《荷花nnγgcs基因克隆、表达及功能验证》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＼＇．‘．？■，分类号阻．？学＾２０１２１０４１１５為请農違义餐硕壬学位论文荷花Ｍ２ｒＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证张阿慧．Ｉ＊ｖ；＞．春－＇■■■一＾；．＇‘？ｒ？：‘－；／／．；，＇Ｙ、一：‘—．’＾－■．■＇．二Ｗ＾热，１．：－‘式；ｆ指导教师刘兆磊副教授＇专业名称园林植物与观赏园艺／爹＇古研究方向观赏植物分子生物学答辩日期二〇—五年五月 ＴＨＥＣＬＯＩＮＱＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＮｎＧＣＳＦＲＯＭＮＥＬＵＭＢＯｙＮＵＣＩＦＥＲＡＢｙＺｈａｎＡｈｕｉｇＳｕｐｅｒｖｉｓｅｄｂｙＡｓｓｏｃｉａｔｅＰｒｏｆ．ＬｉｕＺｈａｏｌｅｉＴｈｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＮａｎｉｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｊｇｇｙ虹ＰａｒｔｉａｌＦｕ脚Ｉｍ畑ｔｏｆ化ｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓＦｏｒＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅｇ化ＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅｓｇＣｏｍｌｅｔｅｄｉｎＭａ２０１５ｐｙ， 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进巧研巧工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中Ｊ。＾＾ｌ明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名：（ｆ气Ｗ５＾＾月到ｆ年１日学位论文版权使用授权书、本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅。本人授权南京农业大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。＂保密□。。，在年解密后适用本授权书本学位论文属于不保密扫上方框＂＂（请在内打Ｖ）１学位论文作者（需亲笔）签名：部巧義。／支年＾月日７／导师（需亲笔）签名：乙月曰ｌｌ义么＾／Ｉ 目录目录摘要１ＡＢＳＴＲＡＣＴｍ缩咯词Ｖ弓Ｉ言ｖｎ第一章文１１重金属及其危害１２水体重金属污染现状２３重金属修复方法２３．１物理化学修复方法２３．２农业生态修复技术３３．３生物修ｇ技术４４植物的重金属抗性机制．６４．１莖合作Ｓ６４．２区室化作用７４．３细胞修复７５基因工程在植物修复中应用７６植物修复应用前景９第二章荷花ＷｉｙＧＣＳ基因克隆及序列分析１１１材料骑法１２１．１植物材料１２１．２试剂与仪器１２１．２．１试剂１２１．２．２仪器设备１２１．２．３菌株境体１２１．２．４引物序列１３１．３３实验方法１１．３．１基因简并引物设计１３１．３．２ＲＮＡ１４提取－ｎｄ１．３．３ＩｓｔｓｔｒａｃＤＮＡ及检测１４合成１．３．４ＰＣＲ１５扩増 荷花ＷｗｙＧＣｙ基因克隆、表达巧功能验证１．３．５片段纯化与连接转化１５１．３．６重组子筛选及测序１５’－１．３．７３ＲＡＣＥＰＣＲ１６扩増’１．３．８５ＲＡＣＥ１６１．３．９ｃＤＮＡ全长序列的获得１７１．３．１０序列比对与进化樹构建１８２结果与分析１８２．１ＲＮＡ提取质量与反转录效果检测１８２．２目的中间片段序列測定１９－２．３ＲＡＣＥＰＣＲ结果巧２．４荷花ＪＶｈｙＧＣＳ基因全长序列的获得１９２．５氨基酸序列同源性比对２０２．６荷花ｉＶｗＧＣＳ基因氨基酸序列系统进化树构建２２３觀２３第兰章ｉＶｎｙＧＣＳ基因表达写亚细胞定位…２５一杞ＣＳ第节領胁迫后Ｗ巧在荷花中表达分析２５１機与方法２５１．１植物材料２５１．２试剂城器２６１：．２．１试剂２６１．２．２实验仪器２６１．３实验方＾＆２６１．３．１荷花ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成说１２Ｒｅａｌ－．３．ＴｉｍｅＰＣＲ分析２６１．３．３荷花各器官領含量的测定：２７２结果与分析２７２．１荷花基因组织定量分祈２７２．２領胁迫下荷花叶巧根部ＭｉＧＣＳ表达响应２８ｙ２．３锅胁迫下荷花组织重金属积累量２８３讨论３０第二节基因亚细胞定位３１１材稱歸法．．．．．３１１．１实验材料３１ 目录１２试剂与仪器３２１．２．１试剂及菌株３２１．２．２仪器设备３２１．．２３菌株与载体３２１．３实验方法３２１．３．１正义表达载体构建３２１．３．２洋葱表皮细胞瞬时表法巧１．３．３显微镜观察巧２结果与分析巧３册３４巧四章巧花ＡＴ巧供进基因的功能分析．３５１材料方法３５１．１材料３５１．２实验方法３６１．２．１正义表达载体构建３６１．２．２拟南芥的遗传转化３６１３．２．３拟南芥巧种６１．２．４拟南芥转化３６１．２．５拟南芥种子收获？古；３７１．３筛选阳性拟南芥３７１．３．１转基因植株鉴定３７１．３．２转基因巧南芥表达分析３８１／．４荷花Ａ＞ｉＧＣＳ基因在拟南芥中功能验证３８ｙ１．４．１根长的比较３８１．４．２锅胁迫下种子发芽率％１４．３３８．領胁迫下拟南芥植株生长量影咱１．４．４铺胁迫下生理指标变Ａ３８２结果与分析３９２．１转基因拟南芥鉴定３９２．２钢胁迫下根长比较４０２．３巧胁迫下发芽率比较４１２．４巧胁迫下拟南芥植株生长量变化４１２．５巧胁迫下植株内生理指标变化４１ｉｉｉ ＴＧＣｙ基因克隆、表达及功能验证荷花Ａ／ｉｙ；３冊４２全文结论４５创巧之处４７４９参考文献巧录＊．．．．巧鱗论文。致巧６５ｉｖ 摘要荷花Ａ／ｗＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ摘要荷花属睡莲科莲属挺水植物。、瓣型丰富且颜色艳丽花大，大多分布于淡水水域，深受大么欢迎的水生植物之一抗性强，观赏价值和经济价值都较高。本研究从荷，是花中克隆得到荷花谷氨醜半化氨酸合成酶基因（ｉｗ巧併ｙ），分析其时空表达模式，通过转化拟南界进而研究荷花ｉＶｎｙＧＣＳ基因功能，从分子水平探讨荷花重金属抗牲机理，为利用基因工程技术提高荷花抗逆能力提供理论依据。’１－．利用ＲＡＣＥＰＣＲ技术从荷化台城拂翠的叶片中克隆谷氨耽半脱氨酸合成酶基因Ｍ／ＧＣＳ８０１ＯＲＦ）１５６９。推导的氨基酸序列ｙ，该基因全长１ｂｐ，开放阅读框（咕具有典型的ＧＣＳ２基因家族结构域。系统进化分析表明荷花丫ＧＣＳ属于双子叶植物类，与龙眼，百脉根亲缘关系较近。－２（ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ）技术．利用焚光定量，分析ＭｉｙＧＣＳ在苟花不同器官及锅胁迫下的表达情况。结果表明Ｍ７７ＧＣＳ在荷花各器官均有表达，属组成型基因。各器官表达量从高到低依次为：嫩叶最高须。，其次叶柄，成熟叶，根，剑叶，茎最低锅胁迫—，ＧＣＳ在叶片和根部的表达都有不同程度的响应。不同來度锅处理后ＧＣＳ下Ｗｗｙ，ＴＶｗｙ在叶片表达变化越势相同。，均为先下降后上升，且高浓度锅处理下基因表达水平更高然而在根部，不同浓度锅处理后，ＭｒｙＧＣＳ表达变化并不相同，低浓度锅响应更快，高浓度锅反而响应迟鈍。２＋３．在２００＾１＾１和４００＾１＾忙（１胁迫下，测定荷花各器官锅积累量，结果表明荷花的根。１须和叶片是主要的锅积累器官叶片中锅积累量高达０００ｌ／。在根茎中积累量＾ｇｇ干重干重。最少，仅８０ｉ／｜ｇｇ４．构建了荷花ＴＶｎＧＣＳ正义表达载体，并利用基因枪轰击细胞技术进行亚ｙ洋葱表皮细胞定位实验，结果表明ｉＶｗＧＣＳ基因定位于细胞质。通过农杆菌侵染拟南界花序法拖Ｖｎ获得３株转基因株系－ＧＧＳ基因导入拟南界，经潮霉素抗性筛选及ＰＣＲ检测（Ｔ１１ｙ，，－－－Ｔ１２。目，Ｔ１３）巧光定量结果表明Ｔ１３中的基因表达量最高。在含锅培养基上播种野生型和转基因拟南齐Ｔ３代种子，比较其发芽率，结果表明转基因株系发芽率高于野２＋生型。根系生长也化野生型化盛ｉＭＣｄ，生长量大于野生型。用１００处理后，野生型［拟南齐膜脂过氣化程度大于转基因植株转基因植株。，抗氧化酶活性也高于关键词：荷花腳饼巧基因克隆；表达特点；功能分析Ｉ ＡＢＳＴＲＡＣＴＴＨＥＣＬＧＩＮＧＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ，ｒｏＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＮｎｙＧＣＳＦＲＯＭＮＥＬＵＭＢＯＮＵＣＩＦＥＲＡＡＢＳＴＲＡＣＴＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａｉｓａｎｅｍｅｒｇｅｎｔａｑｕａｔｉｃｐｌａｎｔｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏｎｅｌｕｍｂｏｏｆｔｈｅＡｅ幻ｃｅａｅ．Ａｎｄｉｔｉｓｏｎｅｏｆｔｔｔ巧ｐｈｅｔｏｅｎｆａｍｏｕｓｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｆｌｏｗｅｒｓ．Ｉｓｆｌｏｗｅｒｓｐｈａｖｅｖａｒｉｏｕｓｔｙｐｅｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｓ，ｂｅｗｏｒｔｈｉｎｇｈｉｇｈｌｙｏｒｎａｍｅｎｔａｌａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃｖａｌｕｅ．Ｍｏｓｔｏｆｅｍｖｅｄｎｅｓｈｗａｅｒａｎｄｅａｒｎｎｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｎｏｎｎｏｕｒｓｃｔｈｌｉｉｆｒｔｉｇｔｔｅｔｉ．Ｉｔｕｄｙｗｅｌｏｎｅｄａ，ｈｅａｖｅｎｅ？ｙｍｅｔａｌｒｅｌａｔｅｄｇＪＶ／ＴＧＣＳｆｒｏｍＡＷ画巧ｗｃ／幻ａｎａｌｚｅｄｉｔｓｔｅｍｏｒａｌａｎｄｙ诉，ｙｐｓｐａｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｓｔｕｄｉｅｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｉｔｉｎｔｏＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ＊Ｋｐｒｏｖｉｄｅｄｎｏｔｏｎｌｙｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｕｔａｌｓｏ过也ｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓａｎｄ■－ｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔ化ｉｍｒｏｖｅａｎｔｉｏ口ｕｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｉｎ７２ＷＣ於／幻．ｐｐ１．ＷｅｃｌｏｎｅｄｔｈｅＴＶ／ＴＧＣＳｆｒｏｍｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆ＂＂ｃｆｅｒａｂｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｙｉ／ｙ－ＰＣＲＴＲＡＣＥ．ｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆＴＶｗｙ併近ｗａｓ１８０１ｂｐｗｈｉｃｈｈａｓａｎｏｅｎｒｅａｄｉｎｆｒａｍｅｏｆＫ６９，ｐｇｂｐ．化ａｌｓｏｈａｄ过ｔｙｐｉｃａｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎｏｆＧＣＳ２Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓＮｎＧＣＳｈａｄａｒｅｌａｔｉｖｅｌｃｌｏｓｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｙｇｙ，ｙｙｙｐＤ．ｗｉｔｈｚＶｗｏｃａｗ／〇内２＂Ｌｏｕｒ．ａｎｄＣｗｃｗ／ｍ＊ｙｓ幻＂ｖｗｉｎｎ．．Ｔｈｅｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｄｉｃｏｔ巧护（）（Ｌ）ｙｓｕｂｃｌａｓｓ－２ｚｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗａｓａｎａｌｚｅｄｂＲｅａｌＴｉｍｅＰＣ民ｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｏｒａｎｓａｎｄ．ＴｈｅＭｙＧＧＳｐｙｙｇｕｎｄｅｒｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅ巧ｉｎｎｗｃｚ於ｒ幻．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｗａｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎａｎｄｉｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌｌｏｒｇａｎｓｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ．ＴｈｅｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＮｎｙＧＣＳｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓｗａｓｎｏｔｔｈｅｓａｍｅ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗａｓｙｏｕｎｇｌｅａｖｅｓａｎｄｔｈｅｎｅｔｉｏｌｅｍａｔｕｒｅｌｅａｖｅｓｒｏｏｔｓｔｅｎｄｅｒｌｅａｖｅｓａｎｄＲｈｉｚｏｍｅ．ＮｎＧＣＳｓｈｏｗｅｄ，ｐ，，，ｙｄｉＪＢｆｅｒｅｎｔｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｅｒｎｉｎｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｕｎｄｅｒｃａｄｍｉｍｎｓｔｒｅｓｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒｉｔｈａｄｔｈｅｐ，ｐｓａｍｅｃｈａｎｇｅｔｒｅｎｄｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔｃａｄｍｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｔｒｅｎｄｓｆｉｒｓｔｌｙｓｅｒｉａｎｄｔｈｅｎｗｅｎｔｄｏｗｎｔｈｅｎｉｔｓｈｏｗｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅｎｄｉｎｒｏｏｔｓｗｉｔｈｄｉｆｉｆｅｒｅｎｔｃａｄｍｉｕｍ，，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．阳 荷花Ｗ／ｉＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ３．Ｗｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ化ｅｃａｄｍｉｕｍａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎａｌｌｏｒａｎｓｏｆＮｅｌｕｍｂｏｇｎｕｃｉｆｅｒａｕｎｄｅｒｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２００Ｍａｎｄ４００Ｍ．Ｌｅａｖｅｓａｎｄｐｐｒｏｏｔｓｗｅｒｅｔｈｅｍａｏｒｃａｄｍｉｕｍａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｒａｎｓ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｌｅａｖｅｓｗａｓａｓｊｇｈｉｇｈａｓ１０００）ｘｇ／ｇｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ，ａｎｄｏｎｌｙ８０）ｘｇ／ｇｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔｉｎｔｈｅＲｈｉｚｏｍｅ．４ｅｒｏｌｏｏｕｘｒ－，ＷｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅＮｎｙＧＣＳｈｅｔｇｓｅｐｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ＊ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ田罕功虹班化ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉＶ巧ＧＣＳｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｌａｓＤＬＴｉａｎｓｆｏｒｍｉｎ化ｐｇ化＊＞４／姑诚巧地化放ａｎａｇａｉｎｅｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｃａｄｍｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｉｎｅｄｂｔｈｅｆｌｏｒａｌｄｉｅｔｈｏｄ．Ｔｈｒｅｅｌａｎｔｓｗｏｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｂｅｉｎｅａｒｎｅｒｓｏｆｔｈｅｇｙｐｍｐｇｎａｍｅｄ－ｔｒａｎｓｅｎｅｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆＴ１ｈｉｎｌａｔｈｈｅｍＴｌ１ｇｙｇｒｏｍｙｃｓｅｅｃｔｉｏｎｎｄＰＣＲｍｅｏｄ，ｔａｓ，Ｔｌ－２Ｔ－－ＷＴｌ３．ＴｈｅＮｎＧＣＳｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎＴｌ３ｗａｓｔｈｅｈｉｈｅｓｔＴｒａｎｓｅｎｉｃｌａｎｔｓａｎｄ，ｙｐｇｇｐｓｈｏｗｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｉｅｌｄａｎｄｃａｄｍｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＡ＾ｃｈｗｅｒｅｈｉｈｅｒｉｎｇ，ｙ，，ｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒａｌｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｃａｄｍｉｕｍ．ＵｎｄｅｒｌＯＯｐＭｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓ，ＷＴｈａｄｈｉｇｈｅｒＭＤＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄＳＯＤｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｎｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａ；ＮｎｙＧＣＳ；Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；Ｅ＾ｑｉｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｄ班地ｃａｔｉｏｎＩＶ 缩巧词缩略词英文缩写英文名称中文名称ＡｍｐＡｍｐｉｄｌｌｉｎ氨苯青霉素ＢＬＡＳＴＢａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ序列联巧搜索工具ｂｐｂａｓｅａｉｒ巧基对ｐｃＤＮＡＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ互补脱氧核搪核巧ｄＮＴＰＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ脱氧核巧核巧王巧酸￣ｎＧＣＳＹＧｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅＳｔｈｅｔａｓｅ谷巧骄半疏安谋合成酶ｙＧＦＰｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ绿色巧光爱白ＧＳＨｇｌｕｔａｉｈｉｏｎｅ谷脱甘化－■■－－－－？）ＩＰＴＧＩｓｏｒｏｌｌｔｈｉｏＤａｌａｃｔｏｓｉｄｅ异丙基硫代书！