农杆菌介导甜高粱bar基因再生体系建立及水稻eis基因转化概述

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1、农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化概述第一章引言1甜高粱研究概况甜高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)属禾本科(Poaceae)高粱族(Andropogoneae)高粱属(Sorghum)，也称糖高粱，是普通高粱的一个变种。甜高粱属C4植物，具有光合效率高、生物产量高、抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱和适应性广等特性，被誉为植物中的骆驼，在热带、亚热带和温带均可种植，主要种植在热带干旱、半干旱地区、高海拔低温山区及盐碱地区和土壤贫瘠地等地区（黎大爵，1992；杨文华等，2004）。甜高粱是一种多用途杂粮作物，其籽粒可以食

2、用和酿酒；茎秆汁液丰富、含糖量高，可用于加工生产糖和糖浆，还可用作青贮饲料或加工成糖化秸秆饲料，最重要的是可以用来生产乙醇，代替石油等化石燃料，缓解全球能源危机（王艳秋等，2004；张志鹏等，2005；严晋跃等，2009）。尤其是近年来，随着国家禁止以玉米、小麦等粮食能源作物的乙醇生产，以甘蔗、甜菜等非粮能源作物的乙醇生产发展迅速。而在众多的非粮能源作物中，甜高粱具有种质资源丰富、抗逆性强、适应性广、生物产量高、茎秆含糖量高、乙醇转化效率高，乙醇生产成本低等优点，被认为是最具发展潜力的能源作物（曹文伯，2002；高士杰，2005；卢庆善，2008）。高粱被认

3、为是植物组织培养困难的植物之一，经过几十年的发展，虽然取得了很大的进步，但仍落后于水稻、小麦、玉米等单子叶作物。甜高粱的组织培养研究起步晚，研究的也少，相关研究报道也很少。.2水稻研究概况水稻是世界上最重要粮食作物之一，在全球温带、热带、亚热带和寒带都可种植，在全球的种植面积超过16346万公顷，产量超过1772万吨，占全球作物总产量的24.38%（FAO，2012）。水稻已经成为单子叶植物研究的模式植物，其遗传转化在品种改良、基因功能检测和突变体筛选中的作用日益凸显。随着大规模的水稻基因组测序的结束和水稻序列图谱的绘制，基因组数据库中积累了大量的数据，功能

4、基因组的研究已经被提上议事日程。因此，如何建立一套稳定、高效的转化系统就显得非常重要。经过科学家们半个多世纪的不断努力，水稻的高效遗传转化系统已经建立，农杆菌介导的遗传转化技术也日益成熟。水稻的组织培养始于1955年Fujiin，倒掉共培养培养液I，加入制备好的农杆菌悬液浸染15min，倒掉菌液，幼胚置于无菌滤纸上晾25-30min，然后接种到铺有一层无菌滤纸的MS共培养培养基上，于28℃黑暗共培养2-3天。愈伤组织则直接用OD600值0.3-0.5的农杆菌悬液浸染20min，倒掉菌液，愈伤组织置于无菌滤纸上晾35-40min，然后接种到相同的共培养培养基上

5、，相同条件下共培养2-3天。共培养2-3天后，幼胚和愈伤组织转接到预筛选培养基上，在28℃黑暗培养5-7天，再将其转接到含500mg/L头孢霉素和20mg/L潮霉素的筛选培养基上进行筛选。每2-3周更换一次筛选培养基。经4-5周的筛选培养，幼胚转化获得的抗性愈伤先转接到继代培养基上继代2-3周，待抗性愈伤组织长到直径约5㎜大小再转接到不含抗生素和筛选剂的分化培养基上进行分化培养；愈伤转化获得的抗性愈伤组织转接到含有500mg/L头孢霉素的分化培养基上进行分化培养，条件为25±2℃每天16/8h光照/黑暗。..第三章结果与分析........20

6、1甜高粱不同外植体愈伤诱导差异分析....201.1不同处理对成熟种子愈伤诱导的影响......201.2不同基因型和不同培养基对幼穗愈伤诱导的影响......221.3不同基因型和不同取材时期对幼胚愈伤诱导的影响.......252甜高粱不同外植体愈伤化差异分析........323甜高粱再生苗生根、移栽与再生植株的获得.......384甜高粱转Bar基因研究........434.1潮霉素浓度筛选.......434.2不同受体材料对高粱遗传转化的影响......444.3不同基因型对高粱遗传转化的影响.....455水稻成熟种子再生的影响因素....

7、..466水稻再生苗的生根、移栽与再生植株获得......507EIS基因转化载体的构建与鉴定....518农杆菌介导水稻转EIS基因研究.......549水稻T0代转基因植株PCR检测.......56第四章讨论.....581褐变对甜高粱植株再生的影响......582外植体类型对甜高粱植株再生的影响....583基因型对甜高粱植株再生的影响.......594不同培养条件对水稻成熟种子植株再生的影响........595影响高粱转化率的因素........60第五章结论........61第四章讨论1褐变对甜高粱植株再生的影响褐变在植物组织培养中普遍

8、存在，在高粱组织培养中比较严重。褐变可分为酶促褐变和