农杆菌介导大豆转化体系的建立及植酸酶基因的导入

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1、刘银：农杆菌介导大豆转化体系的建立及植酸酶基因的导入农杆菌介导大豆转化体系的建立及植酸酶基因的导入摘要大豆是我国重要的油料作物和粮饲兼用作物，是植物蛋白的重要来源。近年来，随着生物技术的发展，许多学者通过基因工程的手段来改良大豆品质、提高大豆产量。本研究以大豆的子叶节为外植体，探讨了影响大豆再生效率的主要因素，建立了子叶节的再生体系；通过农杆菌介导的转化方法将植酸酶(P^)，)基因导入小粒豆中，研究影响其转化的主要因素，初步建立大豆遗传转化体系，并获得了经PCR检测为阳性的转基因植株。主要工作和结果如下：l、大豆

2、子叶节再生体系的建立(1)种子消毒方法的确定：比较了3种不同种子消毒方法，氯气消毒法对种子的伤害比较小，污染率低，适合大豆种子的消毒。(2)最适苗龄的筛选：不同苗龄的大豆子叶节诱导丛生芽能力存在显著差异，无菌苗萌发4d时，丛生芽诱导率最高，为88．9％，因此子叶节转化的最适苗龄为4d。(3)大豆基因型的筛选：不同基因型的大豆再生能力差异较大，供试的5个不同基因型大豆，芽诱导率在24％．84％之间，其中小粒豆芽诱导率最高，因此将小粒豆作为进一步转化的实验材料。(4)6-BA浓度的确定：6-BA浓度直接影响无菌苗的萌

3、发及丛生芽的诱导，萌发培养基中添加1mg／L6-BA时无菌苗长势最佳，芽诱导阶段最适6-BA诱导丛生芽浓度为1．67mg／L。(5)生根阶段IBA或NAA浓度的确定：生根阶段添加IBA、NAA均可以显著提高生根率，添加lmg／L的IBA最适合小粒豆不定芽的生根。2、Phy基因转化大豆(1)确定了农杆菌菌液浓度OD600为0．8，与子叶节外植体侵染30min，在含有25mg／LLA共培养基中暗培养3d。(2)确定了草丁膦筛选的适宜浓度为5mg／L，并根据大豆子叶节农杆菌转化特点，采用延迟筛选方法。(3)通过筛选，得

4、到抗性苗345棵，经PCR检测有5株为阳性，转化率为1．45％。关键词：大豆，子叶节，农杆菌介导，遗传转化，植酸酶基因ll扬州大学硕士学位论文EstablishmentofAgrobacteriumtumefaciensmediatedsoybeantransformationsystemanddevelopingoftransgenicsoybeanwithPhygeneABSTRACTSoybeanisanimportantoilcrop，grainandforagecropinChina．Inrecenty

5、ears，thestrategyofgeneticengineeringhasbeenappliedinimprovingsoybearlqualityandenhancingsoybeanproduction．Inthisstudy,anefficientregenerationsystemofsoybeancotyledonarynodewasestablishedandoptimized．ThePhytase(Phy)genewastransferredintosoybeanwithAgrobacteriu

6、m-mediatedmethod．Themainfactorsinfluencingtransformationratewerediscussedandthetransformationsystemwasestablishedpreliminarily．ThepositiveplantswereobtainedandconfirmedbyPCR．Themainresultswereasfollows：1．Establishmentoftheregenerationsystemofsoybeancotyiedona

7、rynode(1)Selectionofthemethodforsoybeanseedssterilization：ThebeststerilizationmethodwasusingC12foritslowpollutionrateandlessdamageofsoybeanseeds．(2)Selectionofseedlingages：Therewerelargedifferencesofshootinductionfrequencyamongdifferentagesofgerminationseedli

8、ngs．4dgerminationseedlingswerechosentothetransformationforthehigestshootinductionfrequency,upto88．9％．(3)Selectionofgenotypes：Therewerelargedifferencesofregenerationfrequencybetweensoybean