半乳糖巧ｐｐｙ３ｇＫａｎＫａｎａｍｙｃｉｎ卡那霉素苦ＬＢＬｕｒｉａ－ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍＬＢ培养基ＭＴＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ金ＩＩ谎蛋白ＮＣＢＩＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ美国国家生物信息中也ＯＲＦＯｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ开放阅读框ＰＣｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｄｎｓ植物络合素ＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ聚合酪链式反应ＲＡＣＥＲａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓｃＤＮＡ末端快速扩増ＲｉｆＲｉ＆ｎｐｉｃｉｎ利福平ＲＴ－ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｏｎｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ反转录巧合ＳＩ鞋式反应ｐｙＴａｑＴａｑｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ耐热性聚合庚ＵＴＲ．Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｒｅｉｏｎ非洒译区ｇ－－－－－＂－－ｂ－４ｌ－－－－－５０ＸＧａｌ５ｒｏｍｏｃｈｏｒｏ３ｉｎｄｏｌｙｌｐＤｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ滨斗ＩＫ３巧Ｉ巧护硫代半孔裤巧ＨｙｇＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ潮霉素Ｖ 引言引言荷花（Ａｆｅ山成／Ｃ矿ｅｍ），又称中国莲，属睡莲科莲属挺水植物。花型昨较硕大，瓣型多样。，花色艳丽，深受人们的喜爱原产我国，主要分布在淡水区域，花期主要，抗性强集中在少花的夏季，耐高温，是重要的水生观赏植物。水体重金属污染情况日益严唉一，水体汚染的修复问题亟待解决。研究表明水生植物对重金属有定的忍受能力（，１９８１）。，尤其是挺水植物和浮水植物等根系较发达的水生植物蘭疑慧等荷花具有净化水质的作用（暴雅萍等，２００６），且具有积累重金属的潜力（孔德政等，２０Ｗ）。且荷花属多年生植物，生长量大，自行巧殖能力强，对水质和止壌质量要求不严格。，可作为植物修复工程目标桓物，具有较大的研究价值近年来随着分子生物学技术的广泛运用，基因工程被越来越广泛地应用到改良种质性状方面。，同时为新品种的选育提供了新的思路关于重金属抗性基因研究在印度。芥菜，拟南芥，番茄，杨树等植物中已有研究，渉及众多基因种类本研究克隆了与荷花抗重金属相关的谷氨瞄半腕氨酸合成酶基因（ｙＧＣＳ），分折在荷花内的表达特点及对重金属領的响应表达。不仅从，并且通过构建载体转入拟南芥表达进而研究功能分子水平上探讨荷花对重金属抗性积累，也为荷花抗性能力的提髙提供技术支持，从。而丰富荷花种质资源，使荷花在水体绿化和水质净化方面发挥更大作用ｖｎ 第一章文章综述第一章文章综述１重金属及其危害一３，重金属本身并没有明确的定义，大多情况下密度是决定性因素般大于５ｇ／ｃｍ的金属被认定为重金属李德明等，２００９。重金属在不同领域的应用历史已有数千年，（）重金属会对人体和动桂物的生长发育产生非常严重的危害。（重金属进入环境的途径有很多，包括空气燃烧，提取等），地表径流（存储和释放），±壌（进入地下水和作物）等。人体会通过空气、水、食物和皮肤接触到重金属，重金属进入人体后，蛋白质，维生素，激素等物质与其结合形成重金属络合物，使机体功能发生变化甚至丧失而引起病变。微生物可使有些重金属发生甲基化作用，例如甲基束等，易挥发，可通过呼吸道进入人体。口腔与皮肤也是重金属进入人体的重要通道－ＳＨ）有较强亲和力，重金属进入人体后与某些酶的活性中也琉基（，能取（３）。代琉基上的氨，从而使酶丧失生物活性，这便是重金属的致害机理时圣刚，２０１例如长期接触一定剂量的锡会对肾脏造成损害，还会导致骨质疏松过多的铅进入人；体会影响肠胃吸收，严重的甚至会出现脑血栓等后果（于晓莉和刘强，２０１１）。摄入过量的神会増加患癌几率（Ｇｎｍｄｅｔａｌ．，２００５）。近年来我国重金属污染事件时有发生，范围广，，危害大。如２００５年广东北江韶关段锡严重超标事件２００９年湖南浏阳锦污染事故（李战和李坤，２０１０），２０１１年云南络污染事件（郭楠和田义文，２０１３），２０１２年广西锡污染事件等（罗秋香，２０１４）等都对人们的生命安全构成很大威胁，重金属污染已经引起社会各界离度重视。重金属对植物的伤害轻则影响植物体内代谢过程，重则叶片摧绿甚至死ｔ。植物受重金属毒害的一般表现为生长受到抑制，生长发育停止，出现生长缓慢，植株弱小，根系生长受到抑制甚至停止，叶片缺绿甚至发黄变褐等症状。重金属对植物的影响出现在各个生理过程，例如光合作用、呼吸作用、酶活性、细胞结构等（李秀珍和李彬，２００８刘万玲，２００６）。重金属对植物的伤害在细胞学方面则表现为诱导细胞涧亡。；重金属通过与ＤＮＡ结合形成复合物致使ＤＮＡ损化这一步在细跑调亡进程中极为关键（刘欣梅等，２００４）。此外有些重金属能够改变膜结构通透性，影响质体活性，例如一ｅｓ１９９９）。重金属络能够改变线粒体膜通透性从而影响线粒体活性（Ｆｌｏｒ，些控制细胞调亡的基因和蛋白也会在重金属的胁迫下特异表达，从而表现为外在的植物损伤。１ 荷花ＭｒＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ２水体重金属污染现状重金属在生产生活中发挥极其重要作用，人类利用重金属的历史可追溯到几千年前，在这过程中由于各种人为原因导致重金属在人们生活环境中积累得越来越多，已经远远超出环境自身可Ｗ降解的范围，不仅会破坏环境，还会威胁到人类及动植物的健康乃至生命。尤其随着采矿、冶炼、制革等行业的发展，Ｗ及人为不合理填埋、，使得各种重金属污染物进入地下水系（ＳｅｋｈａａｎｄＣｈａｒ堆放、污染物事故性排放ｙ，２００３）。重金属污染物在水体较稳定，不能被降解，当重金属在水体积累较多，达到，水体、水生动植物等水体生态系统将会遭受严重破坏对生命体致害的浓度范围，还２００６有可能在水产品中累积，通过食物链直接或间接地威胁到人类健康（孟多等）。，我国水体重金属污染问题十分严重８０．１％的江河湖库底质被污染。２００４年对太湖底，泥进行检测，发现其中铜、铅、領含量均处于轻度污染水平。黄浦江沉积物中Ｃｄ超、Ｐｂ超１倍、Ｈｇ含量明显増加州河中Ｐｂ全部超标、Ｃｄ超标７５％、Ｈ超标准值２倍；苏ｇ标６２．５％（成新，２００２）。水体重金属污染已成为全球性的环境污染问题，危及人类身体健康甚至生命。３重金属修复方法±壤和水系的重金属污染问题越来越严重，采取有效的措施进行修复很有必要，近年来国内外在这方面的研究已经取得显著成效。修复措施主要可Ｗ归结为Ｈ类：物理／化学修复、生物修复Ｗ及农业生态修复。３．１物理化学修复方法换±、去表±，深耕翻±法比较适合小面积重金属污染的物理修复。换±即将己经遭受污染的±壤部分或全部换成非污染±壤，换止的数量及厚度应尽可能多，这样才能保证重金属被完全移除。去表止则是去除表层被污染的±，对下层±壤进行活化，使重金属扩散范围加大耕作。深耕翻±通过翻动上下±壤层，从而降低单位体积重金属含量，使重金属浓度达到对植物不产生危害的程度。但是这类方法需耗费较大人、力物力和财力，成本较高，且不能从根本上清除重金属（黄益宗等３）。，２０１淋洗剂的使用能有效去除±壤重金属，这种方法称之为±壤淋洗法。影响淋洗效果的因素包括：淋洗剂种类，淋洗浓度，王壤性质，污染程度等。要取得较好的淋洗２ 第一章文章综述效果，需要综合考虑各方面因素。研究发现ＥＤＴＡ可Ｗ有效降低王壤对铅，锋的吸收率５０％左右（ＰｏｃｉｅｃｈａａｎｄＬｅｓｔａｉｉ２０１０）。±壌淋洗后会产，能够使止壌中的铜减少ｊ生淋洗剂残留的现象一，淋洗剂的处理问题需及时解决。否则会进步污染地下水，而且影响植物对必须营养元素的吸收。电动修复法去除止壤重金属也取得显著效果。这种方法利用金属离子在电流中移动的原理导出重金属并进行处理。Ｚｎ和Ｃｕ污染的±壤分别经电动修复后，助极附近±壌的Ｚｎ和Ｃｕ去除率分别达到７４．３％和７１．１％（胡宏摧，２００９）。对木材防腐剂络化神酸铜（ＣＣＡ）污染±壌进行电动修复，结果打１、Ｃｒ、Ａｓ的去除率高达６５％、７２％、７７％（Ｂｕｃｈｉｒｅｄｄｙｅｔａｌ．，２００９）。另外在止壤中加入辅助试剂可増强重金属在王壤中的溶一解性，从而提高修复效率（方丰等，２００８）。在物理修复方法中还有一种离子括抗技术，该技术利用离子间的括抗原理，当止壌中某些重金属元素浓度过商时，可Ｗ加入与其产生措抗作用且对植物危害较轻的另一种重金属一ｅｎｅ可Ｗ，后者可抑制前者对植物的进步伤害。Ｆｇ等在±壤中加入少量Ｓ抑制重金属Ｃｕ和Ｚｎ对娱蛇草的毒害作用，Ｓｅ对Ｃｕ和Ｚｎ则为括抗作用（Ｆｅｎｇｅｔａｌ．，２００９）。另外Ｚｎ与ＣｃＬ之间也存在招抗作用，向Ｃｄ污染±壤中加入Ｚｎ，可减少植物的伤害（周启星等，１９９４）。３．２农业生态修复技术农业生态修复技术是根据污染±壤的具体情况因地制宜调整耕作制度，也可Ｗ通一些能够积累重金属的超富集植物改善±壤环境过种植，改变±壤中重金属的生物有效性，减少或杜绝重金属通过作物流向食物链，危害人类健康。控制±壤水分、调节±壌６１１值，化肥、有机肥和农药的合理施用Ｗ及改变耕作制度和调整作物种类是农业生态修复主要的王种方式。±壤氧化还原状态影响±壤重金属活性还原状态的改变将导致一些金属表，氧化一样＝现出不同的毒性和迁移性。比如神和络在不同价位时，所表现出的毒性就不，价Ａｓ比五价Ａｓ毒性高，而六价Ｃｒ比Ｈ价Ｃｒ毒性高。在氧化环境下，±壤中的Ｈ价Ａｓ会被氧化为五价Ａｓ，迁移性和生物有效性降低；Ｈ价Ｃｒ被氧化为五价Ｃｒ，大大提高迁移性和生物有效性，对人类健康的威胁也随之増大。水分影响±壌氧化还原状态，因此可Ｗ通过调节止壤水分来改变止壤环境，从而改变重金属毒性。部分重金属在还原状态下会通过形成硫化物沉淀的形式降低毒性，降低可迁移率。例如在灌概水田时由于水层的覆盖，隔绝了空气与止层的接触，阻止氧气进入到止壤中，使止层处于还原２２？状态，该样硫酸根被还原为Ｓ％重金属离子与Ｓ结合可形成不易溶解的硫化物沉淀。３ 荷花ＭｉｙＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证因此，止壤环境可Ｗ通过灌概等措施来调节，Ｗ此来间接降低重金属迁移率和生物有效性。施用肥料和农药是使用最频繁的农业耕作管理措施，也是±壤重金属污染的主要一来源；方面，合理，因此可分别从这两方面来降低肥料和农药施用带来的±壤污染一改善农药和肥料配方。另方面，利用科学，最大程度降低农药和肥料中重金属含量配方合理施用化肥和农药的比例，送样既能最大限度发挥肥料和农药的功效，也可Ｗ减少赃料和农药的施用。有研究Ｗ氮肥为例证明了不同形态的肥料对于±壤重金属活＋－形式的氮肥时性的影响。研究表明植物吸收ＮＨ４和Ｎ０３，根际环境会因析出物质的＋时根系会分泌导致根际环境酸化一不同而改变，吸收ＮＨ４，但是吸收Ｎ０３时植物－环境碱化可分泌ＯＨ，根际（徐明岗等，２００６）。因此对于大多数重金属污染±壌来说，施用硝态氮肥后的主壤环境条件有助于，选择硝态氮肥比选择镑态氮肥更有意义降低重金属的迁移和生物毒性。另外改变耕作制度和调整作物种类也可Ｗ有效降低重金属污染程度。増加在重金属污染±壤中种植超富集植物种类和数量，通过多轮种植及收割将重金属移出污染区，避免重金属重新进入污染区。３．３生物修复技术生物修复重金属是指利用植物或微生物的生命代谢活动与重金属间发生作用，从而减少±壤中重金属含量或通过改变止壤中重金属化学形态进而降低毒性的修复方一式。生物修复主要通过两种方式达到对±壤中重金属的清除效果；种是通过生物与一重金属间的作用，改变重金属存在状态，降低可移性和有效性，另种则是生物体本身通过自身代谢吸收，转运重金属，减少止壤金属含量，在生物体内富集累积，Ｗ此来降低重金属毒性。１９８５年，Ｇｒｉｌｌ等率先定义了植物修复的概念：即利用绿色植物达到清除环境中污染物的目的，使重金属毒性降低或消失（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９９４）。植物主要通过提取，固定和挥发的方式减少±壤重金属含量，降低毒性。（Ｓｕｓａｒｌａｅｔａｌ．２００２）。，植物提取是指利用超富集植物吸收污染止壌中的重金属，并在植物体内把重金属从根系转运到地上部分积累起来，割除地上部分就可达到去除的效果。超积累植物即能高效地从±壤或水体中吸收高浓度的重金属，并具有将其从植株的地下部向地上部大量转运能力的植物。目前已发现４００多种超富集植物。凤尾藤属的蛟蛇草（ＰｔｅｒｉｓｖｉｔｔａｔａＬ．）是首次发现的Ａｓ超富集植物，可高效富集神，有效降低±壤中神含量（Ｃｈｅｎｅｔａｌ２００２。ｅｒｉｓｃｒｅ．、粉叶藤．）后续发现同属凤尾藤属的大叶井口边草（ＰｔｔｉｃａＬ），４ 第一章文章综化（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａｃａｌｏｍｅｌａｎｏｓ）也是神的超富集植物（韦朝阳等，２００２）。张杏峰等发ｘ现杂交狼尾草（Ｐｅｉｍｉｓｅｔｕｍａｍｅｒｉｃａｎｕｍ（Ｌ．）ＬｅｅｋｅＰ．ｕｒｕｒｅｕｍＳｃｈｕｍａｃｈ）和热研ｐｐ１１号黒巧雀稗（Ｐａｓｐａｌｕｍａｔｒａｔｕｍｃｖ．ＲｅｙａｎＮｏ．ｌｌ）分别对Ｚｎ和Ｃｄ具有超富集作用（Ｚｈａｎｅｔ址２０１０）。另外，在植物修复过程中，高效莖合剂的使用也有助于提高重ｇ，金属回收率。例如，在龙葵富集Ｚｎ试验中添加ＥＤＴＡ，叶部、茎部和根部富集Ｚｎ浓度分别提高２３１％、９３％和８１％；添加ＥＤＤＳ导致龙葵叶部、茎部和根部Ｚｎ积累浓度都得到了提高，叶片部位竟提高１４０％、茎部和根部分别提商了１２４％和１０４％（Ｍａｒｑｕｅｓｅｔａｌ．，２００８）。天然蠻合剂梓樣酸、草酸、酒石酸等也有助于植物富集重金属。植物根系分泌的特殊物质可使重金属存在形态发生变化，有的可变为挥发态排出植物体，这种方式称为植物挥发。仅适用于某些重金属，例如Ｓｅ、Ｈｇ、Ａｓ污染的±壤可Ｗ利用这种方式达到清除污染物的效果。洋麻可使王壌中Ｈ价砸转化为挥发性的甲基砸从而去除砸（Ｂａｎｕｅｌｏｓｅｔａｌ．１９９７）。种植烟草的±壌中乗被转化为气态的束，而把±壌中的亲去除（Ｍｅａｇｈｅｒ，２０００）。植物固定是指植物利用根系固定王壤重金属。植物根系吸收积累或者吸附重金属在根系表面。植物固定可Ｗ有效控制王壌中，根系分泌物也可将重金属固定在根际中重金属的迁移，增大重金属流向地下水的阻力，也可Ｗ避免向空气的排放及其在食物链中的传递。植物固定技术对干旱、半干旱区等尾矿堆置地植被重建的实现具有应用价值（ＭｅｎｄｅｚａｎｄＭａｉｅｒ２００８）。例如，串叶松香草（ＳｉｌｈｉｕｍｐｅｒｆｏｌｉａｔｕｍＬｉｎｎ）可，ｐ应用于Ｃｄ污染±壌的修复（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１０）。此外一，微生物因其特殊的生存环境和些特有的代谢机制，在生物修复中也发挥－着很大作用。某些微生物如真菌，细菌等对重金属具有吸附、沉淀、氧化还原等作用，可Ｗ降低重金属毒性。细菌本身及其代谢产物对离子态的金属离子也有很强活化能力，可Ｗ把重金属吸附固定在±壌中。例如在香蒲（呀ｐ／ｊｆｌ／ａｈ诉化Ｊ）根际中就发现了一些能够純化固定±壌中Ｃｕ、Ｃｄ的菌株，可降低±壌中可交换态重金属含量（Ｔｉｗａｒｉｅｔａｌ．２００８）。，另外，不同菌种对于重金属的作用机理并不相同，因此根据不同的目的选用不同的茵种是提商微生物修复效率的关键。一Ｗ上兰种重金属修复方法的应用试验已经在国内外些地区开展。这Ｈ种方法各有利弊，物理化学修复方法需耗费较大人力、物力和财力，成本较高，且不能从根本上清除重金属。农业生态修复方式同样需耗费较大人力物力，且农药和肥料的施用会造成二次污染。而生物修复则拥有其他两种技术所不具各的优势：生物修复可１＾＾对±壌和水体同时修复，成本低廉，能够大规模推广，可通过后期对植物的处，生态安全理进行重金属回收。另外绿色植物不仅可Ｗ净化和美化环境，还能活化生壌环境，提。高±壤肥力，达到绿色环保可持续的长远效果关于植物修复的缺点则在于植物对±５ 荷花Ｗ巧基因克隆、表达及功能验证壌重金属修复种类较单一而且超富集植物生长缓慢亟待解决的问，，修复速率慢也是一一题之。对于Ｗ上植物修复缺点需要进步研究改进。４植物的重金属抗性机制植物修复技术可有效降低主壤重金属毒性一，在此基础上还能増大绿化面积，是＞种既环保又高效的修复方式。对植物抗性机制进行深入研究发现植物主要通过１＾１下几。种途径将重金属积累在体内从而降低毒性，达到修复污染±壤或水体的效果４．１寶合作用在重金属污染±壤中生长的植物内含有对重金属有较高亲和力的大分子，通过吸收并结合重金属离子形成聲合物，从而降低±壤中重金属浓度，在植物中达到富集金属降低毒性的作用（Ｍｅｉｎｈａｒｔ，１９９６）。在植物中主要发现两种重要的重金属结合蛋白，即金Ｍ硫蛋白（Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，简称ＭＴ）和植物络合素（Ｐｈｙｔｏ油ｅｌａｔｉｏｎ，简称ＰＣ）。金属硫蛋白广泛存在于生物体内，富含半腕氨酸、能被重金属诱导，首次在马肾中提取出ＭＴ（Ｍａｒｇｏｓｈｏｅｓａｎｄｖ址ｅｅ，１９５７）。后来研究表明ＭＴ广泛存在于动物、植物及微生物中，由基因编码直接得到。关于植物中ＭＴ的研究则最早在小麦胚乳Ｅｃ蛋白ａｎｅｅａ１５）。（Ｌｔｌ．８７）之后，从就豆、巧南芥、番茄等多种植物中克隆出ＭＴ基因（Ｍａ，ｅｔａｌ．，２００３；Ｇａｒｃｉａｅｔａｌ．，１９９８；Ｗｈｉｔｅｌａｗｅｔａｌ．，１９９７），对ＭＴ蛋白的功能研究都证实其具有较强的重金属藝合能力。一另种重要的植物金属结合蛋白是植物络合素（ＰＣ）。和ＭＴ相同的是，ＰＣ也是含丰富半脫氨酸的多肤，其中半腕氨酸的琉基能与重金属发生络合作用而实现解毒功能（Ｔｅｎｎｓｔｅｄｔｅｔａｌ．２００８）。与ＭＴ不同的是，ＰＣ并非由基因编码直接得到，而是Ｗ，谷脫甘肤为前体，在植物络合素合酶的催化作用下合成ＰＣ（Ｒａｍｏｓｅｔａｌ．，２００８）。目前，在拟南芥（Ｈａｅｔａｌ．，１９９９），百脉根（Ｒａｍｏｓｅｔａｌ．，２００８），荷花（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１２）等植物中已经获得编码该酶的基因，研究结果都表明ＰＣ通过与重金属墓合形式存在来降低重金属对植物细胞的毒性（Ｚｈａｏｅｔａｌ，．２０１４）。ＰＣ合成受重金属离子诱导，不同重金属离子对其诱导能力存在差异，研究表明領是最佳诱导剂。拟南芥ＡＰＣＳ突变体对領商度敏感，过量表也会改变植株領积累量和耐受能力（Ｇｒｉｌｌｅｔａｌ．２００８）。，６ 第一章文章综述４．２区室化作用区室化作用下植物利用复合物将重金属离子结合后转运到液泡中，Ｗ这样的方式。降低重金属对植物的伤害，也达到富集的效果例如矯胁迫下，植物细胞会分离出两－－Ｃｄ复合物ｓｌｏｌ山ａｒｗｉｈＭＷ种ＰＣ，低分子量ＰＣＣｄ复合物（ｗｍｏｅｃｅｇｔ，Ｌ）和高分子量－ｓｈＰＣＣｄ复合物（ｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ，ＨＭＷ。这两种复合物作为载体将原生质体内）的重金属运输至液泡，从而减少重金属对细胞毒性（Ｏｒｔｉｚｅｔａｌ．，１９９２）。植物体分离２＋２＋出的液泡置于Ｚｎ溶液中，结果液泡中有Ｚｎ的积累，在高耐受重金属的遏藍菜属植一致的结果物的根与地上部分也得到与此，这些都表明液泡区室化重金属是植物抵御２０００。重金属的重要机制（王剑虹和麻密，）４．３细胞修复植物还可Ｗ通过细胞修复机制减轻金属伤害。例如铜对细胞的毒害是使原生质膜２＋受损，而植物则通过修复原生质膜进行防御（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，１９９７）。拟南芥在Ｃｕ胁迫下，会形成酷基载体蛋白（ＡＣＰ）和己酷辅酶Ａ结合蛋白（ＡＣＢＰ）。研究表明细胞膜脂代谢过程均需要这两种蛋白的参与。而且ＡＣＢＰ的反义负调节表达试验结果显示植物对铜的敏感性増加（Ｓａｌｔｅｔａｌ．１９９８），说明ＡＣＢＰ在铜解毒过程中的重要作用。，这些结果都证实了细胞对铜耐性的膜修复机制。５基因工程在植物修复中应用应用基因工程手段将与重金属积累相关的基因导入目的植物并使之表达，使转基因植物具有积累重金属或提高重金属耐受为的生物特性，达到解毒重金属的效果，这。种技术称为基因工程修复。该技术经济成本较低，效果持久种植绿色植物的同时又能积累重金属，减少±壤和水体中重金属含量，既能美化环境又能减少污染。近年来，利用基因工程技术发现了越来越多与重金属积累耐性相关的基因。研究发现与植物区室化积累重金属机制相关的是细胞内存在的两类膜转运器；ＡＴＰ结合盒ＡＴＰ－转运器（ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｅ，ＡＢＣ）和阳离子扩散促进器（Ｃａｔｉｏｎｄｉｆｉｉｓｉｏｎｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ，ＣＤＦ）。在植物中发现较早的液泡膜ＡＢＣ转运器是ＨＭＴｌ（Ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ），ＨＭＴＩ一－Ｃｄ复合物向液泡转运形成高分子量ＰＣ－Ｃｄ复合物相关的蛋白是种与低分子量ＰＣ，ＰＣ－ｔ位于细胞液泡膜上Ｃｄ和植物蟹合素的跨膜运输（Ｏｒｔｉｚｅａｌ．１９９５），在燕，调节，７ 荷花ＭｉｙＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证一ＢＣ型转麦中发现该转运器的功能（ＳａｌｔａｎｄＲａｕｓｅｒ１９９５）。另个与锅耐性有关的Ａ，ｅａｓｔｃａｄｍｃ－运器是酵母福（Ｙｉｕｍｆａｔｏｒ，ｙＣＦ７）基因，在细胞内起谷脱甘肤Ｓ共觀系作化通过结合Ｃｄ并将其运输至液泡达到区隔的目的（Ｌｉｅｔａｌ．１９９７）。表达拟南汹ＷＴＰ，基因的植物表现出Ｚｎ耐性升高（ＶａｎｄｅｒＺａａｌｅｔａｌ．