大豆GmFLC基因的克隆与功能验证.pdf

《大豆GmFLC基因的克隆与功能验证.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

摘要大豆(Glycinemax)是～年生豆科植物，是世界上最重要的豆类。开花是植物由营养生长向生殖生长转型的最重要的一个过程，在合适的时间完成这个转型是植物实现生殖发育所必需的。通过对开花时间的调控，植物才能实现种问同步杂交并产生尽可能多的种子，这是植物在长期进化过程中形成的对环境条件的一种适应。本实验利用分子生物学手段对大豆GIycinemaxFLC基因进行了克隆并对其功能进行了初步验证，对大豆开花过程中相关基因的调控机理有了初步的认识。并对GmFLC基因在大豆开花过程的作用有了一定的了解。通过初步的实验，利用基因克隆技术从自贡冬豆和黑河27中克隆得到了一个MADS．box样基因，该基因与拟南芥FLC基因的N端具有很高的同源性，推测其可能为大豆GmFLC基因。通过对比自贡冬豆和黑河27中GmFLC的序列发现，其CDS序列存在一个同义突变，两者所编码的蛋白序列完全一致。进一步的qRT-PCR结果表明，GmFLC主要在叶片中表达，当短日处理时，随着发育过程其在叶片中的表达逐渐降低，并且在花中有一定表达。光周期实验表明，GmFLC表达不受光节律调控，但是其表达会受到光周期长短的影响：短日下受到抑制，长日照下被促进。综上所述，使用常规克隆方法得到了～个MADS．box基因，该基因可能参与大豆生长发育的调节，并可能参与 大豆花的发育。这一基因与拟南芥FLC基因在表达模式和调节方式上可能不同。通过生物信息学和分子生物学的方法，找出大豆的懈C基因，对其进行研究，这对深入了解大豆的开花和春化作用的机理和过程有着重要的作用，对未来大豆的农业生产也有很大的指导意义。关键词大豆，GmFLC，克隆 ABSTRACTSoybean(Glycinemax)，theangiospermDicotyledon，beanmesh，Leguminosae，Papilionoideae，soybeanspecies．KnownasShUinancientChina，isaseedofplantsrichinprotein．Soybeanisallannualleguminousplant，itsseeds，alsokalownassoybean．Soybeanisthemostimportantlegumesintheworld．SoybeanoriginatedinChina，iswidelyregardedastheodginalongtheYunnan—GuizhoUPlateau．SomebotanistsconsideredtobeofChineseoriginwusulisoybeanderived．Floweringisthemostimportamofaprocessplanttransitionfromvegetativegrowthtoreproductivegrowth．Throughtheregulationoffloweringtime，plantscanachievesynchronizationinterspecifichybridizationandproduceasmuchaspossibletheseedsofplantsinthelongprocessofevoltltionofanadaptationtoenvironmentalconditions．InthisstudY，bymeansofmolecularbiologyofsoybeanGmFLCgenewasclonedanditsfunctionwasperformedtoconfirmapreliminaryunderstandingofthegeneregulationmechanismintheprocessofsoybeanflowering．AndGmFLCgeneofsoybeanfloweringprocesshaveacertainunderstanding．Throughpreliminaryexperiments，clonedfromtheZigongwinterbeansandHeihe27，aMADS—box—likegene，thegenewiththeN—terminaloftheArabidopsisFLCgenewithhighhomology，suggestingthatitmay forsoybeanGmFLCgene．BythecontrastZigongdongdoubeansandHeihe27GmFLCsequenceCDSsequenceofasynonymousnmtation，andtheencodedproteinsequenceisexactlythesame．FurtherqRT—PCRresultsshowthat：GmFLCexpressionintheleaves，whentheshortdaytreatment，withtheexpressionofdevelopmentalprocessesintlheleavesgraduallyreduced，andacertainexpressioninflowers．Photoperiodexpez’imentsShowGmFLCnotsubjecttotheregulationoflightrhythm，butitsexpressionwillbetheimpactofthelengthofthephotoperiod：shortKusakabewasinhibited，longdaywaspromoted．tnsummary,weclonedaMADS—boxgenes，thegenesmaybeinvolvedinregulationofsoybeangrowthanddevelopment，andmaybeinvolvedinthedevelopmentofSOybeanflowers．BioinformaticsandmolecularbiologymethodStoidentifysoybeanGmFLCgene，tostudyit，thisin—depthunderstandingofsoybeanfloweringandthemechanismandprocessofvernalizationhasanimportantrole，thefutureagriculturalproductionandofsoybeangreatguidingsignificance．KEY1WORDSsoybean，GmFLC，eloningV 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III第一章综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1第一节植物开花过程的调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1一、春化作用途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1二、光周期途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2三、自主开花途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2四、赤霉素途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2第二节FLC的分子特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3一、FLC的分子结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3二、MADS盒基因的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3第三节FLC抑制成花的分子机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4一、FLC与FRI协同作用抑制成花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4二、FLC抑制成花的条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4第四节凡C的调控和影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5一、FRI对FLC的正调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5二、春化作用对FLC的负调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5三、FLC的调控与赤霉素的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5四、FLC与甲基化的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5第五节光周期途径机制与研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6一、光周期反应类型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6二、光周期调控的模型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7三、长短日植物光周期反应的区别⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7四、水稻和拟南芥光周期控制开花反应元件的保守性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8五、水稻对日长的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8第六节大豆光周期调节研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9一、开花逆转现象为大豆光周期研究提供了良好材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10二、大豆光周期调控开花研究的意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll第七节选题意义及研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12一、论文选题意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12二、研究内容及技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第二章材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15第一节材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15一、植物材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15二、菌株及质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15三、酶及生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l5四、PCR引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15第二节实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17 一、DNA的提取(CTAB法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17二、DNA片段的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18三、T载体与目的基因的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，I9四、大肠杆菌感受态细胞转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20五、启动子序列的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20六、RealTimePCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，24七、鼢队的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26八、反转录合成cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26九、载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28十、GmFLC及质粒的酶切⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31十一、原核诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33十二、SDS—urea．