农杆菌介导高梁转化体系的建立与bt（bacillusthuringiensis）抗虫基因的导入

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1、浙江大学博士学位论文农杆菌介导高梁转化体系的建立与Bt（Bacillusthuringiensis）抗虫基因的导入姓名：张明洲申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：夏英武2002.5.1摘要在优化高粱再生系统和农杆菌介导的遗传转化体系的基础上，采用农杆菌介导法获得了含密码子优化的杀虫晶体蛋白(Bt)基因c∥lAb转基因高粱。通过正交试验和单因子试验确定了高梁离体培养的最佳培养基，并对其多种影响因素进行研究。结果表明，高梁茎尖直接再生的培养基为：MS无机盐+B5有机物+KTo．25mg／L+BAPO．25mg／L+IAAO．25mg／L+L-Asn200mg，L+抗坏血酸10

2、mg，L+PVP100mg／L+蔗糖309／L+琼脂109／L；种子(胚)愈伤组织诱导培养基为：MS(C)无机盐+MS有机物+2,4一D3m#L+KTO．05mg／L+L-Pro50medL+水解酪蛋白500mg／L+PVP8rag／L+蔗糖309／L+琼脂89，L：种子(胚)愈伤组织继代培养基为：MS(C)无机盐+MS有机物+2．4一D3mg／L+KT0．5mg／L+L·Asn200mg／L+L—Pro50m∥L+PVP100mg／L+抗坏血酸500rag／L+蔗糖309／L+琼脂89／L；未成熟胚愈伤组织诱导培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D2mg／L+KTO．05

3、mg／L+T,米素0．05mg／L+L．Asn150mg／L+L—Pro700mg／L+水解酪蛋白lg／L+PVP8mg／L+抗坏血酸10mg／L+NH4N033．59／L+KH2P040．59／L+蔗糖209／L+琼脂89／L：未成熟胚愈伤组织愈伤组织继代培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D2mg／I．+t,米素0．5mg／L+L—Asn150mg／L+L—Pro150rag／L+水解酪蛋白500mg／L+PVP8mg／L+抗坏血酸10mg／L+NH4N033．59／L+KH2P040．59／L+蔗糖209／L+琼脂89／L；幼穗愈伤组织诱导培养基为：Y14培养基(MS

4、+2，4--D2mg／L+玉,米素2．2mg／L+PVP8mg／L+抗坏血酸10mg／L+水解酪蛋白500mg／L+蔗糖309／L+琼脂7．29／L)：幼穗愈伤组织继代培养基为Y14+KT0．175mg／L。对不同外植体和不同基因型诱导产生愈伤组织的再生能力进行比较研究，结果表明，幼穗愈伤组织分化率最高，平均为77．2％；其次是茎尖，平均再生率为39．4％；未成熟胚愈伤组织平均分化率为21．7％；种子(胚)愈伤组织分化能力最差，分化率平均仅为l％。此外，不同基因型间的再生能力差异很大。以幼穗、茎尖和未成熟胚作外植体比较理想，可用于进～步的转化研究。通过gus基因瞬时表达对农杆菌介

5、导高梁转化体系及其影响因子进行了系统性研究，获得较高转化频率的条件为：(1)茎尖：预培养时间3d，在OD600值为O．5农杆菌菌液中感染10min，共培养时间为3d；(2)未成熟胚和幼穗愈伤组织：预培养时间3d，最适农杆菌菌液浓度OD600值为0．5--0．7，感染时间5--20min，最适共培养基pH值为5．2-5．6，最适共培养温度为22--25。C，最佳共培养时间3d：(3)在共培养基、农杆菌预培养基、悬浮培养基中添加AS100I．tmoI／L有助于提高转化频率：(4)在共培养基中添加PVP500mg／L，可防止外植体共培养后褐化死亡现象发生，促进转化频率的提高。，7首次研

6、究了不同抗生素的抑菌效果和对高梁离体再生培养反应的影响，发现在农杆菌介导高梁遗传转化时，选用250--500meJL的羧苄青霉素抑菌较为合适。不同高梁品种及外植体对潮霉素和卡那霉素的敏感性不同，但对潮酶素比卡那霉素更敏感。在筛选转化体时，采用浓度为25．50mg／L潮酶素对茎尖和未成熟胚较为适宜，对愈伤组织则以50—75mg／L为宣。以幼穗愈伤组织为受体，在世界上第一次通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因crylAb导入高梁品种115、ICS21B和5—27，共获21个独立转基因细胞系，52株转基因植株，平均转化率为1．9％。经GUS活性、PCR、Southern杂交分析表明此基因

7、已整合进高梁基因组中。Bt蛋白测定表明，crylAb基因能在转基因高粱植株中表达，但不同转基因植株及不同组织间表达量有所不同。室内饲虫试验表明，转基因高梁对大螟(Sesamiainferens)具有一定抗性。关键词：Bt基因：农杆菌；遗传转化；高梁IIAbstractTransgenicsorghUlnplantscontainingacodon—modifiedinsecticidalBacillusthuringiensic(Bt)crylAbgenewereobtained