１９９９）。Ｎｉ遏蓝，在超富集菜属植物一ｒ各Ｍ０Ｔ中分离出种编码金属忍耐蛋白基因（７ＰＪ），能够修复酵母菌Ｃ１和ＺＲＣ１缺２＋２＋陷型突变株的敏感性状，Ｃ０Ｔ１和ＺＲＣ１是位于酵母菌液泡膜上与Ｃｏ和Ｚｎ耐性有关的ＣＤＦ蛋白，因此巧如可能与金属离子向液泡转移有关（Ｋｉｍｅｔａｌ．２００４）。，一些转运器基因外一除了，在桂物体内些合成金属结合蛋白的基因对于植物重金属耐性和积累量也有重大贡献。编码合成ＭＴｓ蛋白的因的功能研究已经非常深入和成熟。动植物中Ｍ７基因的部分功能是相同的，将小鼠ＪＷ７Ｗ基因转入到烟草中，结果得到对重金属锡有抗性的烟草株系（Ｆｅｎｇｅｔａｌ．，１９９４）。植物中Ｗ基因根据结构不同分为四种类型，这四种类型因在植物体内的表达具有组织特异性，不同植物中所含始？《因类型不同而且在植物不同生长发育时期所含种类也不同（Ｆｏｌｅｙａｎｄ＂２＋Ｓｉｎ典１９９４）。因受Ｃｕ诱导表达，拟南芥幼苗经Ｃｕ处理后，Ａｍａ表达量升２＋２＋高。１０ＭｍＣｕ处理烟草可他因表达量提高２倍多，而５０ＭｍＣｕ则降低达２＋量。不同植物基因受诱导重金属种类不尽相同，Ｍｎ能诱导番茄中基因表达升２＋２＋２＋高。蚕豆叶片经Ｃｕ，Ｆｅ，Ｚｎ处理后，ＭＴｌ表法下降。紫羊茅在Ｃｄ和Ｃｕ处理后，＾因表达明显増强（常团结和朱巧，２００２）。在酵母突变株ｃｕｐｌ中表达来自拟南。芥的和该突变体内剔除了内源的因户，表现为对金属离子敏感而表达＾＾７和的酵母突变体对打１８〇４和£（１８〇４的抗性増强，说明的？７和＾１＾２与Ｃ哗产在功能上具有同源性（２ｈ〇ｕａｎｄＧｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈｊｌ９９８）。ＰＣｓ作为植物细胞内重要的金属结合蛋白，ＰＣｓ合成相关基因在植物重金属解毒过程中也发挥着举足轻重的作用（ＣｏｂｂｅｔａｎｄＧｏｌｄｓｂｒｏｕ典２００２）。谷脱甘化（ＧＳＨ）被证实为ＰＣ合成的前体－谷。以谷氨酸、以半腕氨酸和甘氨酸是ＧＳＨ合成的原料，在Ｙ氨醜半脱氨酸合成酶ＣｙＧＣＳ）和ＧＳＨ合成酶（Ｇ巧的共同作用下生成ＧＳＨ。ＧＳＨ在植物络合素合酶作用下生成植物络合素ＰＣｓ（Ｇｒｉｌｌｅｔａｌ．１９８９）。研究表明参与ＰＣ合成过程，的基因对于重金属解毒都有不同程度的贡献。例如，拟南芥ＡｔＰＣＳｌ突变体对锅高度敏感，过量表达心化及？可［＾改变植株锅积累量和耐受能力（Ｃｏｂｂｅｔｅｔａｌ．，１９９８）。在芥菜中表私皆ＣＷ基因，可提高对Ｃｄ和Ｚｎ的耐受力，但是根和茎中的金属积累量并没提高（ＧａｓｉｃａｎｄＫｏｒｂａｎ２００７）。从荷花，通过，中克隆得到基因转基因技术导入拟南芥后，获得锡积累量和耐受能力都明显高于贤生型的转基因拟南芥，转基因植株内箱积累量是致生型２倍多。无矯培养时，拟南芥植株内检测不到口。而在１００＾１＾箱处理情况下，转基因和野生型拟南芥植株体内ＰＣ含量都显著増加，且转基因植株ＰＣ８ 第一章文章综述含量大于野生型植株（Ｌｉｕｅｔａｌ．２０１２）。这些研究结果都足Ｗ证明ＰＣ合酶在植物重金，属解毒过程中的重要贡献。谷脱甘肤的作用体现在植物各个代谢过程和调节机制中，尤其在应对外界非生物胁迫过程中更为重要（ＸｉａｎｇａｎｄＯｌｉｖｅｒ，１９９９、ＧＳＨ的合成需要两种酶的参与，即ｙＧＣＳ和ＧＳ，这两种酶也与植物重金属解毒机制之间存在联系。ｙＧＣＳ作为ＧＳＨ合成过程中的限速酶，调控ＧＳＨ合成并受ＧＳＨ反馈抑制调节（Ｎｏｃｔｏｒｅｔａｌ．，１９９８）。转入反义的ｙＧＣＳ基因，可Ｗ得到ＧＳＨ水平降低的拟南芥植株（Ｍａｙｅｔａｌ．，１９９８）。转入ｙＧＣＳ和Ｇ旌因的印度芥菜植株内，铺积累量増加５０％，且ＰＣ和ＧＳＨ含量都显著升高（Ｚｈｕｅｔａｌ．，１９９９；Ｚｈｕｅｔａｌ．，１９９９）。锅胁迫下玉米幼苗ｙＧＣＳ基因受诱导，在根部表达水平升高，且随铜浓度増大，酶活性逐渐升高，ＧＳＨ含量也显著提高（ＲｕｅｇｓｅｇｇｅｒａｎｄＢｒｕｎｏｌｄ，１９９２）。一致的是与此结论，离体培养的番茄细胞经領处理后ＧＳＨ和ＰＣ含量升高，ｙＧＣＳ酶活性相对对照组显著升高（ＣｈｅｎａｎｄＧｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈ．１９９４）。，６植物修复应用前景一植物修复作为种新兴的去除±壤和水体重金属的技术，因其绿色环保的技术原理，经济成本低，应用范围广，回收重金属可二次利用等特点，符合公众需求，具有－Ｓｍ巨大的应用潜力（Ｐｉｌｏｉｉｉｔｓ２００５）。目前，植物修复应从Ｗ下几方面考虑来提高修，复效果一二，是寻找更有效地富集重金属的植物品种，即超富集植物。是充分利用基因工程手段，挖掘更多有效抵抗重金属的基因，通过转基因技术产生更多可Ｗ解毒和富集重金属的植物种类一。Ｈ是由于些超富集植物植株矮小，生长缓慢等特点，可Ｗ综合利用基因技术使超富集植物具有生长量大的同时兼备解毒重金属的特性（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｔａｌ．１９９５Ｅｂｂｓｅｔａｌ．１９９７）。依据实际需求，合理调整种植策略，使，；，植物修复效果达到最优化。但是，基因工程所带来的潜在危险及其副作用尚存在争议一（ＥｌｌｉｓａｎｄＳａｌｔ２００３），还需要进步长时间的验证和探索（Ｐａｌｍｒｅｎｅｔａｌ．２００８）。ｊｇ，９ ■第二章荷花ＷｎｙＧＧＳ基因克隆及序列分析第二章荷花＇／ｎＧＧＳ基因克隆及序列分析ｉｙ－摘要：Ｙ谷氨醜半化氨酸合成酶（ｙＧＣＳ）是谷化甘肤（ＧＳＨ）合成过程中的限速酶，参与调节Ｇ細合成，并在植物应对外界胁迫过程发挥作用。Ｖ乂荷花叶片为材料，ＰＣＲＲＡＣＥ技术获ｉＷ采用简并引物和得荷花ｉｙＧＣＳ基因全长ｃＤＮＡ序列，命違为ＭｚｙＧＣＳ。该基因全长１８０１ｂｐ，开放阅读框（ＯＲＦ）１５６９ｂｐ，编码５２２个氨基酸，且具有典型的ＧＣＳ２基因家族结构域。系统进化分析表明荷花ｙＧＣＳ属于双子叶植物亚类，与龙眼，百脉根等亲缘关系较近，而与单子叶植物水稻，玉米等亲缘关系较远。－谷氨耽＋化氨酸合成醇达分析关键词：克隆Ｙ；荷也基因；表谷氨酷半脫氨酸合成酶（ｙＧＣＳ）是谷脫甘化（ＧＳＨ）合成过程中的限速酶，过表达该基因的转基因植物ＧＳＨ含量明显提窩（Ｔａｋａｏｅｔａｌ．２００４）。ＧＳＨ在植物络合素，合成过程中扮演其前体的角色，所提高ＧＳＨ水平能够影响植物络合素合成。在ＧＳＨ水平降低的拟南芥植株中，其植物络合素合成的能力显著降低，从而表现出对Ｃｄ的敏感性。植物络合素在植物中广泛存在，可与重金属离子塾合成稳定的硫化化合物，这些复合物通过转收和积累更多的重金属污染物，提髙修复效率（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，２０００）。可见谷氨戚半脫氨酸合成酶在植物修复中的间接作用不可小勵。目前已经在水稻（彭凌涛等，２００４），酿酒酵母（Ｆａｎｅｔａｌ．，２００４），己西橡胶树（邓治等，２０１２）等植物中克隆得到谷氨蘭半脱氨酸合成酶基因。荷花，又称中国莲，属于睡莲科莲属大型多年生挺水植物，是中国传统十大名花一之，花型大、瓣型丰富且颜色艳丽，具有很高的观赏价值和经济价值，大多分布于一淡水地区，抗性强，是深受大众欢迎的水生植物之（李春枝等，２０１１）。另有研究称荷花具有积累重金属的潜力（Ｖａｊｐａｙｅｅｅｔａｌ．，１９９９），并能够净化水质（憂雅萍等，２００６‘）。但关于荷花ｙＧＣＳ基因的研究尚未有报道。本研究耐深水荷花品种台城拂翠’为材料克隆出谷氨醜半腕氨酸合成酶ＧＣＳ（ｙ）基因，并对该基因序列进行分析，为从分子水平上解释该基因在荷花解毒重金属过程中所起的生理作用提供理论依据，同时对丰富荷花基因库及培育荷花或其他耐重金属新种质奠定基础。１１ 荷花ｗｗＧｃｙ基因克隆、表达及功能验证１材料与方法１．１植物材料‘’自江苏省南京市艺莲苑桂物材料为荷花品种台城拂翠，引。试验于２０１３年在南一京农业大学花并遗传与育种实验室进行。荷花用根状茎栽培，定植于规格致的周转－５０ｃｍ３８ｃｍ高２９ｃｍ，放。７８周左右，选箱中（长，宽，）置于避雨温室内待生长到一取长势致的健康植株进行实验。取荷花叶片用于基因克隆。样品经液氮速冻后于’－Ｃ长期保存８０。１．２试剂与仪器１．２．１试剂ＲＮＡ快速提取试剂盒购自原平瞧生物技术公司，ＲＮＡ快速提取试剂盒购自原平瞧生物公司；ＤＮＡ片段纯化回收试剂盒（Ａｇａｒｏ化ＧｅｌＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０，ＴＡＫＡＲＡ）；ｃＤＮＡ合成试剂盒（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ虹ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｘＰＣＲ反应试剂（ＴＡＫＡＲＡ）：２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ；ｌＯＰＣＲＢｕｆｅｒ；ＴａｑＤＮＡ聚合酶；’，Ａ５ＲＡＣＥ试剂盒（５ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄｍｐＵｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓｋｉｔＶｅｒｓｉｏｎ２．０，Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ）粒ＤＮＡ小提试剂盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴＰｌａｓｍｉｄＰｕｒｉ扫ｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２．０ｇ；质ＴＡＫＡＲＡ）；限制性内切酶（ＴＡＫＡＲＡ）；２０００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）。１．２．２仪器设备°。°－Ｃ冰ＶＣＯ－仁職－、７０箱（ＲＥ）、２０、４Ｃ冰箱气龍湿震荡箱、水浴锅、恒温培养箱（ＭＣ００７２２，ＭＭＭ）、烘箱、低温冷冻离也机（Ｃｅｎｔｒｉｆｏｇｅ５８１０Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、凝胶电泳系统一（北京六仪器），紫外凝胶成像系统（ＪＳ３８０，上海培清）、制冰机（ＳＡＮＹＯ）、－＾ＲＡＤ－普她ＣＲ仪（ＰＴＣ２００，Ｂｉｏ）、超净工作台（ＨＳ８４０Ｕ，苏州净化）、全自动高压－３５６０－灭菌锅（ＴＨ）、巧光定量ＰＣＲ＾统（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００，ＣｏｒｂｅｔＲｅｓｅａｒｃｈ）。１．２．３菌株与载体－Ｔ购自大连宝生物公司菌ＤＨ５ａ购自天根公司克隆载体ＰＭＤ１９，大肠杆。引物合成和测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。１２ 第二章荷花ＷｗＧＣＳ基因克隆及序列分析１２．．４引物序列用Ｐｒｉｍ－ｉｅｒＰｒｉｍｅｒ５软件设计基因克隆过程中所需的所有引物序列，见表２１，上海捷瑞生物工程有限公司负责合成和测序。表２－１荷花ｙＧＣＳ基因克隆及表达分析所用引物序列－Ｔａｂ．２１ＰｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｎｅｎｅｃｌｏｎｉｎａｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｓｅｓｏｆＮｅｌｕｍｎｕｃｉｅｒａＧＣＳｌｅｒｉｉｇｇｄｂｏｑｐｙｆｙ’，—弓ｒｉＳｅｕｅｎ优１物Ｐｒｉｍｅ序歹ｊｑ５３（）ＧＣＳ－ＦＣＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴｃａｃａｒａｃｎｙｔｇＧＣＳ－ＲＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧｔｔｙｔｃｃｃａｒｔｃＪ－ｉａｎｇＴＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＪｉａｎｇ－ＲＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＳ－Ｇ３１ＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＣＣＧＡＣＡＣＧＣＳ－Ｇ３２ＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＰＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＵＧＧＧ口ＧＧＧ口ＧＡＵＡＰＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＳ－Ｇ５１ＣＣＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＳ－Ｇ５２ＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＳ￣Ｇ巧ＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＧＧＣＧＣＳ－ＷＦＡＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＧＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＧＣＳ－ＷＲＴＣＡＡＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＡＴＴＧＡＣＣＣＣＮｎＡｃｔ－ＦＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＡＴｉｎＮｎＡｃｔｎ－ＲＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＡｉＡｔＡｃｔ２－ＦＴＴＣＧＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣＡＡｃ２－ＲＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＣｔｔ１．３实验方法１．３１．基因简并引物设计在ＮＣ朗中用ＢＬＡＳＴｎ比对，根据洋葱八化Ｃ巧ａＡＡＬ６１６１０、拟南芥（）凤－幻６／麻如ＣＡＡ７１０７５）、黄瓜（Ｃｗｃｗｗｗｓ如ｚＶｍｓＡＤＫ７７８８巧、龙眼（／ｗｏｃａ巧ｕｙ／〇／２沪７１ＡＦＦ１８８４４）、己西橡胶树（优ｖｅａＡＤＥ０６２％）、百脉根（Ｚｏ化’＊ｙ巧？ｏｗｃｗＡＡ０４５８２１）、水稻〇７ｚａ口挪〇人巧ｏＷｃ幻仿０１／片ＣＡＤ４８５９９）、梨（兮ｍｓ（Ｃ幻旅／７口如ＡＨＣ０２６９９）、菜豆（戶／ｚｏｙｅｏ／ｕｙｖｍ／复ａ／ｌｓＡＡＦ２２１３６、魏豆（仍ｙｗ／ｗＳ加ＶＭ／ｎ）ＡＡＦ２２１３７）、百日菊（Ｚ如ｅ／巧ＢＡＤ２７３９０）、玉米（Ｚｅａ／ｍａｙｓＣＡＣ８３００５）、小麦’‘ＴＷ一（／ｚｃｗ／ｗａｅ饥ＶＵ／ＷＡＡＷ５８１４７）等的ｙＧＣＳ氨基酸保守区域设计对简并引物，ＧＣＳ－ＦＧＣＳ－民２－和（表１）。１３ 荷花ＡＴ／ｙＧＣｙ基因克隆、表达及功能验证１．３．２ＲＮＡ提取ＲＮＡ提取步骤及方法见附录一。１－．３．３ＩｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ合成及检測（１）在蛋白酶Ｋ处理过的ＰＣＲ管中配置混合体系；ＴｏｔａｌＲＮＡ１．０ｉｌｊＯＵｏｄＴｉ８Ｐｒｉｍｅｒ５０Ｍ２．０ｉｇ（）（ｐ）ｐＲＮａｓｅＦｒｅｅ味０９．０［ｊ１Ｔｏｔａｌ１２．０（２）锅旋混匀，７０Ｃ保湿１０ｍｉｎ后迅速在冰上冷却２ｍｉｎＷ上。（３）离也数秒使混合液聚集在ＰＣＲ管底部。（４）在上述ＰＣＲ管中配置下列反转录溶液：上述ＲＮＡ反应混合液１２．０山ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅｄｄＨａＯＬ７ｉｐ５ＸＭ－ＭＬＶＢｕｆｅｒ４．０＾１ｄＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ（ｌＯｍＭ）１．０ｉｐＲＮａｓｅｉｔｒ０．ｉｌＭｉｉｂｏ５（ＲＴａｓｅＭ－ＭＬＶ０乂ＷＴｏｔａｌ２０．０（５）４２Ｃ延伸Ｉｈ。Ｃ讓－（６）７０５ｍｉｌ垢冰上冷却，綱觀ＤＮＡ可用于ＰＣＲＴ増，也可置于２０Ｃ保存。（７）根据荷花肌动蛋白基邸（登录号３序列设计引物ＮｎＡｃｔｉｎ－Ｆ：ＥＵ１３１１５）－Ｒ２－１ＰＣＲ和ＮｎＡｃｔｉｎ表，Ｗ荷花肌动蛋白基因作为内参基因进斤，检测ｃＤＮＡ合成水平。（）ｄｄＨｚＯ１５．８ｉｌｔ…ｘＰＣＲＢｕｆｅｒ２．５片１２＋Ｍｇ１．５ｊｉｌｄＮＴＰ（ｌＯｍＭ）２．０ｌｎＮｎＡｃｔｉｎ－Ｆ〇ｎＭ）１（ｌ．０ｌｎ－ｉＭ）ＮｎＡｃｔｉｎＲ（ｌＯ１．０ｊ山ＴａｑＥ（５Ｕ／ｎＬ）０．２｜ｘｌｃＤＮＡ１．０＂１Ｔｏｔａｌ２５．０山＂＊反应条件为；９４Ｃ预变性５ｍｉｎ；９４Ｃ变性３０ｓ，５０Ｃ退火３０ｓ，７２Ｃ延伸３０ｓ，３０个循环！７２Ｃ延伸７ｉｎ。ｍ取适量进行琼脂糖凝胶电泳检测，方法如下ｘＴＡＥ：首先用５〇溶液配置质量分数为１％的凝胶，将冷却后的凝胶先放在合适的电泳板上再放入电泳槽，加入５０ＸＴＡＥ溶１４ 第二章荷花Ｗ巧ＧＣ？基因克隆及序列分析液，保证完全覆盖凝胶且要适当高于凝胶表面。选择合适量程的移液枪将上述反应液一加入胶孔中。观察条带大小及质量并拍照保，开启电泳仪，定时间后，关掉电泳仪存。１．３．４ＰＣＲ扩増（１）：先５０００ｒｍ离也３０ｓ按引物订单说明加入适量ｄｄＨ２０干粉引物稀释ｐ；；水合２ｍｉｎ；祸旋１５ｓ。（２）Ｗｃ－－Ｆ－ｌ．３．３中合成的ＤＮＡ为模板Ｗ表２１中兼并引物ＧＣＳ和ＧＣＳＲ为上下游Ｒ扩増’，引物，进行中间片段ＰＣ反应体系同１．３．３（７）反应条件为；９４Ｃ预变性５ｍｉｎ；°‘’‘’９４Ｃ变性３０Ｓ，５０Ｃ退火３０ｓ，７２Ｃ延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２Ｃ延伸７ｍｉｎ。４Ｃ保湿。１．３．５片段纯化与连接转化（１）目的片段切胶纯化回收见附录二。（－ｓｅ２）纯化片段连接ｐＭＤ１９Ｔｉｍｌ载体，连接体系如下ｐ：ＰＣ民ｒｏｄｕｃｔ２．０ＪｐｐＴ－ｖｅｃｔｏｒ０．５ｉｌ）ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ２．５ｉｌ｜Ｔｏｔａｌ５．０ｌｎ’将上述反应液混合均匀，于１６Ｃ连接４５ｍｉｎ。’连接产物转化／－８０Ｃ冰箱取出（３）：将大肠杆菌感受态（１００叫支）从放在冰盒里解冻，待其融化后加入５山ｔ述混合液揽拌均匀，冰盒中放置３０ｍｉｎ。冰浴结束，’Ｃ水浴热击９０ｓ－进行４２，之后即刻转移到冰盒３５ｍｉｎ。向上述混合液中加入离也管２／３Ｂ口’体积的无菌Ｌ液（无抗生素），摇匀。用封膜将离也管封口３７Ｃ摇，放在床培养１ｈ。１２０００１１１离必１，１１混匀菌液巧１１１１１１后吸掉上清使液体仅剰余１００［，和菌体，利用移ＬＢ平板（ＡｍＸ－ａ圧ＴＧｌ）液枪将混合液放在含有ｐ，，ｇ上，用无菌玻璃棒涂抹，将平‘一板有培养基的面置于上方，放在３７Ｃ烘箱过夜培养。１．３．６重组子筛选及测巧从平板培养基上随机挑取白色的阳性单菌落放入１．５扯离也管中，加入７００ｉＬＬＢｆ’－ａ－液体培养基（含Ａｍｐ，ＩＰＴＧ，Ｘｇｌ），在３７Ｃ摇床振荡培养２ｈ３ｈ。取１叫菌液作为ＧＣＳ－ＦＧＣＳ－ＲｊＳ行ＰＣＲ反应。根据凝胶电泳跑胶结果挑取阳性模板，利用特异引物，菌液送上海斯普金公司测序。１５ 荷花ＡＭＸ进基因克隆、表达及功能验证’１－．３．７３ＲＡＣＥＰＣＲ扩増（１）根据已经得到的目的基因中间保守区域的序列，设计两条正向引物作为’３ＲＡＣＥ反（２－１）应的上游引物表。一－（；２）＾Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ田为逆转录酶，ＷＪｉａｎｇＴ为反转录引物，合成ｃＤＮＡ的第链：ＴｏｔａｌＲＮＡ１．０＾１Ｊ－ｉａｎＴ２．０ｉｌｇ［ＲＮａｓｅＦｒｅｅ味Ｏ９．０ｉｐＴｏｔａｌ１２．０ｉｐ＂稍搞旋泥匀，７０Ｃ保湿ｌＯｍｉｎ后迅速在冰上冷却２ｍｉｎｌＵ上。离也数移使源合液聚集在ＰＣＲ管底部。在上述ＰＣＲ管中配置下列反转录溶液：上述ＲＮＡ反应混合液口．０山ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ１姐ｄ（２〇１．７ｊ５ＸＭ－ＭＬＶＢｕｆｅｒ４．０１＾ｄＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ（ｌＯｍＭ）１．０ｉｐＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．５ｉｐＲＴａｓｅ－ＭＬＶ１Ｍ０．８＾Ｔｏｔａｌ２０．０１片？，４２Ｃ延伸ｌｈ。７０Ｃ５ｍｉｎ后冰上冷却ｃＤＮＡ可用于３ＲＡＣＥ扩増，也可保温１，得到的’置于－２０Ｃ保存。一－－（３）ＪｃＤＮＡ的（＾ｌ合成的第链为模板，用特异引物ＧＣＳＧ３１和接头引物ＪｉａｎｇＲ一进行第轮ＰＣＲ，反应体系同１．３．３（７）。反应条件为；９４Ｘ：预变性４ｍｉｎ；９４ｒ变性３０ｓ，５５ｒ退火３０ｓ，７２Ｃ延伸９０ｓ，３５个循环；７２Ｃ延伸７ｍｉｎ。一＾物稀释１００倍－（４）将第次ＰＣＲＪ，稀释产物为模板，用特异引物ＧＣＳＧ３２和Ｊ－二接头引物ｉａｎｇＲｊ进行第轮ＰＣＲ，反应体系及反应条件均同步骤（３），扩増产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收第二轮ＰＣ民产物片段。－（５）纯化产物的连接转化、筛选及测序．３．４１．３．６。，方法同１’１．３．８５ＲＡＣＥ根据已获得的目的基因片段’，设计兰条反向互补的特异引物作为５ＲＡＣＥ的下游－１所示引物，序列如表２。（１）反转录：ＲＮａ－ＦｒｅｅｓｅｄｄＨｊＯ９．