PAGE及蛋白免疫印迹分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33第三章实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第一节Gm兕C生物信息学检索及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第二节自贡冬豆与黑河27中GmFLCDNA的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一35第三节自贡冬豆与黑河27中GmFLCcDNA的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42第四节GmFLC启动子序列的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44第五节GmFLC表达的组织模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47第六节GmFLC在大豆发育不同时期的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49第七节G聊兕C表达的昼夜节律现象⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50第八节GmFLC在长短日处理下表达的规律⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51第九节GmFLC原核表达载体的构建及原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53第十节GmFLC真核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54第四章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．56第五章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。60致谢⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．66中央民族：大学研究生学位论文作者声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67 第一章综述第一节植物开花过程的调控植物由营养生长转型为生殖生长中最重要的过程就是开花，植物实现生殖发育的一个必须条件就是在合适的时间完成这个转型。通过对植物开花时间的调控，才能实现植物种间同步杂交，并尽可能多的产生种子，这是植物在长期进化的过程中所形成的一种对环境条件的适应。近几年来，通过研究模式植物拟南芥，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的了解逐步深入。研究发现，拟南芥是通过多个不同的遗传位点来实现对开花时间的调控的[2J。目前对其开花时间的研究主要集中于筛选开花时间改变的突变体及这些突变基因的克隆和功能研究[2]。根据开花突变体在不同环境条件下(主要指光照、温度)的表型和遗传上位性实验，通常将晚花突变体分为四条开花促进途径：春化作用途径、光周期途径、自主开花途径和依赖于赤霉素的途径【1】。一、春化作用途径温度是影响植物开花的一个重要的环境因素。冬性和2年生植物开花必须经过一段时问的低温诱导。如果这些植物不经低温处理，则开花过程可以推迟几周甚至几个月。低温对开花的促进作用称为春化作用【2】。目前，与春化相关的基因研究较多的植物是十字花科的拟南芥和禾本科的小麦、大麦等。在拟南芥中，删、FLC、VRNl、VRN2和VIN3等基因与春化作用有关【3J。研究表明，冬性发育特性的拟南芥由单基因脚控制【4J，如果其编码的盘绕蛋白发生突变则可导致拟南芥过早开花。FLC属于MADS盒基因【5J。它编码的蛋白转录因子是一个强的开花抑制因子，其高水平表达对开花具抑制作用。显性等位基因FRI的存在会加强FLC对开花的抑制作用。低温春化通过F脚转录及蛋白表达水平的负调控，抑制FLC的表达，促进植物开花[6J。研究发现，在拟南芥中VRNl、VRN2和VRN3也参与拟 南芥的春化作用【刀。二、光周期途径植物生长发育的一个重要条件是光。植物的整个生长发育都需要在光周期调控影响下完成。拟南芥是一个典型的长日照植物，在长日照条件下促进开花，短日照条件下抑制开花。拟南芥光周期途径是由光受体感受光信号开始的。迄今为止，在拟南芥中共发现了5类光敏色素PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE和3种隐花色素CRYl、CRY2和CRY3E31。光敏色素感受红光和远红光，隐花色素感受蓝光和紫外光。它们感受昼夜长短和光的强弱并产生昼夜节律[81。其中，远红光、蓝光通过PHYA、CRYl和CRY2促进开花，红光通过PHYB、PHYD和PHYE抑制开花[9，101。三、自主开花途径与春化作用途径一样，自主途径也是通过抑制FLC基因的表达来促进开花的。在拟南芥中，相继克隆到FCA、刀、FLD、FPA、，陋、LD和FLK7个基因。拟南芥开花时间调控中，FCA、FPA、FLK和F】，基因都编码RNA结合蛋白，它们对FLC前体mRNA的调节和稳定性在开花控制中是非常关键的，属于转录后调节【ll】O四、赤霉素途径对于拟南芥，GA对其开花有促进作用。它能加速短日照条件下的野生型拟南芥和长日照下的归、fac、fd、fe、CO、fpa、^tfve和fwa等晚花突变体开花[12]。在GA途径中，存在三个序列和功能上都非常相似的关键基因：GAI、RGA和RGLl[”】。研究表明，GA生物合成途径突变体可能就是由于GA合成途径的打断而减少了对GAI、RGA和RGLl的抑制作用，最终导致晚花。这说明GA合成途径最终会作用于GAI、RGA和RGLl基因，从而影响开花【l21。目前研究认为，GA启动开花的分子机理是激活花分生组织特异基因三Fy的启动子，加强凹y的转录活性，从而启动开花【13】。 第二节FLC的分子特征一、FLC的分子结构FLC属于MADS盒基因，它编码的蛋白属于MADS盒转录调节蛋白，其蛋自转录因子对拟南芥成花具有抑制作用，FLC通过对来自FRI自主成花途径和春化途径中信号的反应在拟南芥成花中起关键作用11副。现已分离到FLC抑制开花途径中的2个下游组成元件SOCI(以前称为AGL20)和Fr，SOCI茎顶端激活花分生组织确定基因LFY转录盒的一部分，有调控花器官发育的作用，编码一个含MADS区域的转录因子，Fr则激活除凹y外的其它基因，作用于各种调控途径的下游，编码一个与Raf激酶抑制蛋白相类似的蛋白，它们的表达产物是2个促进开花的因子，FLC通过抑制它们的表达，对开花具抑制作用【J4】。二、MADS盒基因的作用模式植物拟南芥MADS盒基因结构、功能及作用机制对研究园艺植物MADS盒基因具有重要的理论指导意义。研究表明，在植物成花转变过程中，植物的MADS盒基因网络起着非常关键的作用，植物依靠此基因网络调节自身的发育转化【15，161。“MADS”是由酵母细胞型特异基因的调节因子MCMl，酵母精氨酸代谢调节蛋白Ar980和拟南芥AG蛋白，金鱼草DEFA蛋白以及人血清应答因子SRF的基因首字母缩写而成【17】。序列分析显示它们编码的蛋白产物有一段长约56～58bp的高度同源结构域，因此这段同源区被称为“MADS—box”或“MADS—domain”，编码含有MADS盒蛋白的基因称为MBG[14】。多数MBG的启动子含有1个或多个CArG-box元件，其共通序列为CC(A／T)6GG，是含有MADS盒蛋白因子的结合位点。MADS盒的N端为亲水区，富含碱性氨基酸；C端高度疏水‘憾~211。在拟南芥、金鱼草中已发现十几种带有“MADS盒”的蛋白，它们由各自独立的基因编码，且大多数只在或主要在花器官组织中表达，以二聚体的状态执行功 能四231。“MADS盒，，基因在其它植物中也广泛存在，如番茄的TAG／、TM5，玉米的ZAGl、ZAPl，矮牵牛的四P_f、pMADSl、pMADS2、pMADS3、pMADS4，烟草NFLl、NFL2[19】。这些“MADS盒’’基因序列同源性很高，但多数基因的功能还不清楚。MADS盒基因是一类调节因子，其特异的分子结构决定了特异的功能，编码的转录因子参与植物生长发育的许多环节‘241。第三节FLC抑制成花的分子机制一、FLC与FRI协同作用抑制成花对拟南芥晚花生态型和早花生态型的研究，确定了2个决定开花的主要位点：位于4号染色体的FRI(FRIDIDA)和位于5号染色体的FLC，这2个基因中的显性等位基因协同增效作用造成晚花，且FRI、FLC表达的控制是正面的。F心编码的蛋白具有卷曲螺旋区，该区可能参与蛋白之间的互作，可使FLC的mRNA丰度增加，转录水平升高，使开花推迟[25|。当FR／。缺失时，FLC的表达水平很低，植物呈现早花表型。当FRI有活性时，FLC的转录水平高且稳定，植物呈晚花表型。拟南芥野生型Col和Wassilewskija等夏生1年生单系丧失了FRI的功能，几乎检测不到FLC的表达，当与功能正常的脚等位基因(FRI-SF2)杂交后，其杂交后代不仅恢复职，功能，还检测到FLC的高水平表达，并引起成花延迟，充分说明职，的功能表达依从于兕CI[23】。二、FLC搠|韦0成花的条件FLC达到阻止开花的表达量需要2个条件：一个是脚基因的表达；一个是自主通路(alnonomous．pamway)中某个基因的突变[26】。当2个条件都满足时，其基因转录的起始位点5’端附近的H3组蛋白的K4位氨基酸被三甲基化，此时，染色体对HPl(对基因表达起抑制作用)等蛋白的结合具有排斥性㈣，FLC所处染色体处于活化状态【291。4 第四节FLC的调控和影响因素一、F肼对FLC的正调控对拟南芥自然生态型的基因分析表明：FLC受删的正调控。在低温需求型晚花生态型中FLC和职，都为显性基因，而在早花生态型中这2个基因至少有1个为隐性基因，当职，缺失时(聊无效等位基因)【551，FLC的表达水平很低，植物呈现早花表型，当删有活性时，FLC的转录水平高且稳定，植物呈晚花表型。二、春化作用对FLC的负调控低温对开花的促进作用称为春化作用，即通过适当长度和强度的冷处理诱导开花抑制蛋白基因沉默，从而使植物具备开花能力【311。对于多年生、2年生或者是冬季1年生植物而言，在不适当的季节开花将是一种灾难，需要通过春化作用来防止这种灾难的发生。拟南芥经春化处理4～8天后提早开花，否则开花很谢30J。FLC和删基因在春化过程中起主要作用，FLC编码一种开花抑制因子，抑制拟南芥开花，且抑制程度与其剂量成jE比，春化后FLC的mRNA丰度降低，从而使开花提前【56|。三、FLC的调控与赤霉素的作用GA在拟南芥中是重要的开花引发物，对FLC的表达水平无显著影响，但FLC持续过量表达植株的表现型与弱化GA活性的植株表现一致【35]。晚花突变体FLC-11与野生型和其它晚花突变体相比，对施加外源GA的反应较弱。这说明GA可能在FLC的下游起作用，FLC可能通过调控GA生物合成或信号传导而阻断茎尖的GA活性，从而减弱对开花的促进作用[57]。四、FLC与甲基化的关系去甲基化通常与基因表达的活性有关，而非仅仅与负调控有关‘3¨。这样，FLC的负调控表明甲基化可能阻断了FLC抑制因子的表达，或者可能将1个抑制子结合于FLC启动子上【581。H3K9和H3K27组蛋白去乙酰化和甲基化与FLC的抑制相关，相反H3K4与H3K36的甲基化能激活FLC的表达，但是有关植物组蛋白精氨 酸甲基化的研究报道较少。春化的作用在于通过甲基化水平的变化改变关键基因的表达，如导入了甲基转移酶基Eq(METI)反义结构的拟南芥，其甲基化水平明显降低，相对于野生型，基因组只有15％被甲基化，且FLC表达量减少，从而呈现早花现象【32】。第五节光周期途径机制与研究进展光周期途径是植物开花调控中最为重要的途径，在过去的研究中，针对光周期途径的研究也非常之多。成果显著【36]。一、光周期反应类型不同的植物开花对光的要求不同，根据各种植物对光周期的反应，可将其划分为三种类型。在昼夜周期中，日照长度短于某一特定临界值时才能开花的植物称为短日照植物。短曰照植物的开花季一般都在秋季，如果适当的缩短日照时间而延长黑暗时间即可促进短日照植物提前开花。相反，如果延长日照时间则会产生影响导致延迟开花或者不开花。常见的短日照植物有大豆、菊花、水稻、美洲烟草、苍耳笙寸0在昼夜周期中，日照长度长于于某一特定临界值时才能开花的植物称为长日照植物。长日照植物的开花季一般在春季，如果适当的延长日照时间而缩短黑暗时间可促进长目照植物提前开花。相反，如果缩短日照时间则会产生影响导致延迟开花或者不开花。常见的长日照植物有大麦、小麦、拟南芥等。任何日照条件下都能开花的植物被称作日中性植物。这类植物的开花对于日照长度的要求范围很广，只要达到合适的温度，在一年四季中都能开花。常见的日中性植物有黄瓜、番茄等。6 二、光周期调控的模型近几年来，随着拟南芥全基因组序列测定的完成以及大规模拟南芥、水稻等突变体的创制，被鉴定的开花突变体越来越多[411，为光周期调控开花的研究提供了很好的材料。特别是光周期途径中起重要作用的基因相继被克隆后，使这个复杂的网络状信号传导途径被逐步揭开。光周期如何调控长日和短日植物对相同的日长做出相反的反应，即日长是如何调控开花的，目前主要有两个模型，即外部同步模型和内部同步模型【59。60】。外部同步模型：Biinning首先提出植物开花的光周期反应与植物体内的生物钟反应相关的模型[451。植物的生物钟(Circadianclock)反应是指植物体内的一种以近似24h为单位的昼夜生理节奏变化。这种模型认为，植物的生物钟反应控制着植物的开花，且这种生物钟反应的某一特定时段对光照敏感。因此，在对光照敏感的特定时段，当植物生长在光照条件下时，长日植物的开花将被诱导，而短日植物的开花则会被抑制。这种模式被Pittendri曲和Millis【46]称为外部一致模式，其实质就是植物将光信号和生物钟信号结合起来识别曰照长短，从而控制开花时耐471。内部同步模型：与外部一致模式相对应的另一种控制植物开花的模型。这种模型认为，当植物体内两种或多种生物钟反应中对光照敏感的特定时段同时处于能促进植物开花的光照条件下时，就会诱导植物开花；反之，植物的开花则会被抑制。三、长短日植物光周期反应的区别光周期对多种植物开花都具有调控作用，目前对长日植物拟南芥的光周期调控开花的分子机制研究地较为清楚。