农杆菌介导tcs基因导入大豆的遗传转化.研究

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1、万方数据东北林业大学硕士学位论文3．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1．1植物材料和菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1．2仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．1．3药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．2-1农杆菌质粒DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2。2大豆基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2．3抗性植株的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．2．4抗性植株的PCR．Southern杂交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3．1大豆基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．3．2转化植株的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。．303．3．3转基因植株的PCR—Southern分子杂交检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313

3、．4本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯334讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．344．1大豆再生频率较高的基因型筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯344．2抗生素的筛选和选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯344．3进一步解决的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34结论⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43攻读学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。46万方数据中英文对照表．V一万方数据1绪论大豆_[Glycinemax(L．)Merrill]是重要的粮食、油料和饲料作物，是植物蛋白的主要来源，在国内外市场上占有十分重要的地位。随着工农业生产的发展，环境污染的加剧，生态平衡被破坏

5、，大豆的病虫害越来越严重，直接威胁着大豆生产Ilj。植物遗传转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入受体植物基因组中，并在话代植株中得到表达的过程。20世纪后期，随着分子生物学及生物技术的发展，植物基因工程尤其是遗传转化技术取得了很大进展i2J。1984年，Herrera．Esfrella等【3】首次利用农杆菌Ti质粒将外源基因导入烟草获得成功。随后，重要的农作物水稻14’51、小麦[6-71、玉米【8月】等转基因作物也相继获得成功。大豆转基因的遗传研究开始于1984年【1m111，在1988年Hinchee等【12】用根癌农杆菌介导法和McCabe等

6、【13】用基因枪法分别获得了大豆的转基因植株。但因大豆的组织培养体系尚不完善、大豆组织对农杆菌不够敏感等方面原因，使大豆的遗传转化研究进展缓慢，成为世界性难题。对大豆进行抗病虫基因转移及其转化系统的研究，建立高效、稳定的大豆遗传转化系统，能获得抗病虫转基因的大豆植株。这对防治大豆病虫害、提高大豆品质和产量具有十分重大的理论和生产实践意义。1．1天花粉蛋白基因及其在植物基因工程的应用1．1．1天花粉蛋白的基本特性天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科药用植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)块根中分离得到，属于I型

7、单链核糖体失活蛋白(RibosomeInactivatingProtein，RIP)，具有多种生物活性和药理活性11引，是中草药天花粉的有效成分。根据《本草纲目》的记载，天花粉的主要功效是“通月水，治胞衣不下”。天花粉蛋白(TCS)对治疗早期和中期妊娠引产有效率达到90％以上，结晶天花粉蛋白针剂已被应用于宫外孕、葡萄胎、异位妊娠、绒毛上皮癌等疾病的治疗【15J；天花粉蛋白对乙型肝炎、乙型脑炎等7种病毒的复制均有一定的抑制作用116

8、，具有广谱的抗病毒作用；特别是天花粉蛋白能在不影响细胞本身蛋白质合成的情况下，抑制艾滋病病毒HIV在感染的免疫细胞内的繁殖117】

9、。近年来的研究结果表明，天花粉蛋白和植