０ｉｐＧＣＳ－Ｇ５１（１０Ｍ）２ｌ．０ｎＭＴｏｔａｌＲＮＡ１．０＾１Ｔｏｔａｌ口？０ｉｐ１６ 第二章荷花ＭｙＧＣＳ基因克隆及序列分析‘Ｃ保温ｍｉｎ后迅速在冰上冷却２ｍｉｎ。稍祸旋混匀，７０ｌＯｌ＾上离也数秒使混合液聚集在ＰＣＲ管底部。在上述ＰＣＲ管中配置下列反转录溶液。上述反应混合溶液１２．０叫ｘＭ－ＭＬＶｅｒ５Ｂｕｆ４．０叫ｄＮＴＰｓＭｉｘｔｕｒｅ（ｌＯｍＭ）１．０山ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ０．５ｉｌｊＲＴａｓｅ－ＭＭＬ０．８叫ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅＨｄｄｉＯ１．７ｘｌ［Ｔｏｔａｌ２０．０ｘｌ｜（２）ＰＣ艮产物回收见附录Ｈ。（３）ｃＤＮＡ加尾。ｄｄＨ２０氏５叫ＳｘＴａｉｌＢｕｆｅｒ５ｉｌ．０｜ｄＣＴＰ口ｍＭ）２．５叫纯化ｃＤＮＡ１０．０叫Ｔｏｔａｌ２４．０ｐｊ’Ｃ２－ｎｎ将上述混合液稍离也，９４，３ｍｉ，然后冰浴１ｍｉ，稍离也置于冰上，加入１°？ＴｄＴ稍混匀后Ｃｍｉｎ５（：ｍｉｎ上。叫，３７，３０，６，１０，离也置于冰一（４－）第轮ＰＣＲ：Ｗ上述第Ｈ步产物为模板，ＷＧＣＳＧ５２和ＡＡＰ为引物进行ＰＣＲ’Ｃ预‘Ｃ°反应。反应体系同１．３．３（７）。反应条件为：９４变性４ｍｉｎ９４３０ｓ，５５Ｃ；变性°°退火３０ｓ，７２Ｃ延伸９０ｓ，３５个循环；７２Ｃ延伸７ｍｉｎ。一５￣（）Ｗ稀释ＯＯｆｇ后的第轮ＰＣＲ＾为模板，从３ＣＳＧ５３和ＡＵＡＰ为引物进行第二轮ｌ’一ＰＣＲ反应反应体系剛：３．３（７）。反应条＃同５ＲＡＣＥ第轮ＰＣＲ反应条件。将第二轮ＰＣＲ￣产物凝胶电泳后产物回收并纯化产物．，连接转化、筛选及测序方法同１．３．４Ｕ６。１．３．９ｃＤＮＡ全长序列的获得－ＷＦ和ＧＣＳ－ＷＲ将上述Ｈ段序列拼接，根据拼接结果设计全长引物ＧＣＳ。进行ＰＣＲ扩増检测序列的可靠性。反应体系如下；（１曲２〇１５．８ｎｌｘｌＯＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５山２＋Ｍｇ１．５叫ｄＮＴＰ（ｌＯｍＭ）２．０叫ＧＣＳ－ｉＭ）ＷＦ（ｌＯ１．０ｊ叫ＧＣＳ－ｉ）ＷＲ（ｌＯｆＭ１．０１１１ＴａＥ５Ｕ／０．２ｑ（ｎＬ）ｃＤＮＡ１．０叫Ｔｏｔａｌ２５．０ｉｌｆ１７ 荷花ＷｗＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证’’’’反应条件Ｃ预变性４ｍｉｎ９４Ｃ变性３０ｓ，５５Ｃ退火３０ｓ，７２Ｃ延伸２ｍｉｎ，３５；９４；个’循环；７２Ｃ延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物进行凝胶电泳，并产物回收。产物纯化、连接转化－１及筛选测序．３．４．３．６。，方法同１１．３．１０序列比对与进化树构建利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ查找序列开放阅读框。通过ＢＬＡＳＴ进行序列比对分析ｌｕｓｔａｌＸｌ．８３进行多重，选择与荷花ｙＧＣＳ同源的其他植物ｙＧＣＳ氨基酸序列用ＣＮｅ－比对，利用ＭＥＧＡ５．１软件ｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）算法构建系统进化树。然后利用在线软件对蛋白进行分析。ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ；／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）预测蛋白的ＴＭＨＭＭＳｅｖｅｒ２．０ｈｔｔ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃ的／ＴＭＨＭＭ／）分子量及等电点；（ｐ预；／／ｗｏｓｏｒｔｓｅ．ｃｂｒｃ．／）预测亚细胞定位测跨膜结构域；及ｗｏｌｆＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐｑ；巧ｊｐ－ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ，ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）分析蛋白的保守结构域。２结果与分析２．１ＲＮＡ提取质量与反转录效果检测°提取雛沒ＲＮＡ后ＲＮａｓｅＦｒｅｅＨｚＯ溶解。充分溶解后取ＩｉｌＲＮＡ，进行１／疏臟ｊ－１乂）电泳检测（图２。在图中可１＾１看到２８８、１８８条带，并且清晰明亮，说明财认质量较好。２８Ｓ和１８Ｓ含量比働为２：１ＲＮＡ无明显。，表明痛耽ＭｌＲＮＡｊ？行两步法合胞ＤＮＡ。吸取１＾ｌｌｃＤＮＡ为模板，科荷花肋动蛋白基因为内参基因进行？（及内参检测，ｃＤＮＡ合ｂ２－化）。ＰＣＲ扩増结果获得２００ｐ左右的片段（图，条带明嘉带型稳定戯量，与？一删大小致。说明合成的ｃＤＮＡＭ量可靠，可用作下游实验ＭＭａｓ■２５０ｂＢｐ＾＾＾｜ＡＢ－图２１ＲＮＡ质量检測Ａ：总ＲＮＡ；Ｂ：内参基因Ｗ化４Ｃ７ＷＰＣＲ扩増；Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，２０００Ｆ－ｉｇ．２１ｕａｎｔｉｔｙｏｆｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｏｔａｌＲＮＡＱＡＫｆｉｔｉｏｎ：ＴｏｔａｌＲＮＡＢ：ＡｍｃａｏｆｇｅｎｅＭ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００；ｐ；，１８ 第二章荷花ｉＶｗＧＣＳ基因克隆及序列分析ｙ２．２目的中间片段序列测定通过在ＮＣＢＩ上搜索其他植物谷氨酷半脱氨酸合成酶基因的保守氨基酸序列，在线设计上下游兼并引物。合成的ｃＤＮＡ为模板，进斤ＰＣＲ扩增反应。得到６００ｂｐ左右－２－目的片段（图２Ａ）。经过切胶回收，连接ＰＭＤ１９Ｔ，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态，挑取阳性单克隆，用ＬＢ液体培养基振荡培养１ｈ后，用特异引物进行ＰＣＲ检测。挑取电泳检测呈现阳性条带的菌液送上海思普金公司测序。测序结果发现获得的该片段与龙眼公切访立基因有９２％的同源化初步确定该片段为荷沿ＶｎｙＧＧＳ基因片段。２－．３ＲＡＣＥＰＧ民结果’’’ＲＡＣＥ根据获得的中间片段序列，设计了３ＲＡＣＥ和５特异引物。通过两轮３ＲＡＣＥ’’’ＲＡＣＥＰＣ民反应３５８ｂ２－２ＢＣ）和３轮５，分别获得片段巧６ｂｐ和片段６６ｐ（图，。通过’ｉＶＳ基因的３产物纯化回收，连接转化及测序等步骤，可Ｗ确定得到的片段是荷花ｗＧＧ’端和５端序列。７５０ｂｐｈｊＢＩ７５０ｂｐ＾＾＾ＷＡＢＣ图２－２荷花ＷｎＧＣＳ基因克隆ｙ’片段’Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，２０００，Ａ：中间片段，Ｂ：３，Ｃ：５片段－ｅｕｍｂｏＦｉ．２２ＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｏｆＮｎｙＧＣＳｉｎＮｌｎｕｃｉｅｒａｇｇｆ，，Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００Ａ：ＣｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｕｅｎｃｅｓＢ：３ＲＡＣＥＣ：５ＲＡＣＥ，，ｑ，，２．４荷花ｉＶｗＧＣＳ基因全长序列的获得’’将获得的中间片段与３片段，５片段拼接得到全长序列１７８３ｂｐ，ＯＲＦ１５６９ｂｐ，编’’码５２２个氨基酸。序列分析表明，该序列包含３非编码区１９４ｂｐ，包括化ｌｙＡ１８ｂｐ，５１９ ■基因克隆荷花、表达及功能验证ＪＶｗＧＣＳ非编码区３８ｂｐ。ｙＧＣＳ蛋白预测相对分子量５９１５９．０，等电点６．２７，稳定指数３９．６０，表明该蛋白较稳定－ＷＦ和。根据开放阅读框（ＯＲＦ）两端设计全长序列的引物ＧＣＳ－序获得全长ＧＣＳＷＲ，进行ＰＣＲ反应扩增全长序列，经现Ｉ１７８３ｂｐ，命名为ｉＶｗＧＧＳ。Ｍ１２３４２０００ｂｐ一。？圍２－３图ＴＶｎｙＧＣＳ全长扩增ａｒｋｅｒ０００－：Ｍ：ＤＮＡＭ，２；１４目的片段－Ｔｎｎｇ．２３ｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｙＧＣＳＭＤＮＡ－ｍｅｎＭ：ａｒｋｅｒ２０００１４：Ｔｈｅｏｂｅｃｔｆｒａｔ，；ｊｇ２．５氯基酸序列同源性比对蛋白质序列分析表明，该基因的推测蛋白具有５２２个氨基酸，与已克隆的巴西橡胶树、黄瓜和拟南芥的氨基酸数目相化大于百脉根中４９４个氨基酸。ＮｎｙＧＣＳ蛋白预测相对分子量巧１５９．０，等电点６．２７，稳定指数３９．６０，表明该蛋白较稳定。对该蛋白进行跨膜结构域分析发现其不具有跨膜结构域。利用ＤＮＡＭＡＮ软件进行多重比对，ｉＶｗＧＧＳ基因所编码的氨基酸序列与百脉根＇王ｏｆｗ〇ｍｃａｖ４化ｃｅａ，Ｄ诚／ｏｎｗｎ，己ｖｅ幻句，洋葱（ｆ）龙眼（ｇ）西橡胶树（無（＿／Ｗ’？■４地访ａ化６ｍｓ７＂ｅｎ加Ｃｍｃｗｗｗ５口柿＂ｙｒａ６！成２口句的ＧＣＳ氨基酸），黄瓜（句和拟南芥（取ｙ序列一８：８７％８５％１％８０％７８％和７６％。该基因在进化过程中Ｃ端保守致性分别为，，，，性较髙，Ｎ端前１００个氨基酸差异性较大。可见该基因在不同物种中体现种源差异性。２０ 第二章荷花柳７ＣＳ基因克隆及序列分析．Ｂ？＾ＳＹＣＶＰｔｆｉＫＣＦＲｔＬＣｔｌＳＴＰｌＬｌＣｌｎ＃＾．．．ＴＥＵＫＴＳＰＦＧＶＴＨＲＩＥＡＳＫ．．．ＧＶＰＲＥＣＱ７３＾Ｃ＾＾Ｈｇｇ＾｜ｆｌ百ＳＳＭＨＨＨ趾ｐｉｓＳＦＶＡＡＳ．ＧＳＳ？Ｆｇｌ４７取巧响姑｜虹南养？？＾Ｉ；＾ＳＹＴＶＶＰＳＧＶＣＳＫＴＧＴＶＳＧＧＶＲＮＬＤＶＩ脚ＡＦＧＳ倒ｓＭＬＬＨＳＶ．ｆｌＱＩｆｌ７４｜＾｜＾＾｜齒皆眷裙｜＾｜＾．痒葱．ＱＳＲＣＷＱＬＥＲ．ＫＧＦＷＬＳ．．ＦＬＮＦＥＫＮＡＫＮＩＳｅＥ４８＾＾龙賦．．？．ＳＥＩＴＰＧ．…ｉｇＧＳ６３ｌ＇ｇ？？ＩＡＨＲＩＧＡＥＴＬＲＣＲＧＧＮｂ＆ＦＮＥＳ．．ＴＨＡＥ５ＬＫ＾ＬＬｓＮＩＭＨＧＬＨ黄／ｔ．■｜！ｔ＾ｆ＾＾Ｓｓ｜Ｓ３ＩＤＳＡＫＭＡＳＥ？ｖｆｌ７７＾＾申｜｜韦｜莲．ｔｊＭｐａＣｐｙＰＳＳＹＩＲＳＥＨＮＶＡＧＮＭＥＤＲＩＶＳＲＧＫＡＹＫＭ垃Ｗ吨由志．．ＫＶＰＲＩＳＨＬＤＧＩ昏国７４Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｍｓｖｉ９ｉｉ篮巧４ＣｏｎｓｅｎｓｕｓａｓｔｅｌｔｄｌｌａｓｃｋｒｉｔｅｈｅｋｆｆＩｉｌｌｎａｅｒｆｖｋｍｅｐｐｐｙｇｇｇｐｙｑ巧．宫Ｐ洁１＾．２巧莲．２３４ＣｏｎｓｅｎｓｕｓｉｇｌｑｇｋｑｓｉｓｌｅｐｇｇｑｆｅｌｓｇａｐｌｅｔｌｈｑｔｃａｅｖｎｓｈｌｙｑｖｋａｖａｅｅｇｉｇｆｌｇｇｆｑｐｋｗｄｉｐｍｋｒｉｍｐｇｙＥ？＾ＫＷ－３１３．．［２百Ｓ＾．巧唾强国｜＾巧拟￣＾．３。洋葱．．－２８６ＦＷＶｆｌＢ＾ｆｅ０１．ＢＷｆｅｉＢＢＭＷＨＷＷＥＭＷＢＭＢＭＢＩ＾＾ＷＭ．．Ｂｓｉｍ３０１：ｅｍｅ觀．ｊＷＢｓｉＢＢＲ—ＢｌＨｉ—３巧ＣｏｎｓｅｎｓｕｓｙｍｐｋｖｇｇｌｄｍｍｒｔｃｔｖｑｖｎｌｄｆｓｅｄｒｋｔａｇＩｑｐｉａｔａｆａｎｓｐｆｇｋｐｎｇｓｔｄｒ．巧］己西橡胶树＂ｉＩｉ１｜｜ＨＨＩｌＩ｜ｌｉｌＨｉｌｌｌＩＩＰＷ，ＩＨＩＩＩＩＩｉｙｉＨＩｌｌＭＩＩＩＭＩＨｌ｜｜１Ｗ１｜｜ＩＩ｜川川ＩＩＩＩＩ１Ｈ，ＩＨＩ百瞒ｇ．３６５洋葱．ｓｅｅ１＾．巧５Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｇｍｌｐｆｖｆｄｓｆｇｆｅｙｖａｌｄｖｐｍｙｆｙｒｙｉｄｃｇｆｒｆｇｋｌｐｇｅｌｐｄｗｅｎｈｌｔｔｉｆｐｅｖｒ１ｋｒｙｌ己树．４７３百脉根．＾Ｋ＾ＢＳＳＳ＾Ｓ＾＾＾ＭｉＭｋｎ＞Ｊ４化｜Ｕ热ｔｆＨＨｉｌ＂２洋葱．？４４６｜ｇ｜ｌｉ化ｈ＾ＫＡＢ＾Ｒ＾＾＾＾＾ｗＳＨ４ｃ聲ＳＨ＂５莲．担＂２ＣｏｎｓｅｎｓｕｓｅｍｒｇｄｇｇｐｗｒｒｌｃａｌｐａｆｗｖｇｌｌｙｄＩｑａｄｗｔｅｍｌｒｋｖｇＤｃｔｐｆｒｄｇｌｈｖａ过ａｇ己西橡胶棘５２２ｃ＾ＷＪＨｔｇ．４９４ｔｍ＾．＾５２１痒意－４９５ｒ．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｌｅｒｇｋｅｇｆｌｖｅｖｔｇｖｔｐｅｌｉｅｗｖｄｆｅｌｙｇ图２￣４不同植巧ＧＣＳ基因推測的氨基巧序列的多重巧列比对分析ｙＦ２－４Ｍｕｉｇ．ｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｒｅｄｉｃｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｅｎｃｅｓｏｆＧＣＳｅｎｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌａｎｔｓｐｑｕｙｇｐ２１ 荷花ＷｗＧｃｙ基因克隆、表达及功能验证２ＴｗＧＣＳ基因氨基酸序列系统进化树构建．６荷花Ａｙ觀ＶｗｙＧＣＳ基因序列所推测的氨基酸序列在ＮＣ助网站上进行ＢＬＡＳＴＴｐ，找到许多同源的ｙＧＣＳ蛋白，选取１５个ｙＧＣＳ序列与ＮｎｙＧＣＳ序列进行多重序列比化利用ＭＥＧＡ－５．１软件ＮｅｉｈｂｏｒｏｉｎｉｎＮＪ算法构建系统进化树。ｊｇ（）系统进化树分析结果表明；不同植物的ｙＧＣＳ蛋白被分为两个亚类，荷花ＮｎｙＧＣＳ属于双子叶植物亚类，与双子叶植物龙眼，百脉根等亲缘关系较近。与水稲、小麦等单子叶植物亲缘关系较远。ＬＧＣＳ巧ｊｙＩＩ７８ＰｖＧＣＳ＿ｙ＇ＰｓＧＣＳｙＣｂＧＣＳ１７ｙｊＡＧＣＳ１００ｔｙＤｌｙＧＣＳＩ—＊ＰｃＧＣＳａＴｙ￣ＣｓＧＣＳｙ＾ＨｂＧＣＳｙ＾ＺｅＧＣ２９ｙＳＩＮｎＧＣＳｙＡｃｙＧＣＳＩＴａｙＧＣＳＩＯｓＧＣＳｙＩＷＺｍＧＣＳｙ＾＇Ｐ乃ａｙＧＣＳ—１１１１！０．０２０．０００．０８０．０６０．０４图２－５植巧ＧＣＳ系统进化分析ｙ－．２５ＰｈｌｌｔＧＣＳ巧ｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｓｅｓｏｆａｎ６ｙｇｙｐｙ？Ｉ（Ｓ：６化１０ＡｔＧＣＳ：巧南芥ＣＡＡ７１０７５；ＣｓＧＣＳ：黄瓜（ＡＤＫ７７说２）；ＤｌＧＣＳ：龙ＳＡＦＦ１８８４４）；（Ａ巧ＧＣ洋巧（ＡＡＬ）；ｒ（）ｒＹＨｂＧＣＳ：百化报（ＡＡ０４５８２１ＯｓＧＣＳ：水稻ＣＡＤ４８５典ＰｃＧＣＳ：劳：己西橡胶巧（ＡＤＥ０６２２６）ＬＧＣＳ；（）；ｙ；ｉｒ）ｙｙ（０２６９９）ＰｖＧＣＳ：３７ＺｅＧＣＳ：百日巧田ＡＤ２７３９０ＺｍＧＣＳ：玉ＡＨＣ：巧豆ＡＡＦ２２１３６ＰｓＧＣＳＦ２２１；）；；ｙ（）；ｒ巧豆（ＡＡ）ｙｙ米（ＣＡＣ拍００化ａＧＣＳ：小麦（ＡＡＷ５８１４７）．Ｔｒ２２ 第二章荷花ＭｉＧＣＳ基因克産及序巧分析ｙ３讨论‘’Ｔ／本实验首次从耐深水荷花品种台城拂翠中克隆得到荷花ｉＳｉｙＧＣＳ基因。将该基因与己知的同源基因比较发现’，该基因在５端序列的保守性较差，而Ｃ端具有较商保守性。对ｙＧＣＳ＾基酸序列进行分析发现不同植物中编码该基因氨基酸巧目不尽相同，荷花Ｗ／ｉｙＧＧＳ基因预測编码纪２个氨基度残基，与已克隆的己西橡胶树，黄瓜Ｗ及拟南芥中気基酸数目相近，且同源性较高。而小麦中ｙＧＣＳ仅２７４个気基酸。不同植物中ｙＧＣＳ基因都有一个共同的结构域，属于ＧＣＳ２家族。因在系统进化过程主要分为两个亚组：双子叶植物亚组和单子叶植物亚一组。荷花Ａ／ｈＧＣＳ基因属于双，与龙眼ｙ子叶植物亚组，音脉根，Ｅ西橡胶树等组，与龙眼，百脉根亲缘关系较近，而与单子叶植物水稻，玉米，小麦等进化关系较远。荷花因的克隆一，为下步研究该基因的调控表达及其在植物耐重金属过程中的具体作用机理奠定了基础。２３ 第Ｈ章Ｗ巧ＧＣ？基因表达与及亚细施定位第王章ｉＶｎｙＧＣＳ基因表达与亚细胞定位第一节福胁迫后ＭＧＧＳ在荷花中表达分析ｉｙ摘要：利用２００＾１＾１和４００曲１的锅分别处理盆栽荷花，于处理后１１１，３ｈ，６ｈ，１２ｈ，２４Ａ＾ｈ，用获光Ｓ基因在锅胁迫后的表达情况处理后取样定量方法分析荷花ｗＧＣ。并在１山３ｄ，５ｄ，９ｄ时取样荷花叶片，叶柄，根茎，根须。用于测定荷花各器官锅积累情况。结果显示：在锅胁迫后，荷花ＭｚｙＧＣ媒因在叶片和根部都有不同程度的响应。不同浓度锅处理后，ｉＶｗｙＧＣＳ在叶片表达变化趁势相同，且高浓度锅处理下基因表达■一强度更大。在根部的ＧＧＳ表达变化趋势不致。荷花各器官中根须中积累重金属ＴＷｉｙ最多，根茎积累重金属最少。重金属积累量从高到低依次为根须＞叶片＞叶柄＞根茎。尽管在不同浓度锅处理条件下一致锅积累量却，荷花各组织锅积累量变化趋势，但是差异显著。关键词：茨光定量分析；锅胁迫福对于植物来说是一种非必需元素，高浓度下箱会对植物产生毒性。植物在进化过程中逐渐形成应对重金属的适应机制，即通过合成金属结合蛋白响应領胁迫从而降低重金属毒害（熊愈辉和杨肖娥，２００６）。研究表明重金属，高温，低温等胁迫能诱一导ｙＧＣＳ基因上调表达（Ｗｕｅｔａｌ．２００９）。基因响应胁迫表达能够从方面反映该基，因的功能，，重金属诱导下ｙＧＣＳ酶活増强其中研究较多的是锅胁迫下该基因的表达ｏｔａ。变化（Ｈｌｇｅｒｅｌ．１９９８Ｓｅｍａｎｅｅｔａｌ．，２００７），；本实验在从荷花‘台城拂翠’中克隆出因的基础上利用巧光定量技术研，究该基因在荷花正常生长情况下Ｗ及铜胁迫处理后的表达情况，并测定锅胁迫下荷花各器官积累重金属的情况。为解释ｉＶｗＧＣＳ基因在荷花重金属解毒过程中所起的重要作用提供理论依据。１材料与方法１．１植物材料２５ 荷花ＭｉＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ‘’一植物材料为荷花品种台城拂翠，引自江苏南京艺莲苑有限公司。选取生长致且健康的荷花幼苗，用２００ｐＭ和４００ｐＭ氯化锡处理荷花，分不同时间点（Ｏｈ，Ｉｈ，３ｈ，６ｈ，１２ｈ，２４ｈ）取荷花叶片和根部。在链处理后Ｉｄ，３ｄ，５ｄ，９ｄ取样荷花各器官（叶片，叶柄，根茎，根须）用于测定销积累量。１．２试剂与仪器１．２．１试剂ＲＮＡ提取试剂念（ＴＲＩＺＯＬ）－，ｃＤＮＡ合成试剂盒（ＭＭＬＶＲＴａｓｅｃＤＮＡ巧），巧光定量ＰＣＲ试剂盒ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ购自ＴａＫａＲａ，浓硝酸等。１．２．２实验仪器ＩＣＰ离子检測系统，其余同第二章１．２．２。１．３实验方法１．３．１荷花ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成一（１）ＲＮＡＭ取方法见附录。（２）ｃＤＮＡ合成方法同第二章１．３．３。ｌ－Ｔ１．３．２ＲｅａｉｍｅＰＣＲ分祈荷饱因巧光定量的引物有上海捷瑞公司合成，内参基因则选用荷花肌化－动蛋白基邸（登录号：ＥＵ１３１１５３），引物序列见表３１；３－表１荷花ｙＧＣＳ基因表达分析所用引巧序列Ｔａｂ－ｌｅ．３１ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧＣＳｙ，’引鉤Ｐｒｉｍｅｒ序列Ｓｅｑｕｅｎ－３ｃｅ口）ＮｎＡｃ－ｔｉｎＦＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＡＴＮｎＡｃ－ｔｉｎＲＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＩＡＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＳ－ＲＴＦＧＣＴＴＡＴＩＴＣＣＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣＧＣＳ－ＲＴＲＴＣＴＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＩＡＡＣＡＡＧ将合成的ｃＤＮＡ稀释３０倍，按照巧光定量试剂盒说明书建立２０Ｈｉ反应体系：ＳＹＢＲ１０．０１＾２６ ＝第章ＷｗｙＧＣＳ基因表达与及亚细胞定位ｃＤＮＡ５．０１片上游引物１．０叫ｌ下游引物１．０ｉ＾ｄｄＨ２〇３．０Ｔｏｔａｌ２０．０ｉｌ｜‘‘’，焚光定量ＰＣＲ反应程序；９５Ｃ２ｍｉｎ；９５Ｃ１５ｓ，６０Ｃ３０ｓ，７２Ｃ２５ｓ，４０个循环３。ＡＡＣ姑进。每个样品重复次，分析每个样品的ａ值使用行计算，目标基因的相＿么么口＝对表达量２（ＸｉｖａｋａｎｄＳｃｈｍｉｔｇｅｎ２００１）。＾１．３．３荷花各器官福含量的测定用２００＾ｌＭ和４００ｐＭＣｄｃｌ２处理荷花后，在０（１，Ｉｄ，３ｄ，５ｄ，９诚滿花的叶片叶’Ｃ杀’Ｃ烘柄，根茎，根须部位，经蒸馈水冲洗干净后，在烘箱内１０５青３０ｍｉｎ，再８０干－。２３天。称重后用ＨＮ０３消煮，利用原子吸收分光光度计测定領含量。每个样品重复３次２结果与分析２．１荷花ｉＶｗＧＣＳ基因组织定量分析）、取样正常生长的荷花叶片（成熟叶，嫩叶，剑叶叶柄、茎、根须各器官保存ｃＤＮＡ定量分析－。由图３１于液氮中，随后提取荷花ＲＮＡ，反转录合成，进行巧光可Ｗ看出基因在荷花各个器官均有表达，无组织特异性，但是不同器官的表达量有差异。在荷花各个器官中，该基因在嫩叶中表法量最髙，茎中表达量最低。各器官＞＞＞＞＞一组织的不同发育时表达量从高到低依次为嫩叶叶柄成熟叶根须剑叶茎。在同期，，嫩叶中Ｍｉ信ＣＳ表达量高达成熟叶的３倍。剑叶的近９倍。基因表达量也不相同）１．００ｒＴｇ０．８０圓．■轴夏．迸旨０．６０■Ｔ０．４０■圓＇Ｉ－？ＩＬ＾ｍｍ塞巧肿衡■叶巧巧巧Ｈ３－组织中表达模式图１方巧＜沿５在荷巧不同－ｎｒｅｓｓｎＦｔｉｉｇ．３１ＮｙＧＣＳｅｘｐｉｏａｔｔｅｒｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｓｕｅｓｐ２７ 荷花ＷｆｉｙＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证２．２福胁迫下荷花叶和根部ｉＶｗＧＣＳ表达响应－由图３２可Ｗ看出在領胁迫后，匈ＧＣ巧荷花叶片和根部的表达均有响应。不同的是在不同部位该基因的响应水平和响应时间不同。