其调控机制在其他对光周期反应不同的植物中是否保守对研究光周期如何调控长日和短日植物对相同的日长做出相反的反应具有重要的价值。目前，在许多植物中分离克隆到了拟南芥光周期关键基因CO矛IJFT的同源基因，一定程度上说明了光周期元件在不同反应类型植物中是保守的【401。尤其是近来对短日植物水稻的分子生物学研究以及其全基因组测序的完成有利于比较短日植物与长日植物开花的光周期调控机制。7 四、水稻和拟南芥光周期控制开花反应元件的保守性水稻(Oryzasativa)和拟南芥开花的光周期反应元件具有很强的相似型。研究发现，从水稻中分离的控制开花的基因Hdl、Hd3a和Hd6分别编码与拟南芥光周期控制开花时间的基因CO、FT和酪蛋白激酶2Q亚基(CK2a)很相似刚。另外，水稻中的开花时间基因Se5编码光敏色素生色团生物合成的血红素加氧酶，与拟南芥HYl具有70％的同源性。水稻中GI的同源基因OsGI在se5突变株中mRNA丰度改变，而ftOsGI表达水平增加或减少的转基因植株的开花行为也展示了OsGI调控开花的日长反应。OsGI控制开花时间可能是由Hdl介导的，或许通过和拟南芥相似的机制|：48】。这些都表明，拟南芥与水稻中光周期控制开花时问的基因网络组分在水稻中是高度保守的，这两个物种可能存在相似的潜在机制。五、水稻对曰长的测定过表达眉如a基因的转基因水稻显示明显的早花表型，说明Hd3a与拟南芥FT的功能相似，都是开花促进因子[501。但是，Hd3a的表达尤其在短日条件下被诱导，而，堤在长日条件下被诱导的，所以参与水稻和拟南芥中光周期途径的基因对Hd3a和，州|勺控制相反。在Hdl功能缺失的水稻基因系或突变体sel中，长日照下的Hd3a转录本上调表现为早开花，短日照下的Hd3a转录本下调表现为晚开花，这说明删在控制开花时间中有两个独立的相反的功能【37I，同时也说明Hd3a在长、短日条件下都是水稻开花的调控基因。水稻在长、短日条件下开花的差异可能是长、短日照下Hdl所起的作用不同所决定的。基于外部同步模型的假设解释水稻测定日长调控开花的机制，在长日时Hdl在光周期反应节律的敏感时期，白天中间至结束时高水平的表达和暴露于光下的同步性可能：产生了阻ILHd3a转录的信号从而抑制开花【511。在长日照条件下的白天，因光激活光敏色素的活性使Hdl呈现抑制Hd3a的功能；在短日照条件下，HdlmRNA只在晚上表达，此时光敏色素的活性降低使得Hdl成为Hd3a的激活因子，因此Hd3a在夜间较后时期表达从而促进开花【521。Hayama和Coupland在2004年提出了水稻测量时长的模型：Hdl依赖于日长，在长日条件下，光敏色素修饰的Hdl抑制激活Hd3a的转录因子，进而抑制了开花促进8 因子Hd3a的表达，从而抑制了开花[53】；在短日时，Hdl在不存在光敏色素活性的夜间高度表达，增加THd3a的转录因子活性，促进Hd3a的表达，因而促进开花。但是水稻和拟南芥如何以不同的方式调控Hd3a／FT的关键分子机制还不很清楚，仍需要进一步的研究。第六节大豆光周期调节研究进展大豆(Glycinemax)，英文名称是soybean。是被子植物门，双子叶植物纲，豆目，豆科，蝶形花亚科，大豆属植物。在我国古代称为菽，是一种其种子含有丰富的蛋白质的植物。大豆是一年生豆科植物，其种子也称大豆。是世界上最重要的豆类。大豆起源于中国，被广泛认为原产地是云贵高原一带。也有部分植物学家认为是由原产中国的乌苏里大豆衍生而来的。大豆最常用来做各种豆制品、压榨豆油、炼制酱油以及提炼蛋白质等。豆渣活磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料。而在我国已经有几千年历史的豆腐、豆浆等食品也是由大豆作为原材料制成的。可以说，大豆有非常广泛的用途和重要的价值。在我国，大豆广泛的种植于东北平原、黄淮平原、长江三角洲和江汉平原等地。是种植范围较广的非常重要的经济作物之一。自$)、Garner和A11ard发现植物光周期现象并确定大豆是短日照作物后【37'3引，在研究植物光周期现象时，常以大豆为短日照植物的试验材料。然而，目前对大豆光周期调控的分子基础的研究仍然少见报道。孙洪波等‘431从大豆中克隆了一个PEBP家族基因GmBFT，并研究了它在光周期敏感品种自贡冬豆成花诱导的中的表达，结果表明GmBFT的表达受到光周期的调控，长短日条件下，G埘BF赃叶片中均有表达，但在短日条件下的表达高于长日条件下。而在SAM中，短日条件下G聊胛躏着ZGDD的发育进程表达增强，在长日条件下G聊卯环表达(39]，这与长日条件下ZGDD顶端只产生叶片的生理现象相关m4¨，说明Gm胛阿能在花的诱导和顶端分生组织分化中起到作用。对大豆光周期相关基因的克隆与表达的研 究有利于加深对大豆光周期反应机制的认识。一、开花逆转现象为大豆光周期研究提供了良好材料开花逆转又称成花逆转，是指已经开始花芽分化的分生组织，在一定的条件下重新转向叶片分化的现象【42，431。Battev幂HLyndon['411将植物的开花逆转分为花逆转(flowerreversion)和花序逆转(inflorescencereversion)两类【421。另外，韩天富等㈤提出植物开花逆转的整株逆转(wh01e．plantreversion)类型，即指已经开花的植株，原有花果大量脱落，恢复到旺盛的营养生长状态。值得注意的是，如果开花逆转的植株移到诱导条件下，植物可以重新开花[431。开花逆转现象的发生，说明分生组织的活动方式不仅可以从营养生长状态转向生殖发育状态，而且可以从生殖发育状态逆转回营养生长状态。同时，大豆的开花逆转现象进一步说明短日照对大豆的花芽分化和开花十分重要。同时也证明，在出苗至第一三出复叶展开这一以往被认为对光周期不敏感的幼年期也存在明显的光周期反应，从而将光周期调控大豆发育的时期从开花诱导期扩展到幼苗期和开花以后，支持大豆的光周期反应存在与出苗至成熟全过程的观点【441。开花逆转现象，为植物发育研究提供了良好材料。韩天富等以自贡冬豆纯系为材料，初步建立了大豆光周期反应机制研究的实验材料系统[431，可同时比较短日(开花)、长日(不开花)、短日转至长曰(开花逆转)三种状态的生理差异，更准确地识别由光周期诱导产生的生理生化和分子生物学变化。利用这一实验系统，吴存祥等研究了一个MADS．,box家族成员GmNMH7基因在“诱导．非诱导．逆转”的实验系统中的表达模式【4¨，结果发现，在短日照条件下，自贡二冬豆植株可在较短时间内完成开花诱导、正常开花和结实。GmNMH7；)基因在可观察到的花芽分化出现之前即开始在大豆顶端分生组织中表达，其表达时间贯穿成花诱导、花芽分化、花器官发育及种子形成的全过程。在长目照条件下，植株持续进行营养生长，没有任何形式的花器官出现，GmNMH7基因在顶端分生组织中一直不表达。在短日照13天转至长日照的逆转条件下，出现开花逆转[491。在出现开花逆转的植株中，GmNMH7；基．因的表达可随长日处理日数的增加和营养器官的出现而减弱。当顶端分生组织完全恢复叶片分化时，G聊脚7基因的表达停止。在出现短花序的植株中，GmNMHl7基因一直表达，但表达量低于持续短日处理，GmNMH7可能在大豆 中发挥着分生组织特异基因的功能【41】。说明利用这～系统在研究大豆光周期反应和个体发育中具有重要的应用价值。二、大豆光周期调控开花研究的意义大豆是典型的短日植物，是植物光周期反应研究的传统模式植物。关于植物光周期反应的许多早期成果都是以大豆为材料获得的(3¨。与水稻、玉米(Zeamay．y)等短日作物相比，大豆的光周期反应更加敏感，品种问差异更大。对于光周期反应敏感的晚熟大豆品种来说，短目照不仅是成花诱导的必要条件，而且影响开花、结荚和鼓粒。一旦光周期条件不适，这些品种的生殖生长就会延迟，甚至可从生殖生长状态逆转到营养生长状态[42，4弭。这种反应方式显然有别于拟南芥、水稻等模式植物。在这些植物中，叶片经一定曰数光周期诱导后即可保证植株完成生殖生长。目前对于光周期调控植物开花分子机理的研究主要集中在拟南芥和水稻中。由于拟南芥属于长日植物而水稻是单子叶植物，二者机制的差别不能揭示长日与短日机制的真正差别。而大豆是严格的短目植物，同时又是双子叶植物，大豆光周期机制的研究将印证长日与短日、单子叶与双子叶的真正异同之处，能进～步完善植物光周期反应机制的理论体系。在不同地区的日长条件下，光周期反应敏感品种的开花期、成熟期和其它性状会发生较大的改变。造成生育期不适，影响产量潜力的发挥；在同一地区光温条件下不同来源的品种光周期反应敏感性差异较大，致使花期不遇，相互杂交较为困难，难以大量利用异源种质资源，导致育成品种遗传基础狭窄，优良基因聚合缓慢，限制大豆产量的大幅度提高。生产上主栽品种大多数是光周期反应敏感的品种，这种特性严重阻碍了大豆的南北引种和杂交育种工作的展开。我国幅员辽阔，南北纬度相差42。。在作物生长季节里，北方比南方春夏长日照来得早，夏秋短日照来得晚，北方比南方有更长的日照时数。在原产地不同的光照条件下长期驯化形成了南北品种不同的光周期特性，北方品种临界昼长比南方品种长。北方大豆品种向南引种时生育期缩短，开花提前；南方品种北引时开花推后，生育期延长。这些特性给大豆的远距离引种和优良品种的全国性推广带来巨大困难。同时，其它作物特别是禾谷类作物遗传改良的实践说明，光周期反应敏感性的降 低是育成品种适应性和产量性状改善的主要原因之一。在小麦中，光周期不敏感基因是对产量贡献最大的三种基因之一，其重要性不亚于抗锈基因和矮秆基因。在大豆中，光周期反应敏感性的降低也是实现适应性和丰产性改良的突破点。因此，培育对光周期不敏感的大豆基因型对于广适应性育种具有重要意义，一直以来也是大豆育种工作的重要目标。通过常规育种方法培育大豆品种虽有很大的成效，但在光周期反应敏感性改良方面进展较为缓慢，目前迫切需要利用分子育种的手段，通过对外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，定向调节大豆品种的光周期反应敏感性，加快广适应品种的选育过程。因此，了解大豆光周期反应的分子机制不仅可以完善植物光周期反应机制的理论体系，更有利于培育广适应的大豆品种，实现大豆广适应性和丰产性的突破。第七节选题意义及研究方法论文选题意义随着分子生物学的发展以及对模式植物拟南芥研究的全面深入，发现了一个对拟南芥开花有重要调控作用的基因——F乙C基因。FLC是拟南芥的开花抑制因子，编码一种新的MADS盒蛋白，能够下调开花促进因子FT的表达而抑制拟南芥开花。同时，FLC基因还涉及春化反应。然而，大豆中有关开花抑制因子的研究鲜有报道。大豆是：典型的短日植物，在光周期反应的早期研究中被当作模式植物。与水稻、玉米等短日植物相比，大豆的光周期反应更加敏感，品种闻的差异更大，单个品种的适应性狭窄一直是大豆育种工作开展的绊脚石。对于光周期反应敏感的晚熟大豆品种来说，短曰照不仅是成花诱导的必要条件，而且影响开花、结荚和鼓粒。～旦：七周期条件不适，这些品种的生殖生长就会延迟，甚至可从生殖生长状态逆转到营养生长状态‘41’431。这种反应方式显然有别于拟南芥、水稻等模式植物。目前对于光周期调控开花的研究主要集中在长曰双子叶植物拟南芥和短日 单子叶植物水稻中，对短日双子叶植物大豆的光周期调控机制的研究还很少。通过对拟南芥和水稻的研究发现，光周期的反应元件在两种植物中是保守的，但是它们的调控机制可能不同，导致其不同的光周期反应特性，由于拟南芥属于长日植物而水稻是单子叶植物，对水稻的研究不能真正体现长短日植物之间的差别。通过对大豆光周期反应的分子机制的了解不仅可以完善植物光周期反应机制的理论体系，更可以为培育对光周期相对钝感的广适应性大豆品种打下一定的基础。因此，研究大豆开花过程中的分子调控机制，非常具有现实意义与科研价值。随着本实验室对大豆开花基因GmFT研究的深入，探索大豆开花抑制基因越来越显得重要。因此，通过生物信息学和分子生物学的方法，克隆并分析大豆开花抑制基因对深入了解大豆开花的调控机理和过程，对大豆的农业生产也有很大的指导意义。二、研究内容及技术路线(一)研究内容1．通过生物信息学手段查询预测大豆GmFLC基因的序列2．对大豆GmFLC基因进行克隆及生物信息学分析3．大豆GmFLC基因的功能初步验证分析(二)技术路线见图1．1 图1—1本研究技术路线 第一节材料男一_翻科一、植物材料第二章材料与方法本实验选用的主要材料为自贡冬豆(ZGDD)和黑河27(HH27)。自贡冬豆原产于四川自贡地区，具有有限结荚习性，晚熟和对光周期反应特别敏感等特性。黑河27产自黑龙江黑河市，该品种具有早熟以及对光周期不敏感等特性。本实验所用ZGDD为光周期敏感品种，在本实验所设置的长日照条件下不开花，短日照下开花，而在相同条件下HH27均开花，且开花时间早于自贡冬豆。日节律将开灯时设为0点，后每隔4小时取样。二、菌株及质粒大肠杆菌菌株DH5a购自TransGen公司；克隆载体pMDl8一Tvector和pMDl8一Tsimplevector购自Takara公司。三、酶及生化试剂DNAMarkerDL2000plus、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自Takara公司，质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒为Biomiga公司产品。DEPC、riffs等DNA和RNA提取试剂购自北京索莱宝科技有限公司。四、PCR引物PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司或华大基因有限公司合成。本实验所用引物如表2—1 引物名称表2．1本研究所用引物名称、序列引物序列(5’．3’)一————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一4321引物1．10771080-21222132-32563250．432158—10731074．22052204-33953395．43394339．