玉米自交系农杆菌转化体系的建立及转抗虫基因玉米植株的获得

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1、四川农业大学硕士学位论文玉米自交系农杆菌转化体系的建立及转抗虫基因玉米植株的获得姓名：伍晓丽申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：荣廷昭;朱祯20030501摘要玉米是我国第二大作物，在国民经济中占有重要地位。据不完全统计，全国范围内有4，000万亩的玉米田受到螟虫的危害，年产损失达7—8％，严重年份高达15—20％。得到转基因玉米植株，为日后选育出抗螟虫玉米品种打下基础，是本实验的目的之一。本试验采用转基因手段分别将SCK基因(SKTI和KDEL修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂CpWI基因)、修饰的Bt(苏云金杆菌杀虫毒蛋白)基因导入了玉米优良自交系18(红)中，并获得了大批再生植株。经P

2、CR、PcRSouthern、Southernblot、点杂交检测，证明外源基因己存在并整合于再生植株基因组内。目前，已获得转以上抗虫基因玉米T1代种子。玉米外源基因转化常用基因枪法，该方法虽然转化率较高，但成本高，一次性转化量小，转入的外源基因多是多拷贝插入，易发生DNA断裂。农杆菌法可以弥补这些缺点，但转化率低。鉴于农杆菌法在玉米转化上具有较大潜力，本实验采用农杆菌转化。旨在建立完整高效的农杆菌转化体系，为今后进一步将农杆菌法顺利地应用于玉米遗传转化打下基础。在实验过程中笔者对愈伤的诱导、侵染条件、转化后的筛选、再生、移栽等方面的技术进行了较为细致的探索。1．胚性愈伤诱导不同基因型的材料

3、胚性愈伤诱导率不同，诱导出的愈伤质量也有差异。总的说来，152X141优于18(红)；甘露醇可通过增加培养基渗透压，防止愈伤细胞吸水过度丽改善愈伤水浸化状况：幼胚褐化是胚性愈伤诱导过程中常出现的问题之一。本实验采取改善培养条件、提高2，4一D浓度等措施有效地降低了褐化率：在继代过程中，适当提高2，4一D浓度可抑制愈伤的分化，但为防止高浓度2，4一D对愈伤的伤害，分化趋势一旦控制应立即转入低浓度2，4-D的继代培养基中。2．愈伤的转化摇菌时间、转接方式、As和抗生素加入时间等因素对转化效果也有一定影响。第一次摇菌时间不宜过长，振荡培养8一10小时即转接较合理。即使延长摇菌时间，也应适当增加培养

4、液的量，加大振荡速度，以使农杆菌始终处于适合的环境中；转接时菌液离心后重悬的方式优于直接转接，因为前者避免了抗生素进入新鲜YEB液体培养基对农杆菌和愈伤的伤害；第一次摇菌时，抗生素最好在菌已培养2小时后加入，选择效果较好；第二次摇菌时，As加入时间也不宜过早，在临侵染前加入菌液比较合适，同时在共培养基中也要加As；愈伤转化前预培养7—8天，细胞正处于分裂旺盛的对数生长期，易于转化；在侵染前对愈伤进行8小时的高渗处理，也对提高转化效率有一定作用；转化后的愈伤经过一段时间恢复培养才开始筛选，其抗性愈伤筛出率显著高于未经恢复培养直接接种于筛选培养基的培养方式。3．转化后的愈伤筛选及再生在阳性愈伤筛

5、选过程中，HygB浓度宜控制在致死浓度以下，以免在杀死非转化细胞的同时对阳性细胞的分化能力造成损害。而且HygB应由低到高逐渐上升到最高浓度，以利于非转化细胞对转化细胞的滋养作用的发挥；分化培养基中不宜加入高浓度HygB，否则会加剧阳性愈伤的褐变死亡；分化过程中，不同基因型的材料对Kt浓度的要求不同，18(红)的适宜浓度是0．5mg／L，152X141的适宜浓度是lmg／L。高浓度Kt会造成苗畸形生长，长势弱，移栽后不易成活；小苗移栽是实验的又一关键环节。实验证明，自然环境中炼苗优于温室环境。但由于自然环境中不可控因素较多，如大雨、强日照、高温、寒潮、虫害等，应在菌床设计时充分考虑到避免这些

6、不良环境的影响，且应随时注意天气变化，观察苗情，防患于未然。关键词：玉米，农杆菌，遗传转化，抗虫基因ABSTRACTMaizeistllesecondmostimportantcropofChina—Accordingtothestatistic，thereis6．589，800acresofcornattackedbyChiIopartellus，whichlcadstolOSSof7，8％，even15—20％，oftheyieldperyear．MystudyaimstogaintransgenicmaizeplantsthatCallresistChilopartellus．Asar

7、esult，Igotalotofregenerateplants．ResultsofPeR，PeR-Southern，SouthernblottingandDotblottingassaysoftheseplantsprovedthatsomeofthemcarriedsuchforeigninsecticidalgenesasmodifiedcowpeatrypsininhibitor(SCK、genean