在叶片中表现为表达量先下降再一Ｍ，在根部的表达量变化则为在某时间点骤升链处理时，升高的趋势，比如在２００＾＾。胁迫后１ｈ时该基因表达量剧増，而在其他时间点的表达量则保持相对稳定状态在４００＾Ｍ福处理的根部也表现出相似的现象。虽然在叶片部化＾巧信０￥基因的表达表达水平，该基因的响应水平也有所不同。从图变化趋势相同，但是不同浓度的锡胁迫情况下中可＾明显看出４００？＾＾領处理情况下该基因的表达水平明显高于２００＾１＼１領处理条件下的表达水平。可见高浓度的領胁迫能增强该基因的表达水平。在根部也有类似的现象，０图１２１１和（：图１１１均为基因响应时间点，但是４００＾１１＾１锅胁迫下如巧；併３表达强度明显高于２００山ＶＩ时的表法水平，前者约为后者的１．２倍。饼原压不同器官的不同模式的胁迫响应可能与其不同组织的功能相关，荷花不同组织对重金属的积累程度也可能与该基因的表达情况相关。为了解斯叩併进基因在荷花积累重金属方面的贡献，本研一究进步对領处理后荷花各器官组织的重金属积累量进行测定。２．３福胁迫下荷花组织重金属积累量为研究荷花积累重金属的特性ＶＷＰ４００１＼？：（１（：１２处理荷花后，于１ｄ，３ｄ，，用２００ｎ］［５ｄ，９ｄ取样荷花叶片，叶柄，根茎，根须等组织测定重金属含量。测定结果显示：荷花各器官中根须中积累重金属最多，根茎积累重金属最少，根须中領积累量高达１４００ｌ／干重，根茎中領含量则低至８０ｌ／Ｆ重。重金属积累量从高到低依次为根须＞＾ｇｇ＾ｇ护一＞＞３－３可定的规律叶片；叶柄根茎。从图Ｗ看出锡胁迫后荷花各器官領积累量变化有叶片中福积累量逐渐升高，根茎中，而叶柄中锡积累量逐渐减少锡变化趋势为先升髙。后降低，根须中锅含量变化也是先升高后降低尽管在不同浓度箱处理条件下，荷花一各组织領积累量变化趋势致，但是福积累量却差异显著。２００ｍＭ锅处理下叶片中福１处理时，高达十几倍。在叶柄中３ｄ；ｔ２００ｉＭ积累量明显高于４００＾１＾前４００ｐＭ处理比＾处理高达２倍］＾１，而５（１后则降低的比２００＾ｌＭ处理降低得多。４００＾处理时根茎中領含＾１領处理条件下，根须中箱积累同根茎相同，离浓度锅胁迫下反而积累量均低于２００１＾領较少。２８ 第Ｈ章ｉＶｎＧＧＳ基因表达与及亚细胞定位ｙＡＢ〇０．４０．５ｒ．１ｌｉｕｉｉｉｌｉｉｌｉｉｉｌｉＯｈ化化６ｈ１２ｈ２４ｈＯｈ化化化１２ｈ２４ｈ１０〇－ｆＯ１．０ｒ０－８？巧！１？Ｓ０．８ｉ。．６－〇－６斷ｉ｜ＩＩｌ｜Ｉ霞ｌａＩｌ，．ｌ＾—Ｆｏｉｌ一‘Ｉ〇Ｏｈ化３ｈ６ｈ１２ｈ２４ｈＯｈ化３ｈ６ｈ１２ｈ２４ｈＣＤ３－２图ｉＶｈｙＧＣＳ在锅处理下表达模式分析Ａ：叶片２００＾ＭＣｄ处理；化叶片４００｜４］＾０（１处理；Ｃ：根２００＾ｌＭＣｄ处理；０：根４００叫＾０（１处理；■巧３－２昏ｉＶ只ＧＧＳｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｔｅｒｎｓｕｎｄｅｒＣｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｙｐｐＡＬ２００ＭＣｄｔｒｅｔｍｔＢ：Ｌｅａｖｅｓ４００ｉＭＣｄｔｒｅａｔｍｅｎｔＣ：Ｒｏｏｔ２００ｊＭＣｄｔｒｅａｔｍｅｎｔＤ：：ｅａｖｅｓｊａｅｎ；；；ｆ｜｜Ｒｏｏｔ４００ｉＭＣｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．｜１０００ｉｌ８００■０ＸＯｉｕｎｏｌ２０ｔｍｏｌ。｜「。！ＩＩＩＬＬＯｄＩｄ３ｄ５ｄ９ｄＯｄＩｄ３ｄ５ｄ９ｄ〇ＡＢ。．［ｌｉｌｆＩｔ＼ＺＭＩｆｔ址？，ＯｄＩｄ３ｄ５ｄ９ｄ〇ｄＩｄ３ｄ５ｄ９ｄ＾＾图３－３荷花各纽织領巧累量Ａ：叶片Ｂ：叶柄Ｃ；根茎Ｄ：根须Ｆ－ｍｎｎｎｕｍｂｏｕｉｇ．３３ｔｉｔｌｅＣａｄｉｕｍｃｏｔｅｔｉＮｅｌＮｃｉｆｅｒａｏｒｇａｎｓＡＬｓＢＰＣ：ＲｉｚｏｍｅＤ：Ｒｔ：ｅａｖｅ：ｅｔｉｏｌｅｈｏｏ，，，２９ 荷花ＶｎｙＧＧＳ基因、表达及功能验证ｉ克隆３讨论在荷花各器官中，均能检测到ｙＧＣＳ基因的表达。泛与之前在己西橡胶树各器官中一均有该基因的表达结果致（邓治等，２０１２）。表明ｙＧＧＳ基因属于姐成型基因，在植物生长发育各个阶段均发挥重要作用。不同的是，在不同阶段的组织中，基因表达量不同。在己西橡胶树中健康植株中比枯死植株中该基因表达量商，而在荷花叶片中，嫩叶中该基因表达量高于成熟叶和剑叶。这表明ｙＧＧＳ基因在植物生长旺盛阶段发挥较大作用。另外，在荷花绿色组织中（叶片，叶柄）该基因表达量相对于非绿色组织（根茎）。这可能与该基因在细胞内的分布有关。，根须则较离領胁迫下，荷花叶片和根部ＧＣＳ基因表达均有响应。在叶片中，该基因表达量先ｙ下降后上升。随着处理铜浓度的升高，基因表达量整体有升高趋势。基因表达量的变化趋势体现其功能的发挥。基因表达量先下降可能是合成ＧＳＨ耗用，随后又上升可能受到ＧＳＨ反馈抑制调节。ＧＳＨ应激调节在植物遭受非生物胁迫时发挥重要作用（郭静成和尹顺平，１９％）。在根部，ｉＶｗＧＧＳ表达量变化则为瞬时升高。不同浓度处理，基因响应时间不同一致的是，高浓度矯胁迫下，反而响应延后。但是，与叶片中情况高浓度下基因表达量普遍升高。从荷花各器官領积累情况来看，叶片和根须中积累较多，叶柄和根茎中则较少。一８这与箱在花挪菜中积累特点致（汤惠华等，２００）。随着觸胁迫时间的延长，叶片中領积累量逐渐升高，叶柄中趋势则是逐渐下降，根茎中先上升后下降再上升，根须中先上升后下降。据此猜测荷花中矯积累路径可能为最先接触根须，在根须积累量很快上升，然后从根须向根茎转移进而经过叶柄最后转移到叶片中。領积累量和ＮｎｒＧＣＳ一。基因在各器官表达量有定联系在根茎中表达量最低，領积累量也最低。叶柄中基因表达量虽然高于根须。，但領积累量却低于根须根际环境的特殊性Ｗ及根系微生态的作用可能是根系积累大量重金属的原因（孙琴等，２００５）。实验表明荷花积累領的器官是根须和叶片一。荷花作为重要的水体观赏植物，具有积累重金属的特性，这特点提高了荷花的利用价值，在美化环境的同时积累水体重金属，减少水体污染，是植物修复技术的具体体现。３０ 第Ｈ章俯ｙＧＣＳ基因表达与及亚细胞定位第二节ＴＶｗｙＧＧＳ基因亚细胞定位摘要：构建绿色茨光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）融合表达载体－ＧＧＳｐＭＤＣ４３Ｍ７７，利用基因枪轰击法将其导入洋葱表皮内表达，在激光共聚焦显微镜下观察到该基因定位于细胞质中。关键词：载体构免亚细胞定位基因功能研究已成为目前生物学研究的热点，而蛋白质的亚细胞定位研究可Ｗ帮助全面地理解植物形态建成、生长发育化及对逆境的耐受性和抵抗性，从而研究蛋白质如何正确行使其功能（左青等，２０１１）。目前亚细胞定位的研究方法较多，应用较多的主要有基于报告基因表达产物的特性来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法、免疫组织定位法等（邢浩然等，２００６）。其中绿色巧光标记（ＧＦＰ）应用最为广泛於山（１６１１化３１幻３１．１９９６。近年来绿色英光蛋白被应用于活体定位观察、蛋白质定位，）４ＦＰ等研究（Ｃｈａｌｆｉｅｅｔａｌ．，１９９）。当Ｇ在真核细胞或原核细胞中表达时，如受到蓝光或一紫外光的激发，会产生种明亮的绿色巧光，该基因与目的基因连接不会影响目的基因的表达ＦＰ一，而且能与目的基因形成融合表达。Ｇ作为种新的报告系统，在基因表达和蛋白质定位的研究中得到了广泛的应用，该方法己成功地应用于大量的植物研究（Ｐａｎｇｅｔａｌ．，１９９６）。关于ｙＧＣＳ基因的细胞定位，有报道称该基因定位于细胞质及叶绿体中（ＨｅｌｌａｎｄＢ一ｅｒｇｉｎａｎｎ，１９９０；Ｊｏｓｅｅｔａｌ．，２００４）。通过在线预测软件分析结果与之前报道致。为－了解荷花ｉＶｗＧＧＳ的基因定位情况，本研究通过构建表达载体ｐＭＤＣ４３ＮｎＹＧＣＳ，利用基因枪轰击的方法，，将重组质粒导入洋葱表皮细胞暗培养后在巧光显微镜下观察基因表达及定位情况。１材料与方法１．１实验材料盆栽荷花，新鲜洋葱。３１ 荷花ＷｗＧＧ？基因克隆、表达及功能验证１２试剂与仪器．１．２．１试剂及菌株酒精，亚精胺，氯化钩，金粉等，１／２ＭＳ固体培养基，山梨醇，其他试剂同第二章．２．１。１１．２．２仪器设备同第二章１．２．２。１．２．３菌株与载体ＭＤ１９－Ｔ购自大连宝生物公司克隆载体Ｐ，大肪杆菌ＤＨ５ａ购自天根公司。引物合成和测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。没巧和等核酸内切巧采购于Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＥＮＴＲｌＡ入口载体和植物表达载体ＭＤＣ４３为本实验室保存。ｐｐ１．３实验方法１．３．１正义表达载体构建根据ｐＥＮＴＲｌＡ表达载体上的多克隆位点，选择ｉＶｈｙＧＣＳ序列中不含有的两个限／）ＧＣＳ－＆饥和ＧＣＳ－Ｍ制性内切酶（及ｚＷ和ｉＶｉｒｆ醇切位点＞ｒｔ。Ｗ荷，设计上下游引物’－ｃＤＮＡＰＣＲ反应。反应程序为Ｃ３０Ｓ；％Ｃ１０Ｓ，ＷＣ３０Ｓ，７２Ｃ花为模板进行；９８＂Ｃ°２ｍｉｎ，３５个循而７２ＩＯｍｉｎ；４Ｃ终止。反应体系如下；丸狙２〇１１．８５ｘＰｈｕｓｉｏｎ册Ｂｕｆｅｒ４．０１片ＤＭＳＯ０．６ｎｌｄＮＴＰ（ｌＯｍＭ）０．４ｉｌｆＧＣＳ－ａｌＭ）１Ｓｌ（１０．０１ｎ片ＧＣＳ－Ｎｏｔｌ（１０Ｍ）１０ｌｎ．ｎＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡ聚合酶０．２１片ｃＤＮＡ１．０Ｔｏｔａｌ２０．０ｉｌ＾二５－１回收反应产物，后续实验操作同第章１．３．．３．６。测序验证后，分别提取－Ｔ－ｐＭＤ１９ｉＶ＞２７ＧＣＳ和ｐＥＮＴＲｌＡ的质粒（详细步骤见附录五）。将得到的两种质粒进行３２ 第Ｈ章ＷｗＧＣＳ基因表达与及亚细胞定位Ｓ幻／Ｉ和酶切。分别加入ｌＯｘＦａｓｔＤｉ的ｔＢｕｆｆｅｒ２叫，质粒４叫，加／Ｉ和ＡＷ１各１冲ｇ°加ｄｄＨ２〇至总体积２０叫即完成酶切反应液配置。酶切程序为３７Ｃ，Ｉｈ。然后进行产物电泳检测，并回收酶切后的目的片段和ｐＥＮＴＲｌＡ载体。将上述纯化回收的目的基因片段与ｐＥＮＴＲｌＡ载体片段用Ｔ４连接酶连接，分别加入目的片段和ｐＥＮＴＲｌＡ载体片段各４叫，Ｔ４连接酶１叫，连接酶Ｂｕｆｆｅｒ２沁加ｄ姐２０漏合液在°至总体积２０叫，将ＰＣＲ仪１６Ｃ连接２ｈ后，将产物转化大肠杆菌感受态，涂’布在含卡那ＬＢ平板上３７Ｃ过夜培养筛选。挑取单克隆进行ＰＣＲ菌液检测，并测序。ＥＮＴＲ－测序正确后提取ｐｌＡＡ吟ＧＣＳ质粒，并用限制性内切酶Ｐｖｕｌ（ＮＥＢ，美国）ｘ充分酶切使之线性化。分别取质粒５叱Ｐｖｕｌｌ叫，１０Ｂｕｆｆｅｒ２叫，加ｄｄＨ２０至总体°°积２０叫。ＰＣＲ仪中设置３７Ｃ，２ｈ，７０Ｃ，１０ｍｉｎ程序。反应完成后将酶切产物进行电泳检测，回收线性化片段。提取ＰＭＤＣ４３的质粒，将含有ＮｎｙＧＣＳ基因的ｐＥＮＴＲｌＡ载体线性化产物和：ＤＮＡ２叫ＭＤＣ４３１叫Ｌ民酶１，ｐＭＤＣ４３质粒进行ＬＲ重组。重组体系线性，Ｐ，叫加°入巧’（１地２０至总体积５＾１１。浪匀后２５Ｃ，１ｈ，加０．５叫ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ，混匀，Ｃ，１５ｍｉｎ，°Ｃ７０，１０ｍｉｎ后将反应产物在冰上放置５ｍｉｎ即重组完成。重组质粒转化大肠巧菌，挑取阳性单菌落，利用目的基因特异引物和ＰＭＤＣ４３载体引物进行ＰＣＲ检测，并送测序。挑取阳性克隆提取质粒用酶Ｐａｃｌ和Ａｓｃｌ进行酶切验证。１．３．２洋葱表皮细胞瞬时表达洋葱处理：将购买回来的新鲜洋葱去除表面两层皮，将中间两层切成边长１ｃｍ的一方块，然后将内表皮侧贴合于含有山梨醇的１／２ＭＳ固体培养基上，培养１６ｈ。次日，将洋葱内表皮撕下来铺于１／２ＭＳ固体培养基上。ｃ－ｅａｒｔｃｅｅｖｅｒｓ质粒ＤＮＡ的金粉包埋及基因枪（ＢｉｏｌｉｓｔｉＰＤＳ１０００／ＨＰｉｌＤｌｉｙＳｙｔｅｍ）轰击操作步骤见附录五。１．３．３显微镜观察－ｎ将洋葱表皮置于载玻片上，癸光正置显微镜下观察ｐＭＤＣ４３ｉＶｙＧＧＳ融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达和定位情况。２结果与分析－将构建好的重组质粒ｐＭＤＣ４３７ＶｎＧＣＳ经基因枪轰击法导入洋葱表皮细胞，暗培ｙ３３ ＧＣ？荷花ＭｉＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ养１６ｈＷ上，用巧光正置显微镜观察绿色巧光蛋白表达情况。结果显示，在导入空载，绿色巧光分布在整个细胞中体ＰＭＤＣ４３的洋葱表皮细胞中，而在导入－３－３４）ｐＭＤＣ４ＮｎＹ〇ＣＳ的洋葱表皮细胞中，可看到细胞质中有绿色英光（见图。３－４Ｍ图ｓｙＧＧＳ在洋葱表皮细胞定位■ＭＤＣ４－３空载体定位ａ：可见化，ｂ：ＧＦＰ，：叠加４３７Ｖｐｃ；ｐＭＤＣｎｙＧＧＳ定位ｄ：可见光，ｅ：ＧＦＰ，ｆ：叠加。－Ｆｉｌ山ｚａｔｉｏｎｆ内ｔｅｉｇ．３４ＳｕｂｃｅｌａｒｌｏｃａｌｉｏＴＶｙＧＣＳｅｎｅｒｏｅｉｎｉｎｏｎｉｏｎｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｇｐｐＥｍｒｔＭ４３－ｏｖｅｃｔｏｒｉｉｂｌｌｉｈｔｂＧＦＰｅｒｅｄＭＤＣｉＶＧＣＳｄｉｉｂｌｌｉｈｔｂＧＦＰＭｒ．ａ：ｖｓｅｇ，：，ｃ：ｇ；ｎｙ：ｖｓｅ：，ｃ：ｅｅｄｐｙ，ｐｇｇ３讨论亚细施定位方法作为一种研究基因功能的辅助手段，能够提供最基础直观的信息Ｎｉｅｄｅｎｔｈａｌｅｔａｌ．１９９６。蛋白的功能与其在细胞中的定位密切相关，从而可Ｗ对基因（，）功能作出预测。在线预测ＭｊｙＧＧＳ定位于细胞质和叶绿体，本研究利用基因枪轰击Ｎ一ｉｒＧＣＳ基因定位于细胞。洋葱表皮法结果表明ｙ质，这与预测结果基本致用分离原生质体法研究表明丫ＧＣＳ基因定位于细胞质和叶绿体中（ＲｅｇｉｎａａｎｄＧｅｏｒｇｅ，１９９０）。基于洋葱表皮没有叶绿体细胞器，在洋葱表皮细胞内不能观察到叶绿体巧光情况，还需进一ＧＣＳ基因定位于细胞质中ＧＳＨ步借助其他方法研究。ｙ，在细胞质内发挥功能合成。一領胁迫下ＰＣＣｄ－ＰＣｓ复合物，ＧＳＨ含量升高进步合成，与領结合进而生成，在转运蛋白作用下转移到液泡中，从而减少重金属对植物细胞的伤害。３４ 第四章荷花ＶｗＧＣＳ基因的功能分析第四章荷花ＴＶｗｙＧＧＳ基因的功能分析－摘要；通过构建荷花ｉＶｗＧＣＳ正义表达载体ｐＭＤＣ４３ｉＶｗＧＣ＆然后通过农杆菌－－介导法转化野生型拟南齐，经过潮霉素抗性筛选，ＲＴＰＣＲ，ｑＲＴＰＣＲ筛选鉴定阳性。选用转入基因表达量高的株系（Ｔ３代）完成根长生长苗，种子发芽率，生理指标含量等功能验证实验。结果表明，在含锅培养基上，转基因株系根长明显大于野生型拟南齐，根系也较野生型发也种子发芽率稍高于野生型，植株受重金属伤害较野生型轻。关键词：转基因拟南界耐锅力；荷花再生体系方案尚不成熟，而通过转化拟南芥研究植物基因的功能已经有相关报道，并被广泛应用。Ｌｉｕ等（２０１２）从荷花中分离得到植物络合素合酶基因ＭｉｆＣＳｉ成功转入到拟南芥中，转基因植株在靖胁迫下，较野生型耐锅能力和积累領能力均増■强。柳忠玉等（２０１１）将虎杖白黎芦醇合酶基因ｆｃ化Ｓ转入拟南芥中，结果转基因拟南芥种皮颜色发生改变呈浅黄褐色，并且子叶中花青素含量显著减少，表明ｆｃｉ议基因导致转基因拟南芥黄丽类物种合成受阻。陈吉宝等（２０１０）将菜豆脯氨酸合成酶基。因转入拟南芥，结果改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性利用拟南芥转基因体系将外源基因导入贤生型拟南芥能有有效的进行目的基因功能验证实验，而且拟南芥生长周期短，基因组研究背景成熟，已是进行基因功能研究的模式桂物。基于成熟的拟南芥转基因转化体系和鉴定体系，本研究选用哥伦比亚型拟南芥为ＭＤＣ４－ＧＣＳ￡社４７０５：受体植物，构建植物正义表达载体ｐ３Ｍ７ｙ，通过农杆茵介导，将，ｉＷＴＧＣＳ基因对根系发育目的基因导入拟南芥初步分析了ｙ，种子耐福力，植株锡积一。累量等方面的功能，为进步探讨解析ｙＧＣＳ基因的功能提供理论基础１材料与方法１．１材料’沈’野生型拟南芥（如加１！ｐｓｂＡａ＆ａｗａ）；生态型Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ），在本实验室光照培３５ 荷花ＷｗｙＧＣＴ基因克隆、表达及功能验证养箱中培养生长。茵株和质粒：大肠杆菌（怎．ｃｏ／ｆ）菌株ＤＨ５ａ及农杆苗菌株ＥＨＡ１０５ａＫａＲａ。购自Ｔ，质粒ｐＭＤＣ４３由本实验室保存１．２实验方法１．２．１正义表达載体构建二方法同第Ｈ章第节１．３．１。１２２拟．．南芥的透传转化首先制备农杆菌感受态，根癌农杆菌感受态的制各见附录六。质粒转化农杆菌转化５ＭＤＣ４－ｉＶ：取Ｕ纯化的３ｎＧＣＳ质粒ＤＮＡ１０［ｐ７，加入山农＂杆茵感受态，小也混匀；冰浴３０ｍｉｎ，随后转入液氮冰冻５ｍｉｎ，水浴锅中３７Ｃ水浴５ｍｉｎ。再冰浴５ｍｉｎ，加入７５０ｎｌＹＥＢ液体培养基，２５０ｒｐｍ振荡培养５ｈ。菌液５０００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ，倒掉部分菌液上清，剰余１００ｊｉｌ左右菌液涂布在ＹＥＢ固体培养基（含’Ｃ培‘Ｋａｎ和Ｒｉｆ抗生素）上。２８养２ｄ，挑取单克隆，在ＹＥＢ液体培养基中２８Ｃ振’５－荡培养ｈ，然后进行ＰＣＲ菌液检测。检测正确的菌液加入３０％甘油，混匀后置于７０Ｃ超低温冰箱保存备用。１．２．３拟南芥播种（ｔ－１）将拟南芥种子置于１．５ｍｌ离也管中，加１ｍｌ７５％酒精和０．１％ＴｒｉｏｎＸ１００振荡１５ｍｉｎ。（２）倒掉离也管中的酒精，在超净工作台中用无水酒精洗种子２次。（３）直接把种子连同酒精倒在事先灭过菌的滤纸上，滤纸铺在超净工作台上待吹干种子。一（４）将滤纸对折，左手捏着角，右手用摄子轻轻敲击滤纸把种子均匀撒在１／２ＭＳ培养基上（为抑制细菌的生长，培养基中加入少许Ａｍｐ抗生素）。’（５）将培养Ｃ冰箱２ｄ。２ｄ基置于４，进行春化后移至光照培养箱中培养，正常光照（１６ｈ光培养／８ｈ暗培养）。（６）拟南芥在１／２ＭＳ培养基上生长２周后将带有４片真叶的小苗移植到栽培培＝－养基（睡石：营养止１：１）中。，Ｗ相同的条件培养，毎周繞水１２次１．２．４拟南芥转化拟南芥在止壤中大概生长７周左右，主苔长至１５ｃｍ左右开花旺盛时期可用于转３６ 第四章荷花Ｍ？ｙＧＣ方基因的功能分析化：，转化时将已经长成的角果剪去。转化步骤如下（１）将之前保存的阳性单克隆农杆菌菌液活化，在Ｈ角瓶中加入１０ｍｌＹＥＢ液体‘ａｎ和Ｒｉｆ）２８Ｃ振ｈｌ培养基（含Ｋ，荡培养２４，取上述菌液５ｍ至２５０ｍｌ新鲜ＹＥＢ‘液体培养基（含Ｋａｎ和Ｒｉｆ），２８Ｃ振荡培养１６ｈ，使ＯＤ值达到０．８左右。（２）将上述菌液分装在５０ｍｌ离也管中，５０００ｒｍ离也２０ｍｉｎ，弃上清ｐ，用浸染液将沉淀重悬（浸染液：１／２ＭＳ液体培养基，５％庶糖，ＫＯＨ调ＰＨ至５．７）。（３）将待浸染的拟南芥植株花朵浸泡在浸染液中，约１ｍｉｎ，将植株平放，用保－。ｈ后鲜膜罩在植株上，用于保湿暗培养１２ｈ１６，取下保鲜膜，将植株放回长日照光照培养箱自然生长。一（４）为提高转化率，在第次浸染后７ｄ进行第二次浸染，依照拟南芥开花情况决定是否进行第Ｈ次浸染。（５）常规管理拟南芥，种子成熟则可收获（Ｔ１代）。１．２．５拟南齐种子收获转化后大概１个半月后，拟南芥个别角果有发黄现象，则表明种子将成熟，可将角果剪下放在种子袋里干燥。当拟南芥大部分角果都枯黄时，可将植株地上部分剪下’。１．５ｍｌ４Ｃ。来放在种子袋内干燥待种子完全干燥后，清理干净放在离也管中，保存１．３筛选阳性拟南芥’Ｍ将４Ｃ保存的收获的Ｔ１代拟南芥种子播种在含有潮霉素的１／２Ｓ固体培养基上，２播种方法同１．３．２．。一待播种后７ｄ左右可观察到有些拟南芥种子正常萌发并生长，其余的则不能正常生长，那么正常生长的拟南芥即为阳性拟南芥苗。播种１５ｄ后，可将阳性苗移植到±中，斑足水，并用保鲜膜覆盖Ｗ保湿，７ｄ后取下保鲜膜，将其放置在短日照光照培养箱内正常管理，等待收获Ｔ２代种子。１．３．１转基因植株鉴定ＤＮＡ水平：提取筛选得到的拟南芥总ＤＮＡ（ＤＮＡ提取方法见附录走），Ｗ总ＤＮＡ为模板，未转基因野生型拟南芥为阴性对照，利用潮霉素引物和目的基因全长引物进行ＰＣＲ反应扩増．３．８。，反应体系及程序同第二章１ＲＮＡ水平：取ＤＮＡ水平检测到的阳性苗，提取ＲＮＡ，并反转录成ｃＤＮＡ，ＷｃＤＮＡ为模板ＭＤＣ４３－Ｎｎ〇ＣＳ重组子，ＷｐＹ质粒为阳性对照，Ｗ野生型拟南芥为阴性３７ ？荷花Ｍ？ＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ｙ对照。用荷花全长引物和潮霉素引物进行ＰＣＲ扩増。Ｗ拟南芥基－ｃ－－因为内参引物（ＡｔＡｃｔ２Ｆ和ＡｔＡｔ２Ｒ见表２１）检测ｃＤＮＡ的质量。１．３．２转基因拟南芥表达分析Ｗ鉴定出的阳性拟南芥为材料，提取ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，设计荷花ｉＶｗＧＣＳ基因特异引物，Ｗ拟南芥知ｖ４Ｃ７Ｗ基因为内参，进行巧光定量实验。目的在于选择出表达量高的转基因株系，Ｗ便进行后续功能验证实验。１．４荷花ＷｗｙＧＣＳ基因在拟南芥中功能验证１．４．１根长的比较‘将在４Ｃ进行过春化的野生型拟南芥和转基因拟南芥种子播种在１／２ＭＳ培养基上，垂直放置在短日照光照培养箱内培养两天，然后在超净工作台上分别将其转移到含有不同浓度領（５０＾１１＾１，ｌＯＯｕＭ，２００＾１１鸣的１／２？４８培养基上，每个培养皿上播种５棵转基因株系和５棵野生型株系，每种浓度设置３个重复，垂直放置生长２周后测量根长，观察表型。１．４．２福胁迫下种子发芽率将收获得到的Ｔ３代转基因拟南芥种子和野生型拟南芥种子播种在含有不同浓度領的１／２ＭＳ培养基上每个培养皿内分别播种５０棵野生型种子和５０棵转基因种子，，一同锦浓度设置３次重复。放置在短日照光照培养箱中培养，７ｄ后观察种子萌发情况，并统计发芽率。１．４．３福胁迫下拟南巧植株生长量影响一在含領培养基上生长３周的野生型植株和转基因植株，１０个植株为组称量鲜重（包括根，重复３次，比较野生型和转基因植株生长量差异。