4976S：GAGATGGGAAGGGGAAGAGTGGA-AATGCGATAGTGCCTTGCCTTGS：AGGCAAGGCACTATCGCATTTACA：TTGCTGCAAAGTCCAA√气TCCGS-GGACTTTGCAGCAAI]rTTGAAGTCA：ATCCAGCAT(}AATTGGGTCTGCS：GCAGACCCAATTCATGCTGGAA：GCTAGCTAGG'I’GCTGlvrTATGAAAGC4584引物16S-CAATACACGTACCTCTTAGTATCACACA：GGGAAAACTTTAAAACCAGATCTGCS-CAGATCTGGTT乃纠一14GTTTTCCCCA：AGAAATCCCGTTTCACACAAGCAS：TGCTTGTGTGAAACGGGATTTCA：CGACCATCTTTACCTTTGAGAACGS：CGTTCTCAAAGGTAAAGATGGTCGA：CATATTGCArGCATGCTAGTTACGS：CGn气ACTAGCATGCATGCAATATGA：AArACAAGCATTTTCACCCCATC 第二节实验方法一、DNA的提取(CTAB法)(一)试剂：酚、氯仿、异戊醇、7。5M乙酸氨、2％CTAB、0。5MEDTA、1MTrisHCl、100％乙醇、NaCl、p一巯基乙醇、RNaseA、异丙醇、蛋白酶K(二)DNA提取液：500ml提取液：109CTAB，50ml1MTris。HCl(pH8。O)，20ml0。5MEDTA，140ml5MNaCl，290mlH20(三)实验步骤：1．新鲜叶片于2mlEP管中液氮研磨。2．水浴65。C预热DNA提取液。3．每管加入6001xl提取液，109lB一巯基乙醇，29l蛋白酶K，混匀。4．65℃水浴加热，期间每10min温和混匀一次，lhr后取出，室温冷却10min。5．加入6009l酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡混匀，静置2-3min6．12000rpm，离心10min，上清液移入新管中7．重复(5)，(6)步骤8．加入2／3体积的异丙醇，混匀，．20。C放置大于30min9．4。C12000rpm，离心20min10．加200}tlTE重溶，加2肛1RNaseA，37。C水浴30min11．加2009l氯仿：异戊醇(24：1)混匀，12000rpm，离心10min17 12．上清移入新管中，加100til7。5M乙酸铵，混匀，加400p1无水乙醇，混匀，。20℃放置大于30min13．4。C12000rpm，离心20min14．70％乙醇洗涤3次，晾干15．加509lTE重溶，65。CjJH热lhr二、DNA片段的扩增PCR所用EXtaq酶购自TAKARA公司(一)按下列条件(表2．2)配制反应液表2-2DNA片段扩增反应液体系反应成分体积／反应TaKaRaTaq(5U／gL)10xPCRBuffer(M92+Plus)(1NTPMixture(各2．5mM)模板DNA(ZDNA)引物1(209M)引物2(209M)灭菌蒸馏水0．25uL59L2．5ng补水至509L(二)按下列条件(表2-3)进行PCR18 表2-3DNA片段扩增PCR反应条件三、T载体与目的基因的连接(一)在已灭菌的微量离心管中，加入载体DNA及一般芝3倍摩尔量的外源DNA：(二)连接体系如表2．4：表2。4载体与目的基因连接体系反应成分体积vectorDNAFragmentT4ligasebuffer总体积(三)混匀后，于16。C连接过夜。止儿也此L5I5O171吼1 四、大肠杆菌感受态细胞转化(一)实验步骤感受态细胞购自Trisgen公司。1．用预冷的无菌吸头取50—100pl感受态细胞到预冷的1。5ml微量离心管中，加入待转化的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30分钟；2．将离心管放到42。C循环水浴中热激90秒；3．快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5．10分钟；4．每管加800肛1LB液体培养基，37。C预表达培养45分钟；5．取适量上述培养物分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上(如要检测仅一互补，可在菌液中加入适量的X-Gal和IPTG)，用一无菌的涂布器将菌液均匀涂满整个平板表面；6．将平板置于37。C，待液体被吸收后倒置平板，于37℃培养12-16小时后可出现菌落。(二)注意事项1．无菌操作2．预表达所用培养基不含抗生素五、启动子序列的克隆采用TAKARA公司的Genomicwalking试剂盒(一)基因组DNA的获取。基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组DNA(例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理)作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外，由于本方法灵敏20 度极高，模板DNA一定不要污染，所需的DNA量不要少于31-tg。(二)已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物(扩增长度最好不少于500bp)，对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。(三)特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SPl、SP2、SP3。引物序列：SP1：5一GCTTCATAACGTGCTTTCAGCCTCASP2：5一TCCTTTGTTGCCACATTGTCCTCAGSP3：5．TGGAGAAGATGATGAGAGCAACCTC(四)1stPCR反应1．按下列组分(表2．5)配制1stPCR反应液表2—5启动子克隆1stPCR反应液组分反应成分体积Template(基因组DNA)dNTPMixture(2．5mMeach)10xLAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq(5U／}t1)APlPrimer(100pmol／Ixl)SPlPrimer(10pmol／91)dH205ng术L89L51aL0．5uL1i．tL1¨Lupto501aL21 2．1stPCR反应条件如下94。C98。C94℃65℃72℃lmin1min甜哪h94。C30sec；25℃3min；72oC3min94。C30sec；66℃1min；72℃3min94。C30sec；66。C1min；72。C3min>15Cycles94。C30sec；44℃1min；72℃3min72℃10min(五)2ndPCR反应将1stPCR反应液稀释1-1000倍后，取1“l作为2ndPCR反应的模板，以APlPrimer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2ndPCR反应。1．按下列组分(表2-6)配制2ndPCR反应液22 表2-6启动子克隆2ndPCR反应液组分反应成分体积Template(1stPCR反应液)dNTPMixture(2．5mMeach、10xLAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq(5U／}tL)APlPrimer(100pmol／gL)SP2Primer(10pmol／gL)dH2019L8pL0．5pL1I．tL1gLupto50}tL2．2ndPCR反应条件如下72℃10min(六)3rdPCR反应将2ndPCR反应液稀释1-1000倍后，取1¨l作为3rdPCR反应的模板，以APlPrimer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rdPCR反应。1．按下列组分(表2。7)配制3rdPCR反应液SeCyC5．I、●●●●●●0，●●●●●●Jn．1姗m3℃27nm℃6464∞SO3℃舛 表2—7启动子克隆3rdPCR反应液组分反应成分体积Template(2ndPCR反应液)dN7FPMixture(2．5mMeach)IO×LAPCRBufferII(M92+plus)TaKaRaLATaq(5U／I，tL)At’1Primer(100pmol／gL)SP3Primer(10pmol／I，tL)dH201pL0．5pLupto50“L2．3rdPCR反应条件如下94℃30sec；66℃lmin；72℃3min94。C30see；66。C1min；72。C3rain}15Cycles9,4℃30sec；44℃1min；72℃3rain72℃10min(七)取1st，2nd，3rdPCR反应液各59l，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。(八)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序。六、RealTimePCR本实验RealTimePCR采用TAKARA公司SYBRPremixExTaqTMII试剂盒。PCR仪使用AppliedBiosystems公司的ABIPRISM7900HTPCR仪。24 (一)下列组份(表2．8)配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。表2—8RealTimePCR反应液组分反应成分体积SYBRPremixExTaqTMII(2x)PCRForwardPrimer(109M)PCRReversePrimer(109M)ROXReferenceDyeII(50x)术3DNA模板dH20(灭菌蒸馏水)Total10p10．8“l0．8山0．49l2t．t|6pi209l(二)两步法PCR扩增标准程序1．Stage1：预变性Reps：195℃30秒2．Stage2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30秒 七、RNA的提取(一)组织样品的研磨：液氮下充分研磨组织，后称取50’--"100mg入EP管，加入lmlTrizol并剧烈震荡30s，是组织充分裂解。(二)将上述组织的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15-304CT放置5分钟；(三)在上述EP管中，加0．2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖，在手中用力震荡15秒，在室温下(15。C～30。C)放置2"-一3分钟后，120009(2℃～8‘C)离心l5分钟；(四)取上层水相置于新EP管中，加0．5ml异丙醇，轻轻颠倒几次离心管后，在室温下(15。C．--．30。C)放置10分钟，120009(2℃～8℃)离心10分钟；(五)弃上清，加lml75％L醇进行洗涤，涡旋混合，75009(2℃～8℃)离心5分钟，弃上清；(六)让沉淀的RNA在室温下自然干燥；(七)用Rnase—freewater溶解RNA沉淀。八、反转录合成cDNA使用天根QuantOneStepRT-PCRKlt试剂盒(一)按下列条件(表2—9)配制反应液 袁2-9反转录合成cDNA反应液组分反应成分体积／反应10XIUl-PCRBuf-fe超纯dNTPMixture(10mMeach)5XImPCRenhancerRNasin(40U／91)HotmasterTaqpolymerase(2．5U／91)QuantRTase(foronestep)上游特异性引物(10“M)下游特异性引物(10}tM)RNA模板5pl29l10910．5ul2．59l0．5u139l10ng+lggtotalRNARNase—freeddH20补水至509l总体系509l(二)按下列条件(表2．10)进行反转录27 表2．10反转录合成cDNA反应条件九、载体构建(一)质粒DNA的小量提取1．挑取单菌落于10ml含有相应抗生素的LB(或YEP)培养液体基中，置于摇床上37。C、220rpm震荡过夜培养；2．用百泰克公司质粒小量提取试剂盒进行质粒提取。取2ml离心管，9000rpm，离心30S，弃上清，收集3次菌液；3．用：侈液器吸取最后残余菌液后，加入250ul溶液P1，涡旋震荡重悬菌体；4．加入250ul溶液P2，温和地上下翻转7次，使菌体充分裂解，室温放置45．加入400ul溶液P3，立即温和地上下翻转6～10次，以便充分混匀，室温静置5min，13000rpm离心10min，将上清移入到一新的离心管中；28 6．将吸附柱放入收集管，加入500ul柱平衡液，13000rpm离心1min，弃废液；7．将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心30S，弃废液；8．加入500ul去蛋白液，13000rpm离心30s，弃废液；9．加入500ul漂洗液，13000rpm离一t330s，弃废液；10．加入500ul漂洗液，13000rpm离心30s，弃废液；11．将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，室温晾置5min；12．取出吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入100ul，70。C预热的ddH20中，室温放置2rain，13000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。提取后的质粒通过琼脂糖凝胶电泳检测后可置于．20℃短期保存。(三)PCR扩增目的片段根据已知基因序列，应用PrimerPremier5。0软件分析，设计含酶切位点的引物(或不带酶切位点)(表2—11)，引物序列由上海生工有限公司合成。PCR扩增反应体系如下： 表2—11PCR扩增目的片段反应液体系成分用量模板DNA(菌液)10x缓冲液dNTP(2．5I，tmol／L)Sense(10J，tmol／L)Antisense(10l，tmol／L)Taq酶ddH20总体积1耻l29l2．5“12U1lL￡10．51al16肛125．0,ul(三)胶回收(采用百泰克公司多功能DNA纯化回收试剂盒)管；1．