以对新海28和新海33胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法进行研基因的遗传转化，对转基因植株进行PCR检测和GUS组织化学检测，初步确定外源历基因已整合到两个海岛棉品种基因组中，并进行了表达。本研究取得的主要成果如下：以1个陆地棉和4个海岛棉品种的下胚轴为外植体诱导愈伤组织，采用2种MSI+0．1mg／L2，4-D+0．1m∥LKT和MSI+0．3mg／LNAA+0．1mg／LKT棉花愈伤组织诱导实验中常用的激素组合培养基进行诱导愈

4、伤组织。实验结果表明，O．1mg／L2，4-D+0．1mg／LKT配比下陆地棉和海岛棉的愈伤组织出愈率高，0．3mg／LNAA+0．1mgCLKT配比下出愈率低而大部分愈伤组织为灰白色硬块，这种状态下愈伤组织很难诱导下面的胚性愈伤组织分化试验。因此，本实验0．1mg／L2，4-D+0．1mg／LKT配比为最优诱导培养基继续进行诱导试验。愈伤组织分化到胚性愈伤组织诱导全过程中，MS2培养基里2次或3次继代培养对陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织分化效果最佳。MS3培养基培养2～3次后的胚性愈伤组织转入到液体MS4培养基进行悬浮培养诱

5、导体细胞胚。结果表明，5个棉花品种都适于悬浮培养诱导体细胞胚，4种海岛棉在添加激素的Sl(0．1mg／L2,4一D+O．1mg／LKT)、S2(MS4+0．05mg／LIBA+0．1mg／LKT)和S3(0．3mg／LNAA+O．1mg／LKT)培养基上体胚发生率均下降，而陆地棉体胚发生率提高及加快了再生植株发育进度，尤其在S3上。在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织细胞学观察比较试验中发现，海岛棉愈伤组织和胚性愈伤组织的各时期细胞比陆地棉的大。海岛棉愈伤组织的细胞大小无规律、细胞壁薄、细胞核位于细胞壁边缘并液泡大，到胚性愈伤组

6、织和体细胞胚胎初期细胞与细胞间紧密连接，细胞大小比愈伤组织小。以新海28和新海33胚性愈伤为受体，通过农杆菌介导的转基因技术，获得了Bt基因的转化体系，并获得了转化再生植株。转化过程中500mg／L头孢霉素和50mg／L卡那霉素抗性筛选在提高抗性胚性愈伤再生率和转化率中效果最佳。通过对转基因植株进行PCR检测和GUS组织化学检测，本实验初步验证，获得了8个转基因阳性植株，且确定所转化的外源曰f基因稳定存在于转化体基因组中。关键词：陆地棉：海岛棉；再生体系：体细胞胚胎发生；Bt基因；遗传转化万方数据Establishment

7、oftheRegenerationSystemofSeaIslandCottonandStudyonAgrobacteriumtumefaciens—medtntedTransformationofBtGeneAbstractThisstudyofanuplandcottonandfourseaislandcottonvarietiessomaticembryogenesishypocotyldifferentiatestudytoexaminethedifferencesintissuecultureprocessthe

8、sefivespeciesineachperiod，andontheXinHai28andXinHai33embryogeniccallusreceptorgeneBtgenetictransformationmediatedbyAgrobacterium，throughtheexaminationof