，茎和叶）１．４．４福胁迫下生理指标变化将在±中正常生长的野生型和转基因拟南芥植株取出，用蒸馈水冲洗干净根须，２＋放于含１００＾＼１£（１的蒸馈水中，在处理后０１１，Ｉｔ３ｈ，６ｈ，１２ｈ，２４１１时取叶片测定ＳＯＤ含量。每个指标取３株幼苗，Ｈ次重复。ＳＯＤ活性的测定采用氮蓝四嗤（ＮＢＴ）光化还原法（李合生，２０００）。反应液包括５０ｍＭｐＨ７．８磯酸缓冲液１．７ｍｌ，１３０ｍＭ甲硫氨酸溶液０．３ｍｌ，７５０ｆｉＭＮＢＴ溶－溶液０液０．３ｍｌ，１ｍＭＥＤＴＡＮａ２．３ｍｌ，２０Ｍ核黄素溶液０．３ｍｌ，酶提取液１００，ｎ叫３８ 第四章荷花ＡｆｎＧＣＳ基因的功能分析ｙＷ磯酸缓冲液替代酶提取液设置一一２个对照管，其中支放置暗处用于调零，另支和其余各样品管于５０００ｌｘ日光灯下照光反应１５ｍｉｎ，反应结束后，分别测定各管在５６０ｎｍ波长处的吸光值。Ｗ抑制ＮＢＴ光还原反应５０％的酶量为１单位（Ｕ）ＳＯＤ酶活性。＊＊＊＊＝ＳＯＤ总活性Ａｃｋ－Ａｅ０ｃｃＷ．５ＡｋＷＶ（）（）（Ａｃｋ：对照管吸光值，Ａｅ：样品管吸光值，Ｖｔ：样品叶总体积，Ｗ：样品鲜重，Ｖｃ：测量时酶液体积）丙二酸（ＭＤＡ）含量的测定采用硫代己比妥酸（ＴＢＡ）比色法（李合生，２０００）。Ｓ氯石酸（ＴＣＡ）ｍｒｍ取０．５ｇ样品，加５％５ｌ，研磨后所得匀浆在室温下４０００ｐ离也〇２０ｍｉｎ。取上清液２ｍｌ，力口２ｍｌ０．６７／〇ＴＢＡ溶液，混合均匀后沸水浴３０ｍｉｎ，冷却后一再离也次。分别测定上清液在４５０ｎｍ，５３２ｎｍ和６００ｎｍ波长处的吸光值，ＭＤＡ＝６ｘ－Ａ－ｘｏ浓度（叫＂．４５（Ａ５３２６〇〇）〇．５６Ａ４５〇，再算出单位鲜量组织中的ＭＤＡ含量（牌ｌ／ｇＦＷ）。每个处理３个重复。２结果与分析２．１转基因拟南芥鉴定提取转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片ＤＮＡ和ＲＮＡ，用ｉＶｗＧＧＳ基因特异引物。结果表明（图４－和潮霉素引物进行ＰＣ民扩増１）转基因拟南芥植株能够扩增出潮霉素条带和ＭｉｙＧＧＳ基因特异条带。取１帖ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，稀释３０倍，进行巧光定量表达分析。结果表明ｉＶｎｙＧＣＳ基因在转基因拟南芥植株中表达量显著高于野生－。这些结果都证实了荷花型拟南芥（图４２）ｉＶｗＧＧＳ基因已经成功转入拟南芥中。可Ｗ进行后续功能验证方面的实验。４－ＤＮＡ图１转基因拟南巧鉴定Ｆ－１ＤＮＡｉｄｉ打ｉｉｔｉｌｔｉｇ．４ｅｎｔｃａｔｏｎｎｒａｎｓｇｅｎｃａｎｓｐＷＴｌ、１、２、３；潮霉素引物，ＷＴ２、４、５、６；特异引物ＷＴｌ／１／２／３：ＰｒｉｍｅｒｓｏｆｈｒｏｍｃｉｎＷＴ２／４／５／６：ＳｅｃｉａｌｒｉｍｅｒｓｏｆＴＶ巧ＧＣＳｙｇｙ，ｐｐｙ３９ 荷花ＷｗＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证Ｔ王一王Ｔ王一２Ｔ王一３２５０「丄Ｊ２。。咖卽琴Ｉ１１００Ｉｉ巧量ｓ，＿。＿，ｊ一，■Ｊ－－ＷＴＴ１１Ｔ１２Ｔ１－３４－２图拟南芥中ＭｚＧＣＳ表达分析ｙ‘＾－ＥｘＦｉｉ口成巧ＷＷ说幻３ｇ．４２ｐｉｅｓｓｉｏ打ａｎａｌｙｓｓｏｆＴＶ巧ｙＧＣＳｉｎ扣化Ｗ幻２．２福胁迫下根长比较２＋－３由图４可Ｗ看出在含Ｃｄ培养基上生长１４ｄ的拽南芥受矯影响，植株生长受到２＋浓度抑制。且随Ｃｄ増大，抑制情况不断增强，拟南芥根系生长也受到较大限制。值２＋得注意的是，在相同Ｃｄ浓度的培养基上，转基因拟南芥植株明显比野生型植株健壮，２＋且根长显著长于野生型。随着Ｃｄ浓度的増加，转基因植株受領抑制明显小于野生型，对福的耐受力更强，而野生型则出现了生长弱，株型瘦小等现象。在含福培养基上生长４５ｄ时，可Ｗ看到转基因植株依然生长良好，根系发达，须根数多。而野生型植株。则株型较小，根系瘦弱，须根数少，甚至出现枯黄，死亡的现象图４－３搞胁迫下拟南芥生长情况－ｗＦ．／／ｉｇ４３Ｔｈｅｒｏｔｈｏｆ幻６成ｓｓｆ片幻／ｆ幻巧幻ｕｎｄｅｒｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓｇ取４０ 第四章荷花ＷｎｙＧＣＳ基因的功能分析２．３福胁迫下发芽率比较将转基因巧南芥和野生型拟南芥种子播种于含福培养基上，７ｄ后观察种子发芽情况。结果发现；转基因拟南芥种子和野生型拟南芥种子萌发情况都受到領影响，且随２＋２＋ｄ－４）着Ｃ浓度的不断増大，种子萌发率越来越低（图４。Ｃｄ浓度为０时，萌发率２＋在９６％左右，在£（１浓度为２００１＼１时，萌发率降低到６０％左右。然而不同的是，［。在相同箱浓度下，转基因拟南芥种子萌发率明显髙于野生型而且，随着領浓度的升高。，转基因拟南芥种子萌发率降低的程度也小于野生型２．４福胁迫下拟南芥植株生长量变化２＋一组称量鲜重在含Ｃｄ培养基上生长生长３周的拟南芥植株，１０株为，重复３２＋次。对比野生型拟南芥和转基因拟南芥受領影响后生长量差异。结果表明，在含Ｃｄ培养基２＋上生长的拟南芥植株生长量受锅影响显著，且随着Ｃｄ浓度的增加，生长量不断减少（图４￣４）。然而不同的是，转基因拟南芥植株较野生型拟南芥生长情况好，即２＋相同矯浓度胁迫下，转基因植株生长量比野生型生长量大，随Ｃｄ浓度増大，生长量减少幅度较野生型小。１００三占———４０ｒ寒广丈１＾…―８３０化Ｉ三３巧１饼．—§ＷＴ—Ｗ―器愚喜，如ｎ－－一－—ＴＷＩ吝Ｔ．３５Ｉ４０巧－－￣Ｉ２０＾Ｉ…＊＂■０＇—０５０１００２０００５０ｌｏｏ２００巧浓度巧浓度ＣａｄｍｉｕｎｃｃＨ＾ｎｔｒａｔｉＱｎ（｜．ｕｎｏ１／ｌ）Ｃａｄｍｉｕｎｃｏｎｃｅ！ｉｔｒａｔｉｏｎ（＾ｍｏｌ／１）图４＾镜胁迫下拟南芥生长量及发芽率比较－ｅｒＦｃａｄｍｒｅｓｓｉｉｎｔｉｉｅｌｄｏｆＡｒａｂｉｄｏｓｉｓｈａｌｉａｎａｕｎｄｉｕｍｓｔ．４４Ｔｈｅｅｒｍａｏｎａｎｄｔｇｙｐｇ２．５福胁迫下植株内生理指标变化２＋Ｃｄ胁迫条件下，随着处理时间的延长，野生型拟南芥和转基因拟南芥中抗氧化酶活性（ＳＯＤ）均有所提高。且２４，其中野生型酶活性提高幅度明显大于转基因植株ｈ后，酶活性均大于正常生长条件下的水平。说明铜对植物均产生了影响，对野生型４１ 荷巧ＭｉＧＣＴ基因克隆、表达及功能验证ｙ的伤害大于转基因植株。丙二處（ＭＤＡ）是衡量细胞膜脂过氧化程度的标尺。实验结２＋处理两天后。不同的是，果表明，在Ｃｄ，野生型和转基因植株ＭＤＡ含量均有所升高野生型ＭＤＡ升高水平较转基因植株高。说明野生型植株受伤害程度大于转基因植株，也从侧面说明了ＭｉＧＣＳ基因的功能。ｙ２５０撕，一．１撕二芳：為Ｓ誦１２父？＾至＾中Ｉ？＊ＴＩ－３＊Ｃｄ香－氏去為朵之一Ｉ窒１００和了１，脚撕■＊巧ｎ．觀言一Ｔ含！城ｉ８，ｍｉＭ…．———…―…―……巧化．。８乏麵■■！０１３６１２２４０２时间Ｔｉｍｅ伊）时间Ｔｉｍｅ（ｈ）图４￣５镜对转基因拟南芥中ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量影响Ｆ－ｒＤＤＡｉｌｔｉ．４５ＥｆｆｅｃｔｏｆＣｄｔｅｓｓｏｎＳＯａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＭｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｅｎｃａｎｓｇｇｐ３讨论虽然重金属对植物的生长发育有非常严重的毒害作用一些植物在高浓度重金，但属±壌环境或水体环境中依然能够正常生长，说明植物在长期的进化过程中形成了适应重金属的耐性机制、。福抑制氮的吸收和运输，抑制根系生长。本研究中转基因拟南一定程度的抑制，芥和野生型拟南芥在含領培养基上的根系生长都受到了，但是转基因株系根长仍然长于野生型一，说明转入拟南芥内的ｉＶｗＧＣＳ基因对于福毒害起到了一Ｍｕｎｚｕ定的减缓作用。这与小麦和黄瓜种子福胁迫实验中得到的结果致（ｒｏｇｌｕａｎｄＧｅｄｄｌ，２００２）。关于福抑制根系伸长的原因有研究称铺诱导根系产生艺帰，艺稀对细胞有很强的伤害作用（曾翔等，２００７），因此根系生长受抑制。还有研究证明領胁迫下植物细胞中核酸含量下降（周青等，１９９９），这可能也是根系生长受限制的原因之一。种子发芽率也受領影响，随着铜浓度的不断升高，种子发芽率逐渐降低，但是在相同镜浓度下，转基因拟南芥种子的发芽率却明显高于野生型拟南芥。ＷｗＧＧＳ基因一定程度的提高对于种子的耐锅能力也有。３＋２＋锅抑制Ｆｅ还原酶活性，导致Ｆｅ的缺乏，影响光合作用效率（Ａｌｃａｎｔａｒａｅｔａｌ．，１９９４）。箱还能引起叶片卷曲和缺绿，减少生长量（Ａｉｄｉｄｅｔ址，１９９２）。本研究在含锅培养皿上播种的拟南芥生长过程中也出现叶片缺绿现象，并且野生型拟南芥缺绿情况４２ 第四章荷花ＡＭ？ｃｙ基因的功能分析比转基因拟南芥严重得多一，生长量明显小于转基因植巧，这从方面证明了荷花基因在拟南芥中发挥抵御重金属毒害的作用。锅胁迫能够产生氧化胁迫，然而不同于其他重金属的是，福不是直接作用于氧化产物的产生，例如領能够増强膜脂过氧化，而是抑制参与抗氧化反应的几种酶的活性程度（过氧化物酶，过氧化氨旗，超氧化物歧化酶，谷腕甘肤，降低抗氧化廣的活巧还原酶等）（Ｇａｌｌｅｇｏ巧ａｌ．ｌＷ６）。锅胁迫巧期，，，芦竹抗氧化能力有増强趋势随着胁迫时间的延长，锅进入植物体内，对植物产生不可逆的伤害，酶活性会随之降低（韩志萍等，２００８）。本研究中，锅胁迫１ｈ后，野生型和转基因植株体内，ＳＯＤ活性均００８）急剧増强，且巧生型活性高于转基因株系，韩志萍等（２关于铺胁迫芦竹的研究中３ｈ，在锅胁迫１０ｄ左右，ＳＯＤ活性才开始下降，而本文中胁迫后就开始下降，猜。測可能由于拟南芥株系较小，对箱的忍受能力不如株系较大的芦竹而镜胁迫后，ＳＯＤ活性变化的趋势却是相同的。野生型植株和转基因植株在锡处理２ｄ后，植株内ＭＤＡ２００６含量均提商，与谭晓荣等（）研究領对，说明重金属对植株产生膜脂过氧化伤害一致小麦幼苗的影咱实验中结果。本研究从转基因巧南芥表型和生理指标方面初步证明了ｉＶＧＣ芯基因在耐重金属ｗ一方面的作用步设计试验进行更深入的研究。。关于该基因具体作用的机理尚需进４３ 全文结论全文结论－１．ＧＣＳ），基因全长１撕１从荷花中克隆Ｙ谷氨醜半腕氨酸合成酶基因Ｗ／ｉｙ咕，开放阅读框（ＯＲＦ）１５６９ｂｐ，编码５２２个氨基酸，具有ＧＣ说基因家族典型结构域。系统进化分析表明荷花ｙＧＣＳ属于双子叶植物类，与龙眼，百脉根亲缘关系较近。２．ＪＶｗＧＣＳ在荷花各器官均有表达，属组成型基因。各器官表达量商低依次为：嫩叶最苗ｉＶ＾ｉＧＣＳ，其次叶柄，成熟叶，根须，剑叶，茎最低。锅胁迫下，ｙ在叶片和根部都有咱应？，且高浓度锅能诱导该基因表达水平更高２＋３．Ｃｄ胁迫下，測定荷花各器官锅积累量，结果表明荷花的根须和叶片是主要的锡积累器官。叶片中锅积累量高迭１０００１／干重。在根茎中积累量最少８０／｜６８，仅ｎｇｇ干重。。荷花属超富集植物４．构建了荷花ｉ州减进正义表达载体，并利用基因枪轰击洋葱表皮细胞技术进行定位实验，结果表明ｉＶｗＧＣＳ莲因定位于细胞质。ｙ一５．利用农巧菌侵染拟南芥花序法输化ＧＣＳ基因导入拟南芥，获得具有定销抗性ｙ＋２的转基因植株。在含Ｃｄ培养基上播种野生型和转基因拟南芥种子，比较其发芽率，生长量，根长等表观特征。结果表明转基因株系发芽率窩于野生型，根系生长也比毋生型巧盛２＋，生长量大于巧生型。用１００１１斯：（１处理后，巧生型拟南芥膜脂过氧化程度｜大于转基因植株，抗氧化巧活性也高于转基因植株。巧步证明ＭｉｙＧＣＳ对于財重金属的贡献。４５ 色Ｊ巧之处创新之处１．首次从荷花中克隆得到基因，并利用基因枪技术验证Ｗ＞ｉｙＧＣＳ基因定一位于细胞质中。，与其他方法得到的结果致２一．将荷花ＷｗＧＣＳ基因导入拟南芥得到的转基因植株具有定的財锡能力。证明■ｉＶ＞ｉｙＧＧＳ基因在植物抗重金属和水体净化方面的作用，具有研究价值，４７ 参考文献参考文献ＡｉｄｉｄＳＢ，ＯｋａｍｏｔｏＨ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｌｅａｄ，ｃａｄｍｉｕｍａｎｄｚｉｎｃｏｎｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｔｔｈｅｘｙｌｅｍ／ｓｙｍｐｌａｓｔｉｎｔｅｒｆａｃｅａｎｄｃｅｌｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆＩｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＥｘ？ｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ１９９２，３２４：似９４４８．ｐ，（）Ａｌｃ＾ｔａｒａＥ，ＲｏｍｅｒａＦＪ，ＣａｆｉｅｔｅＭ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃ技ｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｏｎｂｏｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄ扣ｎｃｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔＦｅ－１１１ｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎＦｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔｃｕｃｕｍｂｅｒＣｉｉｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ｌａｎｔｓＪ．ＪｏｉｕｎａｌｏｆＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌ（）（）ｐ［］ｐＢｏ－ｔａｎｙ，１９９４４５１：１８９３１８９８．，（巧ＢａｎｕｅｌｏｓＱＡｊｗａＨ，ＭａｃｋｅｙＢ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓｕｓｅｄｆｏｒｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆｌｉｔ－ｈｉｇｈｓｏｉｌｓｅｌｍｕｎｉＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｕａ１９９７２６：６３９６４６．［］Ｑｙ，，ＢｒｏｗｎＳｋＣｈａｎｅｙ民Ｌ，ＡｎｇｌｅＪＳ，ｅｔａｌ．ＰｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＴｈｌａｓｐｉｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓａｎｄ－ｂｌａｄｄｅｒｃａｍｐｉｏｎｆｏｒｚｉｎｃａｎｄｃａｄｍｉｕｍ＜ｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏｉｌＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｕａｌｉｔ［］Ｑｙ，－１９９４２３６：１１５１１１５７，（）ＢｕｃｈｉｒｅｄｄｙＰＲ？Ｂｒｉｃｋａ民ＭｙＧｅｎｔＤＢ．Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆｗｏｏｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏｉｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｐｐｅｒ，ｃｈｒｏｍｉｕｍ＾ａｎｄａｒｓｅｎｉｃ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｈａｚａｒｄｏｕｓｍａｔｅｒｉａｌｓ＾２００９，１６２〇）：４９０－４９７．ＣｈａｌｆｉｅＴｕＹ，ＥｕｓｋｉｒｃｈｅｎＧｅｔａｌ．Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ化ａｍａｒｋｅｒｆｏｒｇｅｎｅｅ巧ｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．－Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９４２６３巧１４．，：８０２８０５，巧－ｎｔｈｅｔａｓｅＣｈｅｎＪＧｏｌｄｓｂｒｏｕＰＢ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｃｔｉｖｉｔｏｆａｉｍｎａｌｕｔａｍｌｃｓｔｅｉｎｅｓｉｎｔｏｍａｔｏｃｅｌｌｓ，ｇｈｙ［ｇ］ｇｙｙｙ巧３－ｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｉｔｏｌＪ．ＰｌａｔＰｈｓｉｏｌｏ１９９４１０６１２３乂ｃａｄｍｕｍｅｒａｎｃｅ［］ｎｙｇｙ，，（）：ＣｈｅｎＴＢ，ＷｅｉＣ义ＨｕａｎｇＺＣ，ｅｔａｌ．ＡｒｓｅｎｉｃｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒＰｔｅｒｉｓｖｉｔｔａｔａＬ．ａｎｄｉｔｓａｒｓｅｎｉｃ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ阴．ＣｈｉｎＳｃｉＢｕｌｌ＊２００２，４７（１１）：９０２９０５．ＭＭ－－ＣｏｂｂｅｔＣＳａＪ，ＨｏｗｄｅｎＲｅｔａｌ．Ｔｈｅｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔｃａｄｍｉｕｍｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔ，，ｙ，ｇ，￣－ｃａｄ２ｌｏｆＡｒａｂｉｄｏｓｉｓｔｂａｌｉａｎａｉｓｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｌｕｔａｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｎ１ｆａｅｔａｓｅＪ．ＴｈｅｌａｎｔｌｍＰＪｏｕｒｎａｐｙｇｙ［］，，ｙ１９９８１６１７３－７８：，，（）ＣｏｂｂｅｔｔＣＳ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓａｎｄｄｉｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｈｅａｖｙｍｅｔａｌｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，－１２３３：８２５８３２．（）ＣｏｂｂｅｔＣ，ＧｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈＰ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓａｎｄｍｅｔａｌｌｏ他ｏｎｅｉｎｓ：ｒｏｌｅｓｉｎｈｅａｖｙｍｅｔａｌｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉ－ｌｆｌｔｂｉｌ２００２９始．ｈｏｍｅｏｓｔａｓｓＪ．Ａｎｎｕａｒｅｖｉｅｗｏａｎｏｏ巧。：１５１［］ｐｇｙ，，）ＥｂｂｓＳＤ，ＬａｓａｔＭＭ，ＢｒａｄｙＤＪ，ｅｔａｌ．Ｐｈｔｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｃａｄｍｉｕｍａｎｄｚｉｎｃｆｒｏｍａｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｙ？ｓｏｉｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｕａｌｉｔ１９９７２６５：１４２４１４３０．。Ｑｙ，，（）４９ 荷花ＷｗＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证ＥｌｌｉｓＤＲ，ＳａｌｔＤＥ．Ｐｌａｎｔｓ，ｓｅｌｅｎｉｕｍａｎｄｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔｏｉｎｉｏｎｉｎｌａｎｔｂｉｏｌｏ，２００３，６３：［］ｐｐｇｙ（）－Ｔｎ１１９．ＦａｎＸ，ＨｅＸｊＧｕｏＸ，巧ａｌ．Ｉｎ灯ｅａｓｉｎｇｇｌｕｔａｔｈｉｏ打ｅｆｏｒｍａｔｉｏ打ｂｙｆｔｉｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｏｆ化ｅ－ｌｕｔａｍｌｃｓｔｅｉｎｅｓｎｔｈｅｔａｓｅｅｎｅｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｌｅｔｅｒｓ２００４ｙｇｙｙｙｇ［］，，２６５４１５－１：４７．（）ＦｅｎｇＲ，ＷｅｉＣ，ＴｕＳ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳｅｏｎｔｈｅｕｐｔａｋｅｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＰｔｅｒｉｓｖｉｔｔａｔａＬ［Ｊ］，Ｐｌａｎｔ－２－ａｎｄｓｏ化２００９３２５１：１２３１３２．，（）＇ＦｅｎｇＴ，Ａ化ｕａＰ，Ｂｉｎｇｇｅｎｅｔａｌ．ＷａｎｇＷｅｎｑｉｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ；ＲａｉｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＭｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｂＬｉｎｅａｒＳｗｅｅＰｏｌａｒｏｒａｈＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌｐｙｐｇｐｙ［］Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９９３，５．