在长波紫外灯下，将900bp左右目的DNA条带切下，放入2．0ml离心2．加入600ml溶胶／结合液DB，在微孑L加热器中，56℃气浴溶解胶块；3．加入150ml的异丙醇，混匀，将上一步所得溶液加入吸附柱AC中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；4．加入700ml漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃掉废液；5．加入500ml漂洗液WB，12000rpm离心1rain，弃掉废液；6．将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min；7．取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50ml，70。C预热的ddH20，室温放置2rain，12000rpm离心1min；将所30 得溶液代替无菌水，重复一次。回收溶液备用；8．取适量回收DNA产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测目的条带。十、GmFLC及质粒的酶切(一)质粒酶切实验所采用的限制性内切酶均为NEB公司系列内切酶。体系如表2．12表2．12质粒酶切反应体系反应成分用量PlasimdDNA10×BufferRestrictionEnzyme1and2ddH20Total轻弹试管壁混匀反应物，置于酶反应适当温度并按所需时间进行温育。取适量的酶切产物进行验证，酶切完全后经电泳、切胶回收后保存于．20。0。(二)、DNA连接反应在一般连接体系中可设定载体DNA与外源DNA摩尔量之比为3：1。连接酶体系为NEB公司系列连接酶体系(如表2．13)。船ⅢⅧ唧狲卜2O62 表2—13DNA连接反应体系反应成分用量DNAFragmentLinerVector10xT4DNALigasebufferT4DNALigaseddH20Total用移液枪吹吸混匀后，16。C水浴过夜连接。(三)、连接产物转化大肠杆菌大肠杆菌感受态细胞的制备：1．取：长肠杆菌DH5a单菌落接种于5mlLB液体培养基(不含抗生素)，置于37。C、250rpm振荡培养过夜。2．取1ml过夜培养物按1：100的稀释比例倒入100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2～4h，待细菌达到对数生长期(OD600为0．5～0．6)。3．将培养液转移到两只预冷的50m1无菌离心管中，置冰上10min，使菌液冷却到0。C。于4。C、4000rpm离心10min，弃上清。4．每只离心管加入10ml冰冷的O．1mol／L无菌CaCl2将菌体重悬，冰浴放置30min，于4。C、4000rpm离心5min，去上清。5．每只离心管各加入1．7ml冰冷的O．1mol／LcaCl2重悬沉淀，再加入300“1无菌甘油混匀后，按每管20091分装于无菌1。5ml微量离心管中。置于．70。C保存、备用。山出m孔札Ⅵ珊Ⅵ州伽叫 6．菌落PCR检测待菌落长到一定大小时，挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养5-6h后，以菌液为模板，进行PCR扩增，在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。7．目的片段的测序，拿5个阳性单菌落菌液在进行测序。8．确证序列无误后，把原菌落进行菌株活化，保存在一80℃冰箱。十一、原核诱导表达(一)、配制25mlLB于250ml锥形瓶中，无菌条件下加卡那霉素至30ug／ml；(二)、取3ml过夜培养阳性菌液至上述LB中，摇至对数期，OD值约为O．5左右：(三)、取出lml菌液，冻于一20℃；在剩余菌液中加入IPTG至终浓度为0．4mM；37。C继续摇；后每间隔1h即取出lml冻于一20。C，直至6h；(四)、把上述菌液融化，120009，lmin，弃上清；加入50ulSDSsamplebuffer悬浮沉淀；(五)、取25ul上样，15％SDS—PAGE检测。十二、SDS．urea—PAGE及蛋白免疫印迹分析将细菌总蛋白经变性后以相同的上样量直接进行SDS．urea．PAGE电泳分析。电泳完毕后，将蛋白进行考马斯亮蓝R250染色或转移至尼龙膜(Millipore，USA)进行免疫印迹分析。尼龙膜在含有5％脱脂奶粉的TTBS(50mMTris，pH7．4，150mMNaCl，O．05％Tween20)中封闭2小时后加入一抗，继续在摇床上抚育4小时。后用TTBS洗膜三次，每次5min，加入羊抗兔的辣根过氧化物酶HRP抗体(1：10000)并于摇床上抚育2小时。最后经TTBS洗膜三次，每次5min，TBS(50mMTris，pH7．4，150mMNaCl)一次5min洗膜后，用化学发光法进行免疫印迹检测。取等体积的发光液A和B混合后，加至尼龙膜并让其均匀分布，室温避光孵育5min后在暗室用x光胶片进行曝光。经显影、定影后对照片进行分析。 第三章实验结果拟南芥FLC基因对拟南芥的生长和发育具有多种调节作用。研究发现，春化作用可以下调FLC的表达，因而促进刀和SOCl基因的表达，导致拟南芥由营养生长向生殖生长转换【511。近来的研究发现，FLC能够抑制或促进其下游基因的表达调节植物的生长发育，如与SPLl5启动子结合并抑制其表达，从而推迟拟南芥从幼苗期向成熟期的转换。该研究还表明，FLC基因参与了花的形态建成【5¨。大豆作为一种短日植物，其开花时期以及开花响应依品种不同差异很大。目前已经从大豆中克隆了GmFT等开花诱导基因，然而有关大豆开花抑制基因的研究仍未见报道。本文从两个大豆品种(黑河27和自贡冬豆)中克隆得到一个与拟南芥FLC基因高度同源的基因，属于MADSBox超家族，并命名为GmFLC，本文分析了其生物信息学背景，并初步研究了其在不同发育时期和光周期下的表达模式。主要结果如下：第一节GmFLC生物信息学检索及分析根据拟南芥兕C氨基酸序列在phytozone网站同源检索(www。phytozone。net)，得到相似度最高的基因，根据其CDS序列设计引物，并分别在自贡冬豆和黑河27的cDNA中扩增得长约900bp的片段，经回收、连接、测序后得到僦C序列。经NCBl分析表明，所得基因属于MADSbox基因超家族，且其MADSbox结构域位于N端。1引ln01502e0243Querqs。q．辘簇泌鬈藿l制糍凌麓熟#嚣∞鬟hl囊徭搿盎㈣瓣缀蘑巍缀醚燃#嚣畦醚搿磊糍麓如瓣《兢缀瘫囊ll粼癫黪磁§戳囊黼#鬈矗簇l；≤磊嬲㈣赣囊囊i§雾崩D呐blhdlh9s·h嫩萎—冀。。乱：§：越§!k盘p,』tagi⋯h05Phor￥1口t1⋯lttkd⋯1：d‘1⋯}ttrPaco盏。轧熟’k蠡盘强≈k犍t¨基Specifichits嚣震麓瀚瀚勰瓣蘩震阑superfanllle。鍪羔⋯哟塞遵避鳇避耋l致』鍪匿互)耍基逐亟西遁旦至蒌三3图3—1GmFLC序列的分子生物学分析 进一步与拟南芥FtC基因氨基酸序列对比发现，GmFLC氨基酸序列与拟南芥FLC相比具有30．45％的同源性。但在MADSbox保守区则有非常高的同源性(80％)，说明所克隆得到的基因可能在某些功能上与拟南芥FLC相似(图3．2)。ArabidopsiSthaliana．seq黑河蛋白序两．seqConsensusArabidopsisthaliana．seq黑河蛋白序而．seqConsensus40li圈；娑誉懑磊i鬃雷：；蠲；鐾圈霉：：；躲晶67。。7A黑r河ab蛋ido白p序si两st．h。eaqlhna．seqN‘V+A。T‘]；ii毒：缰：案霉i：i：冒凑乩QRⅧSQR蹦H懿i￡黑河蛋白序两．seqxEALvLE亘ss霆QEY良LKAR困逼霆涠EDLConsensus1{j1ye1gA黑r河abi蛋do白p序si夕可st．h。eaqlhna．seq：：逼j蹲黑河蛋白序夕可．seqGP竭sKE罾EConsensusS1ArabidopsiSthaliana．seq黑河蛋白序刃．seqConsensus瑁：：绳：：；璧；凋：凋：爱：国：躔雷蠲凋：雷器酴i：霉：器；：；2譬：篙装恶：磊；器A黑r河abi蛋do白p序si而st．h。eaqllana·seq配：穗；：÷i立＆i，；晶ij最晶；寺j*面鑫÷j谕蠢童菇吉ConsensusP1Arabidopsisthaliana．seq黑河蛋白序而．seqConsensus109120149160188200196240196242图3．2黑河27Gm兄C氨基酸序列与拟南芥FLC氨基酸序列同源对比第二节自贡冬豆与黑河27中GmFLCDNA的克隆利用拟南芥FLC基因氨基酸序列，我们进一步从大豆中搜索到2个编码GmFLC基因的DNA序列，分别为4584bp和4321bp，其序列分别如下。Williams82DNA序列(一)82一Gml8-4584bp：．．|_一TAATTAAGGAGGTAGAATACAATTAATTAACAATACACGTACCTCTTAGTATCACACTTTAGACTTAACATTTTCAAAATATATTTCTAGATACATGTTATATACAAGGCCTACATATATAjfATTATAGAGATTTTATACATTCTAAATTTTGTGAGTGTGGACAI’ACTCTGAGCGTGAGAAAGAGAAGGGGAAGAAGAGAGAGAGTGATGGGAAGGGGAAGAGTGGAGTTGAAGAGAATTGAGAACAAGATCAACAGGCAAG35 TGACCTTTGCAAAACGAAGGAACGGGCTTTTGAAGAAAGCTTATGAGCTTTCC(订TCTTrGTGATGCCGAGGTTGCTCTCATCATCTTCTCCAATAGAGGAAAGCAGTACGAGTTTTGCAGCGGTTCAAGGTATTTTCCCCCCCACCAAAATGCAAAAACAAAAATGGArAATTATAAACACATGGAATGGACACAACATAGCATAACCAAGAAAAAAAAAAAATCCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTTTTGTTTACTTCTTCAAACACATATGGTTATATGTGCACATAAAACATACTATCACCGAAAAAGGAACCGCA(；GACCTTTCTAGTTCTCATCCACACCTTTCTCTCTTCCTTTGATTT7I’TGCTGTTTrCAGTGATTCAAGACCACCAGCTAGCGTTTGCCACCTTCTCAATTTTTA=rTTT'I、TTTTATGCAAACAACA=rGAAAAAAGTTGAGTTTCTTTTTTCACTGTTTTGAGTTTTTCCGTTTCTGTGAATGTCTCGGCGTTTTTAGCAGGTTGAGTGTTTCTGTGGTCTTGTTGATGTTAGATCTGCAACTGGAAATGCAAAGAA久哗江’AAA11ACAATAAAACAACATGAGAGATTATllACTGTTGTATTGACTGTTCl“rTC7I’ATGTATGT(了CTAGTTTTTTTTTCTTCCTTCTTCTCTAATTTTGTTTTCCCCCAACCCTTTACCACCATTCTCTTTCTTACCCTCTTTTGGCTCTCAACCCAGTGATCCAAAATTT棚’11ATTTTTGCTTCATTTGTGTTAAGTTTCAAGCAGATCTGGTTTTAAAGTTTTCCCCAGCAATTTGGGATCTGCTCATCAGGCTTCTGTTTCTGTGCAA=rTAAGTGTTGTGTAAAGATGCACATCATTATTTTTTTTTCCArGTCAAGT7ITTAGCAGCCAGTGTCTGCTTTTGGCTTCAGTGTTTAAGAATCAGTCGAAAAACCT久ACCCATGTCTCCTTTTTCATTTTCTTATTTCACCCAAGGCAAGGTACTArCGTTTACA]?AI：ATCTCTGGGCCTAGCTAGGGTTTCTTTTATTTCTACAATTAGTTCTTAGTTT(：CTCAGTATATATATCTGTCCATTTCTTCCCTTTTCATGTATTATTTAAAAGTTATZ汀TTTTTTATTATTATTTGCGTTGGCTTACTATTTTTCCTATArTATTTATTTACTC≯dCAAGCTTTATGATGGTACTAATTCTCTGCCCTAATTTACTCATTTCTTTTTTTTTTTTCAGTTGTATACATATGTTATGTTATTGAAAGCAGATGTACATTTGATATGTTTTTTCAATTGATAATTATCATGATGAATTTAAT玑町TACAGGTTGArATGCTTATGCTACTAAATCAGGATTAGATCGAATGGTCTTTTCTTATAGGGCATCTAGTpdA．