水牛卵泡发生相关基因的克隆、表达规律及其功能验证关键技术的研究

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1、万方数据分类号S墨23UDC博士学位论文水牛卵泡发生相关基因的克隆、表达规律及其功能验证关键技术的研究学科专业动物遗佳直独墨繁殖指导教师虿德题研究虽论文答辩日期2Q!垒生三目2竺目学位授予日期——答辩委员会主席奎力教援万方数据广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师

2、指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。日，不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：粜鹏指导教师签名：／趸0砂矗．。l乙作者联系电话：15277012910日期：沙f彬收形日期：-vo／q：、够必电子邮箱：yijianrudi@163．com万

3、方数据水牛卵泡发生相关基因克隆、表达规律及其功能验证关键技术的研究摘要水牛在亚洲有着7000多年的饲养历史，在中国的畜牧业生产中有着重要的经济地位。然而，由于其静态发情、妊娠期长等生物学特点而导致水牛整体的繁殖力水平低下，使得水牛养殖业的发展速度缓慢。本研究围绕如何提高水牛繁殖力这一目标，以自然突变高繁殖绵羊为线索，以最新的基因改造工具——TALEN和Cas9／gRNA为主要手段，来研究水牛卵泡发生过程中的部分基因分子机制，并对基因敲除小鼠模型制备及基因敲除水牛生产方法进行初步探讨。1、水牛卵泡发生相关基因的克隆与生物信息学分析应用RT．PCR技术成功克隆得到

4、BMPl5，GDF9，ALK3等27个水牛卵泡发生相关基因(包含全长CDS)，包括：BMPl5，GDF9，ALK3，ALK5，ALK6，FOX03，Follistatin，RAD51，RAD52，CX37，WNT4，PTEN，NGF，FGF7，FGF2，FGF2R,C-KIT，KIT，GDNF，BMP6，BMP7，NOBOX，CTGF，AMH，LIF，FOXL2和PDGFA。其基因编码区的长度从468bp到2922bp不等，经比对分析，所克隆的基因与其他物种均具有较高的保守性，此外还对所克隆的基因的蛋白进行了系列生物信息学分析、预测。2、水牛卵泡发生相关基因表

5、达规律研究应用QRT．PCR和免疫组化技术对所克隆基因在水牛不同组织中的表万方数据达模式进行了研究，发现ALK3，AMH，BMP6，CTGF，CX37，CX43和FGF7在所检测的组织中均有表达。其中ALK3，ALK5，ALK6，C．KIT，CTGF，CX37，CX43，FOXL2和GDFl1在卵巢中相对表达量最高，NOBOX特异性的表达于卵巢中。在睾丸中相对表达量最高为BMP2；在垂体中相对表达量最高的有BMPl5，FGF7；AMH在胎水牛的生殖脊中相对表达量最高。对BMPl5和GDF9的深入研究表明，在卵泡发生过程中BMPl5和GDF9主要表达于腔前卵泡阶

6、段，在胚胎发生过程BMPl5和GDF9主要表达于发育早期，且胚早期胎阶段相对表达量远远高于卵泡发生阶段，在囊胚阶段相对表达量降到最低。此外，相同阶段BMPl5的表达量约为GDF9的2倍。免疫组化的结果表明BMPl5和GDF9主要定位于腔前卵泡的卵母细胞、颗粒细胞与卵丘细胞。3、水牛BMPl5，GDF9及BMP6相关受体的研究通过BiFC技术研究了水牛BMPl5，GDF9，BMP6及其受体间的相互作用关系。结果表明，在293T细胞内，BMPl5的I型受体有ALK6，ALK3和ALK5，其中与ALK6的亲和力最强，BMPl5既能形成同源二聚体，也能与GDF9形成异

7、源二聚体。水牛GDF9和BMP6的I型受体亦均为ALK6，与ALK3和ALK5均未检测到相互作用信号。为一步探讨其相互作用的机制，参考绵羊ALK6基因自然突变造成多胎的FecB模型，本研究又成功制备了水牛源ALK6基因的FecB突变小鼠模型，为深入研究FecB突变致多胎的分子机制奠定了基础。4、BMPl5和FOX03基因的TALEN敲除研究根据同源比对水牛与黄牛、绵羊、山羊、小鼠等物种的BMPl5，FOX03万方数据基因序列，选择保守区序列BMPl5基因共设计3对TALENs(Btlnl，2和3)，其中Btlnl可用于牛和水牛的基因敲除，Btln2和3则能用于

8、猪、牛和水牛的基因打靶。对FOX03基