ＦｒｅｓＰｒＪＭｏｘａｖＤＮＡｌｏＡｅｅｚ．Ｃｔｔｏｉｃｉｔｏｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｉｔｒｏｄａｍａｅｉｎｄｕｃｅｄｂｏｔａｓｓｉｕｍ，ｙｙ，ｐｐ，ｇｙｐＪ－ｃｈｒｏｍａｔｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄａｌｉｅｄｈａｒｍａｃｏｌｏ１９９９１６１１：７５８１．［］ｐｐｐｇｙ，，（）ｉ－ｅｎｅＦｏ：ｅｘｌｅＣＳｉｎｈＫＢ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａＶｃｉａｆａｂａｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｌｉｋｅｒｅ巧ｉｏ打ｉｎｆｏｌｉａｒｙ民，ｇｇｐｍｏ－ｔｒｉｃｈｏｒａｅｓＪ．Ｐａｎ１４４４４ｌｔｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ１９９４２６：３５．［］ｇｙ，，（）ＧａｌｌｅｇｏＳＭ，ＢｅｎａｖｉｄｅｓＭＰ，ＴｏｍａｒｏＭＬ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｉｏｎｅｘｃｅｓｓｏｎｓｕｎｆｌｏｗｅｒｌｅａｖｅｓ：ｒｎｖｏｖｅｍｅｎｏｘａｖｅｒｅｓｓｃｅ－ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｉｌｔｏｆｉｄｔｉｓｔ？ＩＭａｎｔＳｃｉ畑１９９６１２１２：１５１１巧．…，，（）－Ｈｅｍ姐ｚＬＭＧａｒａａｄｅｚＭＭｕｒｈＡＴａｉ．ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓＩａｎｄ２ｈａｖｅ出ｓｔｉｎｃｔｂｕｔｏｖｅｄａｉｎ，ｐｙ，ｐｐｇｒｅｓｓｎｒＰａｎ－ｅｘＰ１１１２ｉｏａｔｔｅｎｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｓｉｓ．ｌｔｈｓｉｏｌｏ９９８８：３８７３９７．ｐｐｐ…ｙｇｙ，，（）ＧａｓｉｃＫ，ＫｏｒｂａｎＳＳ．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＩｎｄｉａｎｍｕｓｔａｒｄＢｒａｓｓｉｃａｕｎｃｅａｌａｎｔｓｅｘｒｅｓｓｉｎａｎＡｒａｂｉｄｏｓｉｓ（ｊ）ｐｐｇｐｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓｙｎｔｈａｓｅＡｔＰＣＳｌｅｘｈｉｂｉｔｅｎｈａｎｃｅｄＡｓａｎｄＣｄｔｏｌｅｒａｎｃｅＪ，Ｐｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ，（）［］ｇｙ－％９２００７６４４：３６１．，（）Ｗｉｎｎａｃｋ－ｍｅｔａ－ＧｒｉｌｌＥＬ５ｆｌｅｒＳｔａｌ．Ｐｈｔｅｌａｔｉｎｓｔｈｈｌｂｉｎｄｉｎｔｉｄｔ，，ｅｒ巨Ｌ，ｅｙｏｃｈ，ｅｅａｖｅｅｓｏｆｌａｎｓａｒｅｙｇｐｐｐ，ｔｈｅｓｆｒ－ｓｎｉｚｅｄｏｍｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｂａｓｐｅｃｉｆｉｃｌｕｔａｍｌｃｓｔｅｉｎｅｄｉｅｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｅｔｉｄａｓｅｙｇｙｙｇｙｙｐｐｐｐ（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓｙｎｔｈａｓｅ）Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆ化ｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９８１８：［］ｇｙ，乂％（）６８３８－６８４２，ＨａＳＢ，ＳｍｉｔｈＡＰ，Ｈｏｗｄｅｎ巧ａｌ．ＰｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｔｈｅｙｅａｓｔＳｃｈｎｅ－ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｃｅｓｏｍｂｅＪ．ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌＯｎｌｉ１９９９１１６：１１５３１１６３．ｙ，，ｐ［］（）Ａ－ｎｄＨｅｌｌＲ，Ｂｅｉ，ＧｌｕｔａｍｙｌｃｓｔｅｉｎｅｓｔｈｅｔａｓｅｉｎｈｉｈｅｒｔｌｔｉｒｒｔｇｍａｎｎＬ．ｙｙｎｇｌａｎｓ：ｃａｔａｙｃｏｅｉｅｓａｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｐｐｐ４－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＪ．Ｐｌａｎｔａ１９９０１８０：６０３６１２．［］＾，（）ｅ－Ｈ化ｉＴＮｉｉＨＮａｋａｔｓｕＴｔａｌ．Ｃｒｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｌｕｔａｍｌｃｓｔｅｉｎｅｓｎｔｈｅｔａｓｅ：ｉｎｓｉｈｔｓｉ打ｔｏｔｈｅ，，，ｙｙｇｙｙｙｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｔａｌｓｉｓｂａｋｅｅｎｚｒｕａｎｅｈｏｍｅｏＪ．Ｐｒｙｙｙｙｍｅｆｏｇｌｔｔｈｉｏｓｔａｓｉｓｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅ［］ｇａＡＡｍ２００４４２５０５２－０５７ＮａｔｉｏｎｌｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆｅｒｉｃａ１０１：１１５．ｙ，，（）５０ 参考文献ＫｉｍＤ，ＧｕｓｔｉｎＪＬ，ＬａｈｎｅｒＢ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｐｌａｎｔＣＤＦｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＴｇＭＴＰＩｆｒｏｍｔｈｅＮｉ／ＺｎｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒＴｈｌａｓｐｉｏｅｓｉｎｅｎｓｅａｃｔｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｅｆｌｕｘｏｆＺｎａｔｔｈｅｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｗｈｅｎｇｇｐｅｘｒｅｓｓｅｄＴｈ－１ｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ■ｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ２００４３９２：別７２５．ｐｙ…，，（）Ｌａｎｅ６ＫａＴｗｈｅａ－ｚ－ｉｏｋａＫｅｎｎｅｄ．ＴｈｅｔｅｒｍＥｃｒｏｔｅｉｎｉｓ江ｉｎｃｃｏｎｔａｉｎｉｎｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎＪ．，ｊｙｇｐｇ［］－ＢｉｉｔｒａＣｅｌｌＢ１１１０１．ｏｃｈｅｍｓｉｏｌｏ９８７６５１：０１００５ｙｎｄｇｙ，，（）ＬｉＺＳ，ＬｕＹ巧ＺｈｅｎＲＱ巧ａｌ．Ａｎｅｗｐａｔｈｗａｙｆｏｒｖａｃｕｏｌａｒｃａｄｍｉｕｍｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏ打ｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖＹＣＦｌ－ｒｕｎａＪｎｉｓｉａｅ：ｃａｔａｌｙｚｅｄｔｒａｎｓｐｏｔｏｆｂｉｓｌｔａｔｈｉｏｔｏｃａｄｍｉｕｍ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｓｏｆｔｈｅ（ｇ）［］ｇＮｔＡ１１４２－ａｉｏｎａｌｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ９９７９４４７．ｙ，，（）：ＬｉｕＺＧｕＣＣｈｅｎＦｅｔａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｏｕｓｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｏｆａＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａｈｔｏｃｈｅｌａｔｉ口ｓｔｈａｓｅｅｎｅ，，，ｇｐｐｙｙｎｇｅｎｈａｎｃｅｓｃａｄｍｉｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＪ，Ａｌｉｅｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｐ［］ｐｐｇｙ，１１２２－４２０２６６３．：７巧，（）Ｌ－ｉｖａｋＫＪＳｃｈｍｉｔｅｎＴＤ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎ巧〇１１５虹０ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣ民，ｇｙｇｐｇｑ－ａｎｄＡＡＣＴｅ－ｔｈｏｄＪｔ１２５２．ｔｈｅ２ｍ．Ｍｅｈｏｄｓ，２００４：４０４０８［］，（）Ｍ＂ａＭ，ＬａｕＰＳ，？ＦｉａＹＴ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ地ｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅ１ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ（ＭＴ）ｃＤＮＡ－－＂ｆｒｏ田过ｈｅａｖｌｔｏｌｅｒａｎｔｌａｎｔＦｅｓｔｕｃａ－ｌｉｎ．巧ａｔｉ２００３４１１田ｅｔａｒｕｂｒａｃｖＭｅｒ…ｎＳｃｅｎｃｅ１６：５６０．ｙｐｊ，，（）ＭａｉｇｏｓｈｅｓＭ，ＶａｌｌｅｅＢＬ．ＡｃａｄｍｉｕｍｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｅｑｕｉｎｅｋｉｄｎｅｙｃｏｒｔｅｘＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ［］－Ｃｈｅｍｉｃａｉ．ｌＳｏｃｅｔｙ１９５７７９１７；４８１３４８１４，，（）ＭａｒｕｅｓｖｅｒｒｖａＥＤＤＥＤＴＡ－ｎｕｍＡＯｌｉｉａＳａｍａｄｉｅｅｔａｌ．Ｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｚｉ打ｃａｃｃｕｎｍｌａｔｉｏｎｂｓｏｌａｑ，ｊ氏ｙｒｕｍａｅｄｒ—ｃｒｒｒｗｎｎｎｉｇｉｎｏｃｕｌｔｗｉ化ａｂｕｓ山ａｍｙｃｏｈｉｚａｌｆｉｍｇｉｇｒｏｉｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏ。町Ｃｈｅｍｏｓｈｅｒｅ２００８７０（６）１－１１４；００２０．ｐ，，ＭａＭＪＶｅｍｏｕｘＴＳ站ｃｈｅｚ－Ｆｅｍ細ｄｅｚ氏ｅｔａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｏｓｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌａｃｄｖａｔｉｏｎｏｆｙ，，ｐｐ＊－ｒｅｓｓＰｒｏｙｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｄｕｒｉｎｇｐｌａｎｔｓｔｉｅｓｐｏｎｓｅｓＪ，ｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ呂［］ｇＡｏｆ１２０１２－１２ｃａｄｅｍＳｃｉｅｎｃｅｓ９９８９５：０４９０５４．ｙ，，（）ＭｅａｇｈｅｒＲ．Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆｔｏｘｉｃｅｌｅｍｅｎｔａｌａｎｄｏｉ＾ａｎｉｃｏｌｌｕｔａｎｔｓＪ．ＣｕｒｒｅｎｔＯｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔｐ［］ｐＢ－ｉｏｌｏ２０００３巧１６２：１．ｇｙ，，ＭｅｎｄｅｚＭ，Ｍａｉ灯民？Ｐｈｙｔｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏ打ｏｆｍｉｎｅｔａｉｌｉｎｇｓｉｎａｒｉｄａｎｄｓｅｍｉａｒｉｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ：Ａｎｅｍｅｉｇｉｎｇ－ｒｅｍｅｄｉｔＥｎｖｉｒｌｈＰｅｉｖ１１６：２７２．ｉａｔｏｎｅｃｈｎｏｌｏＪ］，ｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｔｒｓｅｃｔｅｓ，２００８８８３ｇｙ［ｐ，ＭｕｎｚｕｒｏｇｌｕＯ，ＧｅｃｋｉｌＨ．Ｅｆｌｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔａｌｓｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ，ａｎｄｃｏｌｅｏｐｔｉｌｅｓａｎｄｈｙｏｃｏｔｌｒｏｗｔｈｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍａｎｄＣｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓＪ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｙｇ［］ＣｏｎｍｎａＴ２２０３－ｔａｉｔｉｏｎａｎｄｏｘｉｃｏｌｏ２００２４３：２１３．ｇｙ，，（）ＭｕｒｐｈｙＡ，ＺｈｏｕＪ，ＧｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈＰＢ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｎｅ－１ｓｎａＰ７１１１ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｉｎｓ姐ｄ２ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｉｓｔｈａｌｉａ［Ｊ］．ｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９，３４：１２９３１３０．叩（）５１ 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参考文献－ＫＮＡＳｃｈａｆｅｒＨＪＨａａｅｒｗｅｒＡＲａｕｓｃｈＴ．ｃＤｃｌｏｎｉｎａｎｄｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｓｉｓｏｆｅｎ货ｅｎｃｏｄｉｎＣＳＨ，ｇ，ｇｐｙｇｇ－ｍｅｖ－ｓｔａｌａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒＢｒａｓｓｉｃａｕｎｃｅａ．ｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｒｏｏｔｓｏｆｔｈｅｈｅａｖｙＬ：ｅｉｄｅｎｃｅｆｏｒＣｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｊａｕ－ａｍｔＰｐｔａｔｉｖｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｙｇｌｕｔｙｌｃｓｔｅｉｎｅｓｙｎｈｅｔａｓｅｉｓｏｆｏｒｍＪ，ｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ，１９９８，ｙ［］ｇｙ－３７１：８７９７．（）ＳｅｋｈａｒＫＣ，ＣｈａｒｙＮＳ，ＫａｍａｌａＣＴ，巧ａｌ．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ－ｖｒｏｎｍｅｓｅｄｉｍｅ打ｔｂｏｕｎｄｈｅａｖｍｅｔａｌｓｉｎＫｏｌｌｅｍｌａｋｅｂｅｄ化ｌｅ行ｓｈＪ．ＥｎｉｎｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２００４ｙｙ［］，，２９７－８．：１００１１００（）ＳｅｍａｎｅＢ，ＣｕｙｐｅｒｓＡ，ＳｍｅｅｔｓＫ，ｅｔａｌ．ＣａｄｍｉｕｍｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ化ａｌｉａｎａ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｍｎ－ｍｅｔａｂｏｌｉｓ抑ｄａｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅ佐ｎｅｅｓｔｅｍＪ．ＰｈｓｉｏｌｏｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ２００７，１巧：５１９５２８．巧［］ｙｇ，口）ＳｕｓａｒｌａＳ，ＭｅｄｉｎａＶＦ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎＳＣ．Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｃｎ：ａｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｃａｌ－ｔｔ．ｃｏｎａｍｉｎａｉｏｎＪＥｃｏｉｌＥｎｉｎ２００２１８５：７．ｌｏｃａｅｅｒｉｎ，，（６４６５８［］ｇｇｇ）Ｔｅｉｍｓｔｅｄｔ巧ＰｅｉｓｋｅｒＤ，目６ｔｃｈ巧Ｃ，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆｅｘｃｅｓｓｚｉｎｃａｎｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｔｏｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｚｉｎｃＪ．ＰｌａｎｔＰｈｓｉｏｌｏ，２００９，ｙ［］ｙｇｙ－１４９２９３８９４８（）：．ＴｉｗａｒｉＳ，ＫｕｍａｒｉＢ，ＳｉｎｇｈＳ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｍｏｂＵｉｔｙ／ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙｉｎｆｌｙａｓｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｈｉｚｏｓｈｅｒｉｃｚｏｎｅｏｆＴｈａｌａｔｉｆｏｌｉ红ｒｏｗｉｎｏｎｆｌｙａｓｈｄｕｍｓＪ．ｐｙｐｇｇｐ［］－Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｈｎｏｌｏ：１３Ｔｅｃ２００８９９０５１３１０．ｇｙ，，ＶａｊｐａｙｅｅＰ，ＳｈａｒｍａＳＣ，Ｔｒｉｐａｔｈｉ民Ｄ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏａｃｃｕｍ山ａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｉｕｍａｎｄ化ｘｉｃｉｔｙ化ｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｉｇｍｅｎｔｓｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔａｎｄｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａｐｐ，ｙｐ－ａｅｒｔｉｎＪ．Ｃｈｅｍｏｓｈｅｒｅ１９９９３９２：２１５９２１６９．ｇ［］ｐ，，ｙ）ＶａｎｄｅｒＺａａｌＢＪ，ＮｅｕｔｅｂｏｏｍＬＷ，ＰｉｎａｓＪＥ，ｅｔａｌ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄ－ｍａｎ：ｃｒａｒｅｎｅｎｅａｄｎｈａｎｃｅｄｒｅｓａｎｄｔｏｐｕｔａｔｉｖｅｚｉｎｔｎｓｐｏｒｔｅｇｓｆｒｏｍａｉｌｓｃａｌ化ｅｚｉｎｃｉｓｔａｎｃｅｎＰｈｓ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｌａｔｙｉｏｌｏ１９９１１９３：１０４７１０５６．＾］ｇｙ，乂（）ＶａｎｇｒｏｎｓｖｅｌｄＪ，ＨｅｒｚｉｇＷｅｙｅｎｓＮ，ｅｔａｌ．Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏ打ｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏｉｌｓａｎｄｇｒｏｕｎｄｗａｔｅｒ：Ｌｅｎｖｒ２００９－ｓｓｏｓｆｒｏｍ：７７９４ｔｈｅｆｉｅｌｄＪ．ＥｎｉｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｏｌｌｕｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１６６５．