GTATAGTGGATAATTTGACCTCTATCTCCTTAAGCATAAACGCACTGCCACATirrTTCAATTCATTCAGTTGTATATGTTTCGATGCCTAGCTAATAGC711AGACATACCAAGATTTTCTTTCTGG解ATATATTGGCTTCTCAGTACAAA=rTTTCTTCTTCCAAAACTAGCTGCTCTCTCTCTCTCTCGTTCAGAAATCAACAGTGGT36 CCATTAGGTCAGGATCTCAATGTACGGTAATCGAACAATGA=rATGTTCCCTGTATCTACTTCTGGGCGTTTAAGAAGTGTCACATAAATl’AAATGAGCTA咒虹ATCTCATTTArrrATCCATAGGATATATATCCGATCGATTTCTTTCTCTTGCCACATTTAGTTTGTTACTAGCTTTllATCTAGCGA礅GATGAATAGl’ATGTTTGGGGTGACAC7r’AAGATCAACCAAAATCAATTATCAAATCACAGTAAAGTAAATGTGAAATAAr'ATAIAATTCTr_rTGGAAAAATCATGGTG久n奸TGCTTGTGTGAAACGGGATTTCTATTTGATTCCCAAACACACTAGAAAGGGGTCTCAATTATArATTCACATCT7I、AAACTACTAATTAGTTATCGATCCTGCTCACACAAGGTGTATTCTGACGTCTCTCTCCArTTAnACCGGGTTAATTGGTTTCTCATCACTATAAGTTGTTCACCGCTTGAGAAAAC觚AATCTTTTGGCTAGGTGGAGTTGGACTTACAGAAAATTTGAAGTCAAAAGATGTTTCAAGAGAAGACACAATTTATACTTAATAATATTATTAp汀TTTGAAACCCTTACTAAAGAAAGTACGTTAATTAATTATGCAGTAATTAACTTACTATAGTTTTCCTTTTTTAAAAACTTTCTTGGATGGTAAGTACTACTGATTGTGCATCTGTCCTGTAGTAATGGAATTAlACATTTAATTGGTACTTf吣rATGA工ATTCTAAATGTTTGTACAI、AATTTTAT久IⅪGTCAACGTGCAGCATGCTCAAAACGCTGGAGAGGTACCAGAAATGCAACTATGGAGCGCCTGAGGACAATGTGGCAACAAAGGAAGCCTTGGTATTGGTGATAATCCCATACGCCCTAAArATTTAATTAATTGAGTA丌TGTGCATTTAAATTGCCGAATTTGATCACAGCATTTTTTGTTTAATTTCTTTTTTGTCTCTTGTACATACAGCGGAATATGGATCTATTTAACATI批TTTTTTTTATCTGAAI、AAAATAAAAGGGAATGTGGAGCATAACCArAACTGTTCTAGTA．TCCTTTTTTGCATAAAGCTATATTTGCAGTAGTGTTTGTGTTAAGAAAATCAAGTTGAAGCAATGCAATGATCCCTTTAATCTTCAGGCATTGTTTGGATGGAATGGTTTTCAGCGAGTGGCCGGGAGGGGGTAATTTTTCATTTTC久n虹TGAGAAAGTTATAATTTATAAAAAL气AACAAAGAATGTTTATTGAn虹ATAGGGTCTGGAGCGAAACATTTATAGCCTAATTAACTACATGTTTATGGAAACAATTTGTTACATGCCTGCTTCAGGGAGCACCAGTTTATTATCAATGCACAATTCATTCAGCTTTTGTAACAGCTATG“rTTTTGCTTCCATGACTATATATAGGAGTT_蚣GCAGTCAACAAGAATACTTGAGGCTGAAAGCACGTTATGAAGCTCTACAACGTTCTCAAAGGTAAAGArGGTCGACT芦汀GTCTAGAATTATATGCACATNllATAAllACGAACTGATGAGTTATTAATATATp灯TTGACTGATTGATGATCATTAGGAACCTTATGGGAGAAGAT37 CTTGGCC℃TCTAAGCAGCAAAGAGCTTGAATCACTTGAAAGGCAGCTAGATTCGTCTTTGAAGCAAATCAGATCAATAAGGGTACTTTCCAAAGTTGCCAArrTCCATTTTG气AATAATTTAGAAAAATCGGATCACACAT’rAATTCCCAATCACGAArCACCTCCACAGCTA／蛆TCCATTTTAGACpⅡ’An钢盼丑蛔瞄脚&D姐1ATAD气TA丑蛆’A丑钢硝咒蛆狐rATATATATATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNADn帅n帅TNA沁TNN’NNNGAGTGATACAGAGATATCTCTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTArATGGAGATACGGGTCTCTCAAA了AGCGGTGT船觚觚ATA弋瓶峨瓯逝蹑峨陋舔妊峨呱峨蹑敝峨峨鼹舔啜峨晦心心随陋峨鼹姆甑舔氏T篷L钢rAT≮PⅡ燃TCACCAAATTAAACAAnTGCArTAAGAT段rATATGATTTAGCA√气TTCAACTTTGCCCTCCTCAACTACTACAAGTGAAATCTTAATTAAGAGCGAGTTGCGCTGCTGTTTTTTGCAGTTGGAAGAGTTTCAAp汀AAATCCACTCCAACTGAATCl：CAGTGCTGAAGArATGGGGTATGGACGCCATCCAGGTCAGCCCCAAGGCCATGCTCTCT，ITCAACCATTGGAGTGTGAGCCAACCTTGCAAATTGGG仉气TTATTTTCCTCTTCATTCAAATA=rTA娜1CATTC解ATATAGTTGTGGTTGTAC久D蜘：觚t盯TTCGrAACTAGCATGCATGCAAⅨrGAAAGAA=rTAATGCATGATTT久AGAGArTGTGTGGTGTACArAGTATATATGGGATTTGATACAGACTATTAGAAACTACAAA!rI《隅CGTAACAATTTAAAATTCCCAATCATGAATCATGTTGATTAACGAGT虬～CGGGTTTTAGATTTTGAI’AATAATTTTAATTTGTTTGATCGCAGATATCATCCTGATCCAGTATCAGTGGTGACAGAAGGCCCAAGCATGAATAAT‘I、ACATGGCAGGATGGTTACCATGAAAGAGTGTCAAATGTGGAGCAIAATTAAAGATCCTGC(：GTTTAp汀TTCAAATTTATTTGAAGTTAAGGAAAACGGAAATT7rGTAA=rAGCACGTAATGGACTTACACTAGACTCTACCTTCTA觚T_蚣GCTAGGAACAATATAAGCAGTGATTTTGTGTGTGAGCTTTCATAAACAGTACCTAGCTAGCCTCTTCCTTGTTTCAA=rAA=rCACTTCTTCCTTTTCCTAATTAATAAAACTATCGTATGCACCCTTTGCCTl7TACA11，ACCTTGTArTACCTACCAATGACCTCACATGTTTGCTTTTGTCACTCTATAAAATTAGTGTTTAATTTTCTCTTCCAGGCAI’AGCCATTATTTG疋【、GGGGTGAATGCTTGTATTATGAAA久rATACArTTCTCAArTGAA (二)82一Gm一4321bp：GAGATGGGAAGGGGAAGAGTGGAGTTGAAGAGGATTGAGAACAAGArCAACAGGCAAGTGACCTTTGCAAAACGAAGGAACGGGCTTTTGAAGAAAGCTTATGAGCTTTCCGTTCTTTGTGATGCCGAGGTTGCTCTCATCATCTTCTCCAATAGAGGAAAGCAGTACGAGTTTTGCAGCGGTTCAAGGTATTTTTTTTTTCCACCGAAATGCAAAAACAAAAATGGATAATAAACACATGGAATGGACACAACATAACCAAGAAAAAAAAATCCTTTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTTTCTCTCTCTCTCTTTTTGTTTACTTCTTCAAACACATATGGTTATATGTGCACATAAAACAI’ACTAGCACCGAAAAAGGAACCGCAGGACCTTTCTAGTTCTCCACTACACACTTCCTTTGATTTTTGCTGTTTTCAGTGATTCAACCACCAGCTAGCGTTTGCCACCTTCTGATGArTTTTTTTTTTTGTGAAAACAACATGAGAAAAGTTTATTTTCTTTTTTCACTGTTTTGAGTTTTTCCGTTTCCGTGAATGTCTCGGCGTTTTTAGCAGGTTGAGTGTTTCTGTGGTCTTATTGATGTTAGATCTGCAACTGGAAATGCAAAGAAATATAAATACAA=rAAAACAACACAATTGATAGATCACTGTTGTATTGACTArTCTATTCTATGACTATGTCTGTGCTAGTTGTTTTTCTCTTCCTTCTTTAACTTTGTTCTTCCCCAACCCTTTACCATTCTCTTTCTTATCCTCTTTTGGCTCTCAACCCAGCGATTCAAAATTTATTTTTTTTGCTTCATTTGTGTTAAGTTTCAAGCAGATCTGGTTTTAAAGTTTTCCCCCAAAAGCAATTTCGGATCTGCTCATCAGGCTTCTGTTTCTGTGCAATTf蚣GTGTTGGGAAAAGAAGCACATCATT芦d．TAATTATTTTTTCTATGTCAAGTTTTAGCAGCCAGTGTCTGCTTTTGGCTTCAGTGTTTGAGAATCACTCAAAAAACCTAACTCGTGTCTGCCTTTTCATTTTATTTCACCCAAGGCAAGGCACTATCGCATTTACATCTCAGGGCCTAGCTAGGGTTTCTTTTpⅡTTCTACAATTAGTTCTTAGTTTCCTCAGTATATATATCTGTCCATTTCTTCCCTTTTCATGTATTATTTAAAAGTTTTTTTTATTTGCCTCTGGCTTACTATTTTTCCTATATTATTTATTTACTCATCAAGCTTTATGATGGTACTAATTTTCTGCCCTAATTTACTCATTACTTTCCTTTGTTCATTTGTATACATATGTTATATGTTATATTATTGAAAGCAGATGTACATrTGAn气TGTTTTTTCAATTGAGAATljATCATGATGAATTTATAACAGGTTGATATACTTATGCTACTAAATCAGGATCGGATGGAATGGTCTTTTCTTATAGGACTTCTAGTATAGTTAA／姐、AATTTGACCACCAA』气TGAAAAATATAAGATTGGTTGA39 GTAACA(汀TCAA订TTTCCTACTAATAAAATTAACAAACTAATCATTAArATTTAACTACAAAAATTCACCTCAATCTCCTTATGCATAAACGCACTGCCAIHrTTTCCATTCATTCAGTTGTACATGTTTCGATGCCTAGCTAGTAGCTAGACAAATCAAGATCTTCTTTCTGGATATACATTGGCTTCGATCTCAGTATAAGTTTGCTTCTTCCACAGCTAGCTACTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCGCACTCAGAAATCAACGGTGGTCCArTAGGATCTAATGTACCGTAAAGAACAATGATGTATCCATTTGCGTCTACTTCTGGGCGTTTAGTGGCACATAAATGAGCTATCTCATTTATTATCCATAGTGTATATATCCGArI可CTTTCTCTTGCCAAATTTAGTTTGTTACTTGCCCTTArCTAGCGATAGATGAAAGGGGTCTTAGTTATAT芦汀TCACATCTTAAACTAC7fAACTATCGATC(二AGCTCACACAAGGTGTATTATTATGTATTTCTCCATTTATTACTGAGTrGCT，rTCTCATCACTATAAGTrGTTCACCGCTTGAGAAAACATAATCTTTTGGCTAGGCGGATTTGGACTTTGCAGCAAI’，rTTGAAGTCAAAAGATGTTTCAAGAGGAGGCACApd’TTGTACTTAATAAI’ACTTTAAGTTGAAACCCT，IACTAAAGAAAGTATGTl’AACTAAGCAGTAACTTACTGTAGT，ITTCCCTTTTTTTTAAAAAAAAAAAATCTCGGATGCTAAGTACTACTGATTGTGCATCTGTCCTGTAGTAAGGAAl汀ATACATTTAATTGGTACTTATATTATATGATA=rTCTAAATGTTTA=rACArTATAATTTT姐久n蛆ATGTATGTCAACGTGCAGCATGCTCAAAACGTTGGAGAGGTACCAGAAATGCAACTATGGAGCGCCTGAGGACAATGTGGCAACAAATGAAGCCTTGGliATTGGTGATAATCCCAI’ACTGTTCTAGCTAGljATCCCTTTTTGCAGTAGTGTTTGCATAAAGTTATATTTTCAGTAGTGTCTCTCTTAGAAAATCAAG‘I’TGAAGCAArGATTCCCGGAGGGGGTAGTTTTTCATTTTCAn蟠TGAGAAAAGTTArAATTT忿fAAAAATAAATAAAGACT舯TATTGAI’AGGGTCTGGAGCAAAACATTTATAGCCTAACTATGTGTATGGACACAArTTGTTACATGCATGCTTCACCAGTTTArTAATGCACAATTCATTCAGCTTTTGTAACAGCTATGATTTTTGCTTCCATGACTATAGGAGTTAAGCAGTCAACAAGAATACTTGAGGCTGAAAGCGCGTTATGAAGCT(：TTCAGCGTTCTCAAAGGTAAAGAGCTAGACTCGACTATGTCTAGAAGTATATGCTAGCTACATAATACGAACTGATGAGTTp汀TAA眦ATATTTGACTGGTCGAI’ACTCATTAGGAACCTTATGGGAGAAGATCTTGGTCCTCTAAGCAGCAAAGAGCTTGAGTCACTTGAAAGGCAGCTAGArTCGTCTTTGAAACAAA=rCAGATCAATAAGGGTACTAAAGTTTCCAACGTTGCCAATTTCCATTTTGAC&n气TA