茶树4cl基因的克隆及功能验证

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1、独创性声明本人声巧所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究＇工作及取。据我所知，论得的研究成果，除了文中特别加臥标注和致谢的地方外文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得安徽一农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明满的说明并表示谢意。学位论文作者签名；寺爾爾签字曰期：兴护丰＾月０曰／学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，，有权保留并向国家有关部口或机构送交论义的复印件和电子

2、文件允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可将学位论文的全部＾、或部分内容编入有关数据库进行检索，可１＾１采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。：学位论文作者签名；古爾爾指导教师签名签字曰期：：＞狂年右月Ｃ旧签字曰期妙狂年＾月｜０与／：学位论文作者毕业后去向工作单位：电话：：通信地址：邮编；＊摘要在植物体内，苯丙烷代谢是一条重要的次生代谢途径，涉及到木质素、黄酮类化合物以及花青素等多种代谢产物的生物合成。4香豆酸辅酶A连接酶（4CL）处于苯丙烷

3、代谢途径与木质素合成以及类黄酮途径结合的分支点上，对植物次生代谢产物的生物合成具有重要的调控作用。本研究克隆了2条茶树4CL基因（Cs4CL）；利用原核表达技术、HPLC和UPLC-MS鉴定技术以及紫外分光光度检测技术，验证了融合蛋白Cs4CL的功能；构建Cs4CL植物过表达载体，转化了烟草和拟南芥。主要研究结果如下：1．从NCBI和安徽农业大学茶树转录组中筛选出两条Cs4CL基因的EST序列，利用分子生物学技术，克隆得到茶树两条Cs4CL基因。利用DNAMAN软件对氨基酸序列进行分析，发现Cs4CL1和Cs4CL2的氨基酸一致性为62.63%，它们都具

4、有植物4CL蛋白高度保守的基序BoxI和BoxII。对其进行进化分析，发现两条Cs4CL基因分别属于两个不同的亚组。2.利用原核表达体系，对Cs4CL1和Cs4CL2进行了原核表达。构建了petSUMO-Cs4CL1和petSUMO-Cs4CL2重组质粒，转化Escherichiacoli.BL21表达菌株。诱导表达后，对Cs4CL1与Cs4CL2融合蛋白进行了分离纯化，得到重组蛋白。利用HPLC及UPLC-MS检测技术，对Cs4CL1与Cs4CL2融合蛋白进行酶活检测及产物鉴定，发现两种重组蛋白均具有催化活性。3．利用紫外分光光度检测技术，研究了Cs4

5、CL1与Cs4CL2重组蛋白的最适反应温度和最适反应pH，酶的稳定特征，以及底物特异性。结果表明：Cs4CL1的最适反应pH为6.5，最适温度为50℃；最适稳定温度为0℃，pH为7.0；最适底物为咖啡酸。Cs4CL2最适反应pH为7.5，最适温度为50℃；最适稳定温度为-20℃，pH为6.0；最适底物为香豆酸。4．构建了植物过表达载体pCB2004-Cs4CL1和pCB2004-Cs4CL2，对其进行烟草的遗传转化。同时构建过表达载体pGWB5-Cs4CL1和pGWB5-Cs4CL2，进行拟南芥的遗传转化，PCR验证结果显示，目的基因Cs4CL1以及Cs

6、4CL2均已成功转入烟草和拟南芥中。关键词:茶树，4CL，原核表达，遗传转化，功能分析AbstractPhenylpropanoidmetabolicpathwayisanimportantsecondarymetabolicpathwayinplant,whichinvolvedinthebiosynthesisoflignin,flavonoidsandanthocyanins.P-coumaricacidcoenzymeAligase(4CL)isthelastenzymeofphenylpropanoidpathwaywhichlocatedin

7、thebranchofthephenylpropanoidpathway,ligninproductionandflavonoidspathway.Itplaysanimportantroleinthesecondarymetabolitespathwayinplant.Inthispaper,weclonedtwo4CLgenesinteaplant(Cs4CL);throughprokaryoticexpressiontechnique,HPLCtechnology,UPLC-MStechnologyandspectrophotometricassa

8、ys,weidentifiedthefunctionofHfusionHHpro