［］，，－－Ｖ６ｅ．ＰｇｌｉＬａｎｅＷａｇｎｅｒＧＪＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏ打ｏｆＣａｄｍｉｕｍａｎｄＣａｄ阳ｉｕｍＢｉｎ出打ｇｅｔｉｄｅｓｉｎｇｐＴ－ｏｂａｃｃｏＬｅａｖｅｓＩｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａＴｒａｒｔＦｕｔｉｒＣａｄｉＢｉｎｄｉｎＰｔｉｄＪ．Ｐｌｔｍｐｉｏｓｐｏｎｃｏｎｆｏｍｕｍｇｅｐｅｓ［］ａｎＰｈｓ１４１０－ｉｏｌｏ９９０９２８６１０９３．ｙｇｙ，，（）：ＷｈｉｔｅｌａｗＣＡ，ＬｅＨｕｑｕｅｔＪＡ，ＴｈｕｒｍａｎＤＡ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅＩＩ－ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｌｉｋｅｅｎｅｓｆｒｏｍ化ｍａｔｏＬｃｏｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＰｌａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｇ（ｙｐ，１９９７３３３－５１５０３１．，（）：Ｗｕｎｅｅｃｕｎｚａ－ＪｕＴＣｈｅＳｔａｌａａｎｄｃｈａｒａｃｅｒｉｌｕｎｅｎｅｌ．Ｍｏｌｒｃｌｏｎｉｔｉｔｏ打ｏｆａｔａｍｌｃｓｔｅｉｓｔｈｅｔａｓ，Ｑ，，ｇｙ呂ｙｙｙｅｎｅｍｅａｎａＪ－－Ｐａｓｍａ２３５１４２７３６．ｇｆｒｏＣｈｏｒｉｓｐｏｒａｂｕｎｇ［］．ｒｏｔｏｐｌ，２００９，（）：５３ 荷巧Ｗ巧基因克隆、表达及功能验证ＸａｎＪ．ｕａｅｉｒｉｌｒｅｓｍｅａｎｄａｍｏｎｉＯｌｉｖｅｒＤＧｌｔｔｈｉｏｎｍｅｔａｂｏｌｃｅｎｅｓｃｏｏｄｎａｔｅｏｎｄ化ｈｅａｖｔｌｓａｓｉｃｇＣ，ｇｙｐｙｊ－ａｃｉｄｉｎＡｒａｂｉｄｏｓｉｓ．ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌＯｎｌｉｎｅ１９９８１０：１５３９１５５０．ＮｏｃｔｏｒＡｒｉｓｉＡＣｐｍ，，巧）ＱＪｏｕａｎｉｎＬ，巧ａｌ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｔｏｓｔｒｅ巧ｔｏｌｅｒａｎｃｅｅｘｐｌｏｒｅｄＢ１４９－ｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｌａｎｔｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｔａｎ，９９８，３２１：６２３６４７．ｐ［］ｐｙ（）Ｍ－－Ｚｅｎｋ吐Ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｈｉｈｅｒｌａｎｔｓａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ．Ｇｅｎｅ１９９６１７１：２１３０．ｇ］，，％）ｐＺｈａｎｇＸ，ＸｉａＨ，ＬｉＺ，巧ａｌ．Ｐｏｔｅ凸ｔｉａｌｏｆｆｏｕｒｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅｓｉｎｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆＣｄａｎｄＺ打ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｉｌｏｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｏ２０１０ｂ１０１－ｓｏｓＪｒｅｓｌ；２０６３２０６６．Ｂｉｇｙ．［］，，ＺｈａｏＣ，ＸｕＪ，ＵＱ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ过Ｐｈｒａｍｉｔｅｓａｕｓｔｒａｌｉｓｈｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓｎｔｈａｓｅｇｐｙｙ（Ｐ沁Ｃ巧ａｎｄａｃｈｉｅｖｉｎｇＣｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔａｌｌｆｅｓｃｕｅ［Ｊ］？巧ｏＳｏｎｅ，２０１４，９（８）：ｅｌ０３７７１．ＺｈｏｕＪ，ＧｏｌｄｓｂｒｏｕｇｈＰＢ．Ｆｉｍｃｔｉｏ打ａｌｈｏｍｏｌｏｇｓｏｆｆｉｍｇａｌｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉ打ｇｅｎｅｓｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．－ＴｈｅａｎｔＣｅｌｌＯｎｌｉｎ１７５．Ｐｌｅ９９４，６６：８８８４，（）ＺｈｕＰ＂－ｉｔｓＥＡＨＪｏｕａｎｉｎＬｅｔａｌｎｔｈｅｔａＹＬｏｎＳｍ．ＯｖｅｒｅｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｓｅｉｎＩｎｄｉａｎ，，，邱ｇｙ－ｍｕｓｔａｒｄｅｎｈａｎｃｅｓｃａｄｍｉｕｍａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄ：ｔｏｌｅｒａｎｃｅＪ．ＰｌａｎｔＰｈｓｉｏｌｏ１９９９１：７３８０．［］ｙｇｙ，乂１１（）ＺｈｕＹ－ＥＡＡＬＰｉｌｏｎＳｍｉｔＨＴＳｔｌ．ＣａｄｍｉｔｌｌｔｉｉＩｉｔｉｓ，ａｒｕｎ，ｅａｕｍｏｅｒａｎｃｅａｎｄａｃｃｕｍｕａｏｎｎｎｄａｎｍｕｓａｒｄｓ，－ＰｈｅｎｈａｎｃｅｄｂｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｎｌｕｔａｍｌｃｓｔｅｉｎｅｓｎｔｈｅｔａｓｅＪ．Ｐｌａｎｔｙｓｉｏｌｏ１９９９１２１４：ｙｐｇｙｇｙｙｙ，，［］ｇｙ（）１１６９－１１７７．２００７１８７１－１曾乳张玉化王訊荣：６６５６６８．，集矯对水稻种子萌发的影响肌应用生态学化，（）朱被．生常团结．植物金属硫蛋白研究进展（二）植物ＭＴ基因的表达特征及其功能机物技术，通报２００２－５：Ｉ：５．，（）陈吉宝．转ＰＶＰ５ＣＳ１基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应．作物学报赵丽英，毛新国，等，，阴２０１０１１４７－１５３．（）：２００２４＞．太湖流域重金属污染亟待重视内．水资源保护：３９４１．成新，（）邓治，刘向红，覃碧，等．己西橡胶树巧听沿Ｓ基因克隆及表达分析阴．植物生理学报，２０１２，－４８８７２．：７７７８（）一丰郑余阳唐娜等．ＥＤＴＡ强化电动修复王壌铅污染Ｊ．２００８２７２：方，，，［］农业环境科学学报，，（）－６１２６１６．Ｊ郭静成．砸．西，尹顺平对高等植物中谷化甘化过氧化物酶活性及谷化甘肤含量的影响［］北植物４－学报１９９８１８：５３３５３７．，，（）—郭楠田义文从云南曲靖市络污染事件谈起内－．中国环境公益诉讼的实践障碍及，完善措施环境污染与防治２０－１３３５１：％９９，，（）．韩志萍，吕春燕，王趁义，等．箱胁迫对芦竹抗氧化酶活性的影响核农学报，２００８，２２６－：８４６８５０，（）２００９１１３２０９１－２０９４胡宏檐铜污染止壤电动修复研究化环境工程学化．，（）：５４ 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荷花Ｗ巧ＧＣＳ基因克隆、表达及功能验证熊愈辉，杨肖娥．領对植物毒害与植物耐锡机理研究进展［化安徵农业科学，２００６，３４（１巧；－２９６９２９７１．徐明岗．，刘平宋正国，等施Ｊｉｍ污染±壤中重金属行为影响的研究进展［孔农业环境科学学报，，－２００６２５１：３２８３３３．，（）－于晓莉．〇１２１２６．，刘强水体重金属污染及其对人体健康影响的研究化绿色科技，２０１１Ｕ）：３—周启星．重金属ＣｄＺｎ对水稻的复合污染和生态效应ｍ．应用生态学报４４：吴燕玉，１９９，５，（）４３８－４４１．彭方晴－－周青．ＬａＧｌ物对Ｃｄ伤害小白菜的影巧化环境科学，１９９９，２０９１９４．，黄晓华，ｙ配合（化左青，段玉蜜，陈立杰，等．蛋白质亚细胞定位方法在植物病理学研究中的应用化中国植物病理学会２０。年学术年会论文集２０＂．５６ ｍ录附录附录一ＲＮＡ提取方法试剂准备：－无水乙醇，Ｐ琉基古醇，ＲＮａｓｅｆｉｅｅＨ２〇，ＲＮＡ快速提取试剂盒药品。实验揉作：原平惟ＲＮＡ快速提取试剂盒操作步骤；１．取５００ｉ裂解液ＲＬＴ（已经加入护琉基玄醇）于１．５ｍｌ离也管中，再加入５０ｐ叫ＰＬＡＮＴａｉｄ混合均匀备用。２．将５０ｍｇ样品在玻巧研律中用液氮研磨成细粉后，转入上述加有ＲＬＴ和ＰＬＡＮＴａｉｄ的离也管中，立即振荡２０ｓ，使组织充分裂解。－３１２０００ｉ也５…。．将裂解物分钟ｐｍ离，取上清液至新离也管中４一．较精确估升上清液体积，加入上清体积半体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀。，吹打均匀一５．将混合物加入个吸附柱ＲＡ中，吸附柱放入收集管中，１２０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ，奔掉巧液。６．加７００ｉ去蛋白液ＲＷ１，室温放置２ｍｉｎ，１２０００ｉ离也３０ｓ，弃掉滤液。ｐｐｍ一７．加入５００１ＲＷ，１２０００ｉ，离也３〇８，弃掉滤液。＾漂洗液ｐｍ，此步骤重复次８．将吸附柱ＲＡ放回空收集管中１２０００ｉｍ离也２ｍｉｎ，ｐ，尽量去除漂洗液，避免漂洗液中残余酒精影巧下游反应。一９－．去除吸附柱ＲＡ，放入个ＲＮａｓｅｆｒｅｅ离也管中，加入３０５０叫ＲＮａｓｅｆｌｅｅ也０，室温放置２ｍ１ｍｉｎ．ｍｉｎ，１２０００ｒｐ离也５７ 荷花ＡｆｒｉｙＧＣｙ基因克隆、表达及功能验证附录二目的片段的纯化回收（ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ，ＴａＫａＲａ）１．取巧ＨｉＰＣＲ扩増反应液进行琼脂糖凝胶电泳（根据目的片段大小配置凝胶浓度），在恒电压条件下电泳１５ｍｉｎ左右。紫外灯下切下含目的片段的琼脂糖胶块，较精确切取胶块ｉｌ便提高ＤＮＡ回收率。（注：切胶时尽量减少ＤＮＡ暴露在紫外灯下，！＾的时间，避免ＤＮＡ突变损伤）。＝２．把胶块放入１．５ｍｌ离也管中，称量胶块重量，计算胶块体积（ｌｍｇｌ叫）。义向胶块中加入３倍凝胶体积的ＤＲ－Ｉ。Ｂｕｆｅｒ４．均匀海合后，放在７５ｒ烘箱加热融化胶块，间断振荡至胶块充分酷化。５－ｕｆｅｒ／－ｒ．向上述强化液中加入ＤＲＩＢ体积量１２的ＤＲｎＢｕｆｅ，均匀海合。当分离片段小于４００咕时。，应向此溶液中再加入少量的异丙醇６．将试剂盒中的ＳｐｉｎＣｏｈｒａｍ安置于ＣｏＵｅｃｔｉｏｉｉＴｕｂｅ上。７．将上述操作５中的溶液转移至ＳｉｎＣｏｌｕｍｎ中００ｒｍｍｉｎ。弃滤。ｐ，１２０ｐ离也１液（将滤液加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中离也两次，提高回收率）。８．将５００片１的ＲｉｎｓｅＡ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒｐｍ离也３０ｓ，弃滤液。９．将７００ｊｉｌ的ＲｉｎｓｅＢ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒｐｍ离也３０ｓ，弃滤液。１０．重复操作步骤９。１１．将ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于新的１．５ｍｌ离也管上，在ＳｐｉｎＣｏｈｉｍｎ膜的中央处加入巧ｉｌ的ｄｄＨ２０或Ｂｕｆｒ，室温静置１ｍｉｎ。：ＢｕｆｅｒｆＥｌｕｔｉｏｎｅ（法把ｄｄＨ２〇或因地ｏｎ加热至６０Ｃ，有利于提商洗脱率）。１２．１２０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ洗脱。５８ 附录附录ＨＴａＫａＲａｉｎｉＢｅｓｔＤＮＡＦｒａｍｅｎｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ３．０纯化Ｍｇ试剂盒一１．向ｃＤＮＡ第链反应液中加入５倍量的ＢｕｆｅｒＤＣ（如果需加入的ＢｕｆｅｒＤＣ量不足１００叫时应加入１００叫），然后均匀混合。２．将试剂念中的ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上。上述操作１中的溶液转移至ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，室温１２０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ，弃滤液。３．将７００ｊｉｌ的ＢｕｆｅｒＷＢ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，室温１２０００ｗｍ离也３０Ｓ，弃滤一液。此步骤重复次。４ｉ．将ＳｉｎＣｏｌｕｍｎ置于Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｕｂｅ口０００ｒｍｍｎ〇ｐ安Ｔ上，室温ｐ离也１５．将ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于新的１．５ｍｌ的离也管上，在ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ膜的中央处加入３０的灭菌水或ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ，室温静置１ｍｉｎ。６．室温１２０００ｒｐｍ离也１ｎ血洗脱ＤＮＡ。附录四质粒提取方法？１．大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至１４ｍｌ的含有抗生素的°液体培养基中，３７Ｃ过夜培养。＊２．取１４ｍｌ的过夜培养菌液，１２０００ｒｐｍ离也２ｍｉｎ，弃上清。３．用２５０山的ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（含ＲＮａｓｅＡｌ）充分悬浮细菌沉淀。？４．加入２５０ｉ的ＳｏＩＩ５６次Ｈｌｕｔｉｏｎ控轻地上下翻转混合，使菌体充分裂解，形一３ｍ成透明溶液。此步骤时间不宜过长，般不超过ｉｎ。‘？５．加入４００＾Ｕ４Ｃ预冷的Ｓｏ山ｔｉｏｎ田，轻轻上下翻转混合６８次，直至形成现白色凝集块１２０００ｒｍ离也１０ｍｉｎ。，然后室温静置２ｍｉｎ。然后室温ｐ，取上清６．将试剂盒中的ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上。上述操作５的上清液转移至ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ，弃滤液。７．将５００叫的ＲｉｎｓｅＡ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒｐｍ离也３０ｓ，弃滤液。８．将７００ｊｉｌ的ＲｉｎｓｅＢ加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒｐｍ离也３０ｓ，弃滤液。注意确认ＲｓｅＢ一ｉｎ中已经加入了指定体积１００％无水乙醇。此步骤重复次。９．将ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上，１２０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ。１０．将ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于新的１．５ｍｌ的离也管上，在ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ膜的中央处加６０叫的ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ或灭茵蒸馈水，室温静置１ｍｉｎ。将加入的灭菌蒸馈水加热’Ｃ６０使用有利于提高洗脱效率。１１．口０００ｒｐｍ离也１ｍｉｎ洗脱ＤＮＡ。５９ 荷花ＡＴＢＧＣｙ基因克巧、表达及功能验证ｙ附录五质粒ＤＮＡ的金汾包埋及基因枪轰击技术（１）在１．５ｍｌ离也管中加入５ｍｇ＾粉，加入１ｍｌ７０％乙醇，祸旋５ｍｉｎ，静置１５ｍｉｎ；（２）１００００ｒｍ离也５ｍｉｎ，去除上清；ｐｉｎ－（３）加入１ｍｌ无菌水，锅旋１ｍ，离也１ｍｉｎ，去上清，重复步骤３４化金粉预处理完成；（４）在１．５１１１１离也管中加入拭下试剂２０片１金粉，４１质粒，２０２．５ＭＣａＣｌ２（现＾￡叫配现用），ＳｕｌＯ．ｌＭＳＥ精胺。一？－（注：ＤＮＡ浓度控制在ｌｕｇ／叫左右因亚精胺容易降解，般在２０ｒ冰箱中冻存。）（５）冰浴２０ｍｉｎ，间歇祸蔽加入８０ｐｉ无水乙醇，１３０００ｇ离也２０ｓ，去上清；－ｍ离也２０（６）加２０３０ｉ无水己醇，剧烈锅旋，加无水立醇至２００１，１３０００ｒｓ，ｐ片ｐ去上清－３，重复此步骤２次；（７）加８１１无水乙醇重悬后吸至载物片上，使乙醇挥发后进行基因枪轰击洋葱表＾皮细胞；８１６－２４ｈ（）基因枪轰击后暗培养，于巧光体视显微镜下寻找含有炎光信号的细施，然后再在激光共聚焦显微镜拍摄。饼 附录附录六农巧菌感受态制备方法（１）从含５０／ｍｌＲｉｆ的ＹＥＢ平板上挑取农杆菌单菌落，接种于５ｍｌＹＥＢ液体Ｍｇ－培养基（含ＳＯｐｇ／ｍｌＲｉｆ），２００ｒｐｍ，２８Ｃ倒置培养ｌ２ｄ。（２）取２ｍｌ过夜培养菌液接种到ＹＥＢ培养液中，２００ｒｐｍ，２８Ｃ培养至ＯＤ６０００－为．５０．６。（３）农杆菌菌液冰浴３０ｍｉｎ，转移到５０ｍｌ离也管中预先冷却。＂（４）４Ｃ，５０００ｒｐｍ离也１０ｍｉｎ，细菌用２ｍｌ２０ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化巧溶液重新悬－８０浮。将菌液分装至每个离也管２００阵在液氮中速冻１分钟，ｒ保存。附录毛ＤＮＡ提取方法１．，１．５Ｉ。取巧南芥缴叶于玻巧研体中加入ｍｌ提取液，研磨充分２．将研磨充分的混合物转移到１．５ｍｌ离也管，离也１２０００ｉｐｍ，４。５ｍｉｎ。３．倒去上清蔽加入提取液１３００ｐｉ，提取液１１３００＾１，振荡悬浮，牵入５％＋二？换基肌氨酸巧１２０叫，水浴（６５。１０ｍｉｎ）。４．加入氯仿异戊醇（２４：１）６００ｐｉ，振荡抽提１５ｍｉｎ，离也１２０００ｒｐｍ，室温，５ｍｉｎ。５．吸取上清液６００ｐｉ至新的１．５ｍｌ离也管中，加入异丙醇６００阵用手轻轻振荡，ＤＮＡ开始沉淀，静置５ｍｉｎ，离也１２０００ｉｍ，４。５ｍｉｎ。ｐ６－１．倒去上清液，在超净工作台吹干５０％１￡溶解，２〇〇保存。后，加入１１１［ＤＮＡ提取试剂配制：提取液Ｉ（１００ｍｌ）：０．３５Ｍ山梨醇山梨醇６．巧ｇ－０－ｌ．１ＭＴｒｉｓＨＣｌＩＭＴｒｉｓＨＣｌ１０ｍ０．００５ＭＥＤＩＡ０．２５ＭＥＤＴＡ２ｍｌ■－ｌＯｍＭＰ琉基乙醇Ｐ琉基乙醇７０叫加化２〇至１〇〇１１１１提取液ｎ（１００ｍｌ）：Ｔｒｉｓ－ＨＣ－ｌ（０．２Ｍ）ＴｒｉｓＨＣｌ（ＩＭ）２０ｍｌＥＤＴＡ（５ｍＭ）ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）２０ｍｌＮａＣｌ（２．０Ｍ）ＮａＣｌ１１．７ｇＣＴＡＢ（２％）ＣＴＡＢ２．０ｇＰＨ７．５ｗｉｔｈＨＣｌ加姐必至１００ｍｌ５％十二烧基肌気巧钥：５ｇ十二烧基肌気觀＋１００ｍｌ姐２〇６１ 发表论文发表论文－ＧＣＳ的克）荷花Ｙ谷氨巧半脫氨酸合成庚Ｗｗｙ隆及表法分析．（审稿阶段的 致谢致谢本论文在导师悉也指导下完成，衷必感谢刘兆磊教授。转眼间我己完成了Ｓ年了硕±学习生活，。感谢Ｈ年中刘老师对我的淳淳教诲做人做事的道理。对我学习、试验的认真指导。导师严谨的治学态度、敏捷的科研思维、渊博的学术知识、谦逊的人格魅力都深巧地感染着我，令我获益匪浅，终身受用。导师先做人再做事的教导尤在耳畔。在此答辩之际，特向导师表示最崇髙的！敬意和由衷的感谢特别感谢植物园顾春笑师兄对我极大的帮助，从最初实验入手到投稿论文的修改，顾师兄认真指导，关屯实验进展，并给予帮助和建议。感谢陈发様、房伟民、蒋甲福、陈素梅、滕年军、管志勇、张飞、赵爽和廖园等各位老师，恩师们严谨的科研态度和极大的工作热情都感染了我，受益匪浅，感谢老师们Ｈ年里对我的关必和帮助，我才能顺利完成学业。一一感谢菊花实验室这个大家庭，不仅教会了我系列实验技能和专业知识，更营造了个积极、团结、快乐的氛围，让我深感亲切和温馨。感谢王海滨、宋爱萍、高日、董斌、孙海楠，张壞、李样志、李会云、任丽萍、孙静、李佩玲、高妓妓、齐香玉、王银杰、李丕譬、王宏辉、王楚楚、朱巧！、赵瑞霜等师兄师姐们的实验指导和生活上给予的帮助和照顾特别感谢王海滨师兄、高曰师兄、齐香玉师姐、任丽萍师姐、高娇娇师姐在实验上的耐也指导和帮助。感谢李针针、刘凉琴、张乃元、谭素娥、刘亚楠、种昕冉、盛丽萍、吴丹、程培蕾、曹沛沛、王凯能、费江松、赵楠、一封统等师弟师妹们共同陪伴的欢乐实验过程，你们的到来给实验室这个大家庭注入了新的活力。感谢金诗媛、卢媛、施晓梦、施旭丽、何臻、张晓雪、刘晨、郑晨、王萃钻、展妍丽、开玉莖、陈晓婷，张婷、许冰冰、陈攀红、张兆和等同届同学和舍友黄谣巧、王凡、陈丹丹在实验和一生活中给予的帮助和支持，特别感谢张婷，起、刘晨、张晓雪、王凡对我实验的特别帮助我们努力奋斗的日子将成为我最美好的回忆。感谢艺莲苑Ｔ跃生老师在荷花种桂方面给予指导和帮助，锁石村菊花基地的各位叔叔阿姨，感谢你们在实验过程中给我的帮助。一最后深深的感谢我最亲爱的家人，感谢你们直Ｗ来对我的支持、理解Ｗ及关也，是你们给！予我物质上和精神上的支持，从而给我无限的力量和勇气，这是我最大的人生财富，谢谢你们在我求学路上，，我很感激，很幸福这么多人帮助我、关也我。张阿慧２０１５年５月于南京农业大学．６５
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