TAATCATTTTTTTTTTAGCTGTGCAATAAAGAATAGAAGAApⅡTAGTTGATCTTTCTCATAACTTCAL≮D气TAATCTCAATGGTCAATGGTCTATATCAACTTTTCTCATAGCATTCTATATATGCAGACCCAATTCATGCTGGATCAGCTTTCTGATCTACAACGTAAGGTATGAGGTCAATTATGCTTTCTTTCTTTGATCAATGTTTAACTGCTGTTGATCTTCCGCATGTTTCCCTTGCTCACCGATTCAATTATATATGTCACTTGTGAAGGAACACTTTCTAGGTGAATCAAACAGAGATCTCATACAAAGGGTAAGAGACATTTCAACCTACTTAAAATTACGTAGTCACTCAAATTCCGGTTCATA=rATAGTTCTACCAATTGGACTATAAATACCACCAAATTAAACAATTTGCAGTAAGArATGATT芦AACAATTCAACTTTGAATTAATGGACAAATCCCTCGATCCTCAACCACTACAAGTGAAATCAATCTTAAGAGTGAGTTGCGCTGCTGTTAATGTTTGCAGTTGGAAGAGTTTCAAATAAATCCACTTCAACTGAATCCTAGTGCTGAAGAAATGGGGCATGGACGCTATCCAGGTCAACCCCAAGGCCATGCTCTCTTTCAACCATTGGACTGTGAGCCAACCTTACAAATTGGGTp灯1TACTTTCCTCTTCATTCAAATATTAATTTATGCATATATAGTTGTGGTTGTACACArATTATTCCGAACTAGCATGCATGCAATACGAAGAATTAATGCATGATTCAAGAGATTGTGGTGTACATGGT久n姐ATGGAA丌TGATATAGACTATTGGAAACTACAAATpⅡ’TGCGTGATAATTTAAACTTTGCAATCACGAACCATATGTTGATTAAAGGGTAACGGGCTTTAGATTTTAAI’AATATAATATATTAATTTGTTTAATCGCAGATATCATCCTGATCCAGTATCAGTGGTGTCAGAAGGCCCAAGCATGAATAATTACATGGCAGGATGGTTACCATGAAAGAGTGTCAAGTGTGGAGCAIAATTAAAGATCGATCCTGCCGTTTCAAATCT久rTTCAAGTCAAGGAAAACGGAAATTTGTAATAGCACGTAATGGACTTAATTACACTTGACTCTTCCTTCTAATTAATCTAGGAACAATATAAGCAGTGATTTTGTGTGAGCTTTCATAAACAGCACCTAGCTAGC根据williams82的DNA序列，我们在自贡冬豆和黑河27中均克隆得到其DNA序列。根据长度为4321bp的DNA序列与GmFLCCDS序列对比发现，GmFLC基因包含七个外显子和六个内含子(图3—3)，这一点与拟南芥FLC基因一致。41 ■■■——一⋯～————嚏嘲卜一⋯—增鞲卜—璃*种一—巾旧黔———一一1——卜————叫■■■-■■图3。3G删吧C基因结构第三节自贡冬豆与黑河27中GmFLCcDNA的克隆根据williams82CDS序列的两端设计引物，以自贡冬豆和黑河27cDNA为模板，经扩增、回收、连接T载体、转化和测序后，得到各自品种中GmFLC的序列。分析发现，自贡冬豆和黑河27GmFLC基因的CDS序列基本一样，仅表现出一个碱基的差别(图3．4)。但这一差别并没有导致氨基酸序列的差异，因此为同义突变。42 黑河cDNⅣ芋歹U．seq自贡cDN列芋歹U．seqConsensus黑河cDN婷列．seq自贡cDN氏序歹U．seq黑河cDNA序列．seq自贡cmIⅣ芋列．seqConsensus黑河cDI',IAfT-歹O．seq自贡cDNA序列．seqConsensus黑河cDNAJ芋歹U．seq自贡cDNAJ芋歹U．seqConsensus黑河cDN对芋歹U．seq自贡cDNA序列．seqCons；ensus黑河cDNA序列．seq白贡cDN耐芋歹U．seqConsensus黑河cDN耐芋歹Ⅱ．seq自贡cDNⅣ芋歹U．seqConsensus黑河cDNAJ芋列．seq自贡cDN耐芋歹n．seqConsensus黑河cDNAF帮fd．seq自贡cmIAJ芋歹n．seqConsensus黑河cDNA序列．seq自贡cⅨ汲序歹U．seqConsensus黑河cDNA序列．seq自贡c研{婷歹Ⅱ．seqConsensus黑河cDNA序歹d．seq自贡cDNA序列．seqa七gggaaggggaagagtggagttgaagagaattgagaacaaga七caacaggcaagtgacctttgcaaaacgaaggaacgggcttttgaagaaagcttatgagctttccgttctttgtgatgccgagg七tqctctcatcatcttctccaataqaggaaagcagtagagttttgcagcgg七七caagcatgctcaaaacgc七ggagaggtaccagaaatgcaactatggagcgcctgaggacaatgtggcaacaaaggaagccttggtattggagt七aagcagtcaacaagaatacttgaggctgaaagcacgttatgaagctctacaacgttctcaaaqgaaccttatgggagaagatcttggccctctaagcagcaaagagcttgaa七cact七gaaaggcagctaga七tcgtctttgaagcaaatcagatcaataaggacccaat七catgctgga七cagctttctgatctacaacgtaaggaacactttetaggtqagtcaaacagagatctcagacaaaConsensusggttggaagagtttcaaataaa七ccactccaac七gaatcc黑河cⅨn序歹Ⅱ．seq自贡cDNAf事歹|j．seqConsensus黑河cDNAJ芋歹|j．seq白贡cDNAJ芋歹U．seqConsensus黑河cDNA序列．seq自贡cDNAJ芋歹U．seqConsensus黑河cDNA序列，seq自贡cDN氏亭歹U．seqConsensus黑河cDN列芋歹Ⅱ．seq自贡cDNA序列．seqcagtgctgaagatatgqggtatggacgcca七ccagg七cagccccaaggc(：a七gctctctttcaaccattggagtgtgagccaaccttgcaaattggatatcatcctgatccagtatcagtgg七gacagaaggcccaagcatgaataattacatggcaggaConsensustggttaccatg4080120160200240280320360400440480520560600640680720731图3_4自贡冬豆与黑河27GmFLC基因CDS序列对比438；跆歹歹一蹄一锄∞∞帆∞河贡∞∞黑自∞ 黑河蛋白序I歹U．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序列．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序列．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序列．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序歹U．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序列．seq自贡蛋白序列．seqConsensus黑河蛋白序列．seq自贡蛋白序列．seqConsensus图3．5自贡冬豆和黑河27GrnFLC基因氨基酸序列对比通过软件预测的GmFLC氨基酸序列发现，白贡冬豆与黑河27GmFLC序列完全一致(图3．5)，说明该基因在两个品种的大豆中保守存在。因此，如果GmFLC参与调节大豆生长发育过程，那么品种间的差别可能在于该基因的调节方式不同，而非GmFI，C基因本身的差别。第四节GmFLC启动子序列的克隆启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。总结起来，也就是说启动子约在与mRNA所对应的DNA序列之前约2000个左右的碱基。因此，研究GmFLC基因启动子序列，O0O0O24826O4048挖坦垢M加加烈烈烈驰 对于后续有关GmFLC基因表达的调控、组织特异性及定位等都具有很强的指导意义。同时，分析启动子的差异也有利于研究不同品种大豆间基因表达的差异。根据自贡冬豆和黑河27中GmFLCCDS序列高度保守的特点，说明GmFLC的表达可能受到其启动子的影响。因此，在这两个光周期敏感性不同的品种中，GmFLC启动子是否存在差异?这种差异是否影响了GmFLC基因的表达就成了急需解决的问题。因此，我们利用染色体步移技术(图3-6)克隆了自贡冬豆GmFLC的启动子序列。GenomeWalking5、来豫嚣诫基粒序列区3，[二二巫亘夏至至二二二二匿=蚕∑∑=j，3、溯≥2SP‘15’特舞性零l豹图3-6GenomeWalking原理GmFLC基因启动子的克隆利用GenomeWalking(染色体步移)技术，得到的片段约为lkb左右。已知特异性引物：SP1：5．GAACCGCTGCAAAACTCGTACTG185SP2：5．CGGCATCACAAAGAACGGAAAGC127SP3：5一CAATCCTCTTCAACTCCACTCTTCC37GmFLC基因5’UTR(～lkb)64676252％48％TCAATCCTCTTCAACTGCACTCTTCTACGCAGCTCAGAGAAAGAACATlAAAGTCAAAATCGTCAATAGATTGTCTGGTCTGATCTGGTCTGGCCAGCCTTCAACTTGCAATAAACACCAATGCAACTAAAGCAACTCCAAAGGACAGCAATGTCGTTCCTCGAGTACTTATCAAACTGCTTGCATCAGCGCTGTCCTTGGATGTTCCAAGGCGAGCATCAGCAGATGAGTTATCATTATCAGCTTTTGGCGCCATTGCGGGG45 GAGGGT(jCAGGAGCTGGTGGCTTAGGCCTGAAGAAATCCAAAGGGAGAAGCACCTTGTCCACATGATAGACTGCAAGCACCTTATCTGAGTACACAACTCCCGTGACCGTGGCATTAACCACTCCTGTTGAGATp灯TCACATTGCTGCCATATGCTGTCACATTAAATTGCAACCTGGTGGGATTATCCCCGGCCAGAGTTCTCACGGGGTTGCTCAGTGAATCGAAGTTTGAGCTTGAAACp汀'AAGTGGGAAGAACATGGAACTGAA(jAAGTTCGATCTTTTGATTGTCGGCCAGAGAGTTGAGGAACCCTGCTTTGAGTTGTGAAAAGCTTCCATCATCTGGTGCAAAGATGGTTAAGCCACCTGATCTrrNfGGTTATTAGCTGAGCATTGATTTGGTTGATCAATTGGGTGGTTTTCAGAAGG《二GAATTAGGACGTTGAACGATTTGGCCTTCCTTAAn钉TCTGATGATGTCATCAGGGGAAGAATCAGAGGTATCTGTAGAGGGTGACTGGACCATTGGTTTTGGTGGGGATGCATCAGGTGCTTGGGCTAATGTTGTGGTTGAATATAAAGGAGCAAAAAGGCATCAGGAGTAAGAGGTAGAAI’AAAACTTGCTTCATTTTTCTGTAGGCAATTGCAAGTTTCCTTTTGAAGGCTTGGTGCTATTAAGGAAGAGTTGTTTTGArGTGTGAAGAGTGAGTTGAAGAGGATTGAATTT一、启动子分析结果根据所得的序列，利用http：／／tools．genome．duke．edu／generegulation／McPromoter／软件进行分析，发现约-400bp处有一条序列分值较高，且距离转录起始点较近(图3．7)。46 图3．7G聊咒C启动子分析二、GmFLC转录调控区中转录因子结合位点预测分析利用www．ifti．org中的TFsitescan软件，我们发现了多个转录因子结合序列(图3．8)。结果显示，GmFLC上游有多个转录因子结合序列，其中包括TCF、E2A、Myb、c—Myb、AP．2和Nkx等，这些转录因子可能对于GmFLC的表达调节有重要作用。翻I㈣。-．．073蠢鍪篱黼INct021咖H啪⋯’04弧p。弗。。妒⋯隆i一掣稍盼铲柏’。。胁+，tP问眠tr”‘荽。。。年b驰一BIc*b抽7}卜囊卜_：}_—T—咱潮随—1}警T—麓—{瑚卜{}卜—{}———专嗣卜誉_——-{囊}_=}}j卜一100200300400500图3-8GmFLC启动子转录因子结合位点预测图第五节GmFLC表达的组织模式植物不同器官、不同发育时期均需要特定基因的表达才‘能满足其生长发育的需求。因此，研究基因功能首先要测定基因在植物各个组织中的表达模式。近年来，实时定量PCR(RT-PCR)应用越来越广泛，逐渐被视为一种快速、准确的测定基因表达的方法。根据这些特征，我们拟采用RT-PCR的方法，测定GmFLC47 在大豆不同器官、不同发育时期的表达变化。鉴于RT-PCR较为灵敏，我们首先检测了所设计引物的特异性，以保证实验结果的准确度。通过同样方法的PCR反应过程发现，用于扩增GmFLC的引物特异性较高，未出现非特异性扩增(图3-9)，说明该引物能够用于后期实验。Real-timePCRprimer：Sence：GCTTTCCGTTC丁TTGTGATGCAntisence：T丁TGTTGCCACATTGTCCTCAG图3-9Gm凡CRT-PCR引物特异性验证进一步通过RT-PCR分析发现，长日条件下，自贡冬豆叶片中GmFLC的表达随着发育时间的增长逐渐增高，而短日处理则没有明显变化(图3—10)。与之不同的是，黑河27中GmFLC不论在长F1，还是短日处理均不随发育时间的增加而升高。这说明长日处理下，自贡冬豆中GmFLC表达的升高可能是使之维持营养生长的原因之一。而对于黑河27来说，由于GmFLC在叶片中的表达量很低且不受光周期调控，因此可能导致了这一品种对光周期不敏感的特性。结果还表明，短日处理下，自贡冬豆中GmFT的表达逐渐增高，说明长日条件下可能由于GmFLC的调节，GraFT不能被诱导，因此抑制了自贡冬豆的开花。 黪掰笋毽eGmFT图3．10大豆发育过程中G朋凡C在叶片中的表达第六节GmFLC在大豆发育不同时期的表达由于克隆得到的GmFLC与拟南芥FLC具有相同的结构域，因此GmFLC可能同样参与大豆的发育过程。为验证GmFLC在大豆发育过程中表达的变化，通过qRT-PCR的方法测定了其在不同发育时期、不同部位的表达。结果表明，GmFLC在叶片中有大量表达，并在花器官中有⋯定表达。在大豆发育不同时期，GrnFLC基因在不同部位的表达量也表现出了较明显的差异。由图3—11可以看出，除去开花过程，其余过程中表达量最高的都是在叶片中，而且较其他组织而言，叶片中的表达量极高，其他组织中的表达量极少，甚至无表达。在叶片中，随着发育时间的推移，GmFLC在叶片中的表达逐渐降低。这说明GmFLC在大豆由幼苗期向成熟期转化的过程中起到一定作用。此外，GmFLC在花中的表达说明该基因可能参与花的发育。49 6茧5(j言4，∞I∞}o受1f3)ID：>幡ID叱0～iIIShOOtapx豳翻LeafIStem豳Root圈Flower，童五击墨意酗d_-^*||m■●■■■■燃一01O203040图3．11短日条件下黑河27Gm凡C不同发育时期及其组织特异性表达第七节GmFLC表达的昼夜节律现象自贡冬豆和黑河27由于长期受到自身环境的影响，逐渐进化出了对光周期不同的响应。这主要表现在黑河27对光周期不敏感，在短日长日下均能开花，而自贡冬豆则只能在短日照处理下开花，长日处理时一直保持营养生长。这种差异可能在于两个品种间光敏基因的不同所致。为证明GmFLC基因是否具有节律性，我们用qRT-PCR的方法测定了GmFLC的表达是否具有节律性。结果发现，GmFLC的表达并没有节律性，其表达在短日处理下有一定降低；然而，刀的表达却具有光节律性，表现为光下降低，暗处理积累的现象。这说明GmFLC的表达可能不受光敏色素基因调节，因此不呈现节律性(图3．12)。50 Oh12h24h36h48h60h72hj溷——■囊—■誓翟■—一羞——■——●■■——■12h24h36h48h60h72hj■I■■——II——一12h24h36h48h60h72h|¨—I—一■_■一图3—12GmFLC的光节律反应第八节GmFLC在长短日处理下表达的规律自贡冬豆和黑河27两种品种对光照长短敏感度不同，对光照处理的反应也不尽相同。这种差别可能是由于调解发育过程的基因和／或光敏基因的差异所致。从这一假设推测，如果GmFLC参与大豆开花的调控过程，那么在大豆生长发育的过程中其表达应该呈现不同的趋势，即在开花被诱导的过程中逐渐下调，并且在两种大豆中的表达也有差异。因此，为初步验证这种可能性，通过qRT-PCR测定了’自贡冬豆和黑河27在不同光周期处理下叶片中GmFLC表达的变化情况。结果表明(图3．13，图3—14)，短日处理能够逐渐抑制GmFLC的表达，而长日处理则促进其表达。通过不同品种的比较发现，日照长短对黑河27与自贡冬豆中GmFLC表达的调节有一定差异。这主要表现在短日处理时自贡冬豆GmFLC表达变化幅度较小，而在长日下表达很快被促进，说明在开花条件下(短日处理)，自贡冬豆需要生长达到一定时期才会通过调节转为生殖生长(一方面下调开花抑4321O：54321O^N乱>o爸oIs∞母．{n1)c∞∞^lpm—m磁0“艮>o，uo|s蝣m．Ic|×啦啦>；∞I。芷 制物质，一方面积累开花促进物质)；而长日则可能通过上调开花抑制基因维持其营养生长状态。相反，黑河27GmFLC在短日处理下下调更快，而对长目照处理敏感度明显较自贡冬豆低。由于在两种日照处理下黑河27均会开花，因此该结果表明黑河27中的开花抑制物质更容易被解除，且不依赖光照时间的长短。这说明黑河27与自贡冬豆开花的差异可能源于开花抑制过程的调节，例如开花抑制基因的功能缺失等。图3—13自贡冬豆叶片GmFLC表达对日照长短的响应图3．14：黑河27叶片中GmFLC表达对日照长短的响应432，04321O“^肇Q．『co～坼∞∞'』Q×啦m>眷彤一∞芷54321O5432，ON艮卜o、co!s瓣墅Qxo岱^l_弼面芷 第九节GmFLC原核表达载体的构建及原核表达由于本实验所克隆得到的GmFLC属于MADSbox基因超家族，因此推测该基因可能编码一种转录因子对下游基因表达进行调控。为进一步研究GmFLC的功能，我们首先构建了其原核表达载体，以期得到该基因的原核表达产物，并制备抗体用于进一步研究。经过PCR、酶切、连接等操作，我们将连接有HIS．tag标签的GmFLC融合基因连接入pET-28a原核表达载体(图3—15)。将得到的阳性克隆扩繁，并用IPTG诱导蛋白表达发现，经诱导表达四小时后，目的蛋白表达量即达到最大。通过SDS—PAGE凝胶显示，在大约25KD处出现一条增加的条带，大小与GmFLC基因预测结果一直，表明该基因的原核诱导产物得到(图3—16)。+EcoRIG朋FLCNo“图3—15GmFLC原核表达载体的构建 警麟漱黼麟瓣瓣辩懒舞黪25KD赫,籀獭黼辩NC12345678i黛瓣25KjDmjClPTGelpTGel阱GClPTG_≈赣藏。孽ii鬻jij蒸《ll图3—16原核诱导袁达检测一蚕的虽自为进一步验证所得到的25KD蛋白是否为目的基因所表达，我们利用HIS—tag的抗体，通过westernblot的方法检测了所得蛋白。如图3．16所示，在25KD处有一条特异性蛋白带，表明诱导所得的蛋白的确为GmFLC表达。这为进一步纯化GmFLC-HIS融合蛋白提供了保证。第十节GmFLC真核表达载体的构建考虑到后期需要利用特异性较高的抗体进行染色质免疫共沉淀实验研究GmFLC调节的下游基因，我们在构建原核表达载体的同时，构建了GmFLC的真核表达载体，以表达具有天然结构的GmFLC蛋白。如图3．17所示，我们将GmFLC基因融合入pPIC9真核表达载体备用。 89lI{5’AOX—／18一GmFLcpPIC9一GmFLC(8750bp)。‘A。。‘89lI；图3—17真核表达载体构建55⋯S'．AO。X．蹲--Z—A,／,-EMcoR3‘AO×——●(8妒00虻0b9p)№。j№。～歹＼35AOX、、1一Bgl{l一+0lIlI■V 第四章讨论一、推测GmFLC基因可能具有类似于拟南芥FLC基因的功能在拟南芥开花调控网络中，MADS．box类的转录因子FLC处于枢纽地位[4】。FLC是开花的负调控因子，是植物开花调控的关键基因。自主途径、春化作用途径中有许多控制开花的基因，其功能都是通过调节FLC的表达来实现的。FLC通过分别结合到SOCl启动子的CArG盒上和F歹第一个内含子一段包含CArG盒结构的区域上抑制它们的表达，从而抑制花分生组织决定基因延迟植物成花【6一】。FLC主要在植物的根尖、茎尖等分裂活跃的组织中表达，其表达量与对开花的抑制程度呈正相关拟南：芥FLC编码MADS盒转录因子，含有7个外显子和6个内含子，是春化作用的一个关键基因，负调控拟南芥的开花进程，许多调控开花基因都是通过调节FLC来实现对拟南芥开花的转变‘231。拟南芥遗传分析表明春化作用促进拟南芥的开花进程主要通过改变开花抑制基因FLC染色质的结构来实现的，以表观遗传方式限制FLC的表达水平进而解除对下游开花基因的抑制实现开花的快速转变，春化作用引起表观遗传调节FLC对拟南芥开花产生的影响要远远超过其他方式的调节比如自主途径等，一旦FLC被低温抑制，就可以通过有丝分裂在当代保持稳定的抑制状态，在减数分裂产生下一代时才能重新激活进一步将所得基因的蛋白序列与拟南芥FLC蛋白序列对比发现，该基因编码的多肽序列与拟南芥FLC蛋白具有30．45％的同源性。但在MADSbox保守区则有非常高的同源性(80％)，说明所克隆得到的基因在功能上可能与拟南芥FLC相似(图3-2)。 二、黑河27与自贡冬豆开花条件和过程的不同并非因为GmFLC基因突变，推测是由其他途径导致通过对比预测自贡冬豆与黑河27的GmFLC序列，发现两个基因的序列完全一致，这说明该基因在这两个品种的大豆中是保守存在的。而通过对比这两个品种的CDS序列，发现两者基本一样，只表现出一个碱基的差别，在这两个品种的蛋白序列中，并未发现因这一CDS碱基差别引起的差异，因此推断这两个品种的突变为同义突变。这两个品种的大豆在相同条件下会表现出不同的开花过程，而两个品种开花所需要的条件也不尽相同，从遗传角度分析，导致这些差异的原因可能为序列上的差别。但是由于这两个品种的FLC序列几乎没有差异，因此推断引起这两个品种开花过程不同的原因并非GmFLC基因突变，有可能是由其他途径导致，抑或是其启动子的差异的原因。三、GmFLC在不同品种中的差异与开花的关系由于克隆得到的GmFLC与拟南芥FLC具有相同的结构域，因此GmFLC可能同样参与大豆开花等发育过程。为验证GmFLC在大豆发育过程中表达的变化，通过qRT-PCR的方法测定了其在不同发育时期、不同部位的表达。结果表明，GmFLC在叶片中有大量表达，并在花器官中有一定表达。同时，随着发育时间的推移，GmFLC在叶片中的表达逐渐降低。这说明GmFLC在大豆由幼苗期向成熟期转化的过程中起到一定作用。此外，GmFLC可能参与花的发育。在不同品种中，GmFLC基因的表达呈现了较大的差异。在黑河27中，GmFLC的表达不受光照长短的影响，且表达量非常低，而自贡冬豆则相反，受长日照影响，GrnFLC表达被大量促进，因此黑河27相比自贡冬豆呈现早熟特点。而在长日照条件下，自贡冬豆中GmFLC基因的表达量出现了明显的增加。但在黑河2757 中的变化则没有这么明显，直接导致长日照条件下自贡冬豆表现为不开花，而黑河27则都能开花。这说明GmFLC基因不同的表达量可能会对大豆开花产生(图3—13，图3—14)。四、GmI'ZC与植物昼夜节律的关系一直以来光周期现象都是人们进行植物生物学现象研究时的重点，尤其是分子生物学的快速发展为揭示这一重要的生物学现象提供了新的技术。以模式作物拟南芥为材料进行的遗传学分析，为揭示光周期及其敏感现象提供了很多理论上的依据。为了探索大豆光周期中的调控基因，我们同样分析了所克隆的GmFLC基因是否受到光周期的调控。自贡冬豆和黑河27由于长期受到自身环境的影响，逐渐进化出了对光周期不同的响应。这主要表现在黑河27对光周期不敏感，在短日长日下均能开花，而自贡冬豆则只能在短日照处理下开花，长曰处理时～直保持营养生长。这种差异可能在于两个品种间光敏基因的不同所致。为证明GmFLC基因是否具有节律性，我们用qRT-PCR的方法测定了GmFLC的表达是否具有节律性。结果发现，GmFLC的表达并没有节律性，其表达在短曰处理下有一定降低；然而，F丁的表达却具有光节律性，表现为光下降低，暗处理积累的现象。这说明GmFLC的表达可能不受光敏色素基因调节，因此不呈现节律性。这一点可能与拟南芥兕C的表达模式相类似。拟南芥中的研究发现，凡C嗵常受到春化或赤霉素的作用调节，使其表达：量降低进而促进拟南芥由营养生长像升值生长转变‘5引。由于大豆不受春化作用的影响，因此其表达可能存与拟南芥不同的调控模式。由此，探索抑制大豆开花的调控途径，可能有异于拟南芥和水稻等模式植物。 第五章结论通过初步的实验，从自贡冬豆和黑河27中克隆得到了一个MADS-box样基因，该基因与拟南芥FLC基因的N端具有很高的同源性，推测其可能为大豆GmFLC基因。通过对比自贡冬豆和黑河27中GmFLC的序列发现，其CDS序列存在一个同义突变，所编码的蛋白序列完全一致。进一步的qRT-PCR结果表明，GmFLC主要在叶片中表达，当短日处理时，随着发育过程其在叶片中的表达逐渐降低，并且在花中有一定表达。光周期实验表明，GmFLC不受光节律调控，但是其表达会受到光周期长短的影响：短日下受到抑制，长曰照下被促进。综上所述，克隆得到了一个MADS．box基因，该基因可能参与大豆生长发育的调节，并可能参与大豆花的发育。同时，这一基因可能与拟南芥FLC基因的调控模式和作用方式不同。 参考文献[1]BossPK，BastowRM，MylneJS，eta1．Multiplepathwaysinthedecisiontorowel‘enabling，promoting，andresetting[J]．PlantCell，2004，16：18—31．[2]种康，雍伟东，谭克辉．高等植物春化作用研究进展[J]．植物学通报，1995(5)：481—487．[3]SungS，AmasoinRM．Rememberingwinte：rtowardamolecularunderstandingofvemalization[J]．AnnuRevPlantBio，12005，56：491-508．[4]JohansonU，WestJ，ListerC，eta1．Molecularanalysisoffrigida，amajordeteIminantofnaturalvariationinArabidopsisfloweringtime[J]．Science，200(}，290(5490)：344—347．[5】Seafle，IheYTurckF，etaI．ThetranscriptionfactorFLCconfersafloweringresponsetovernalizationbyrepressingmeristemcompetenceandsystemicsignalinginArabidopsis[J]．GenesDev，2006，20：898—912．[6】MichaelsD，HEYScirteccikC，eta1．AttenuationofFloweringLocusCactivityasamechanismfortheevolutionofSummerannualfoweringbehaviorinArabidopsis[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2003，100：10102—10107．[7]Chandler,JWIlsonA，DeanC．Arabidopsismutantsshowinganateredresponsetovernalization[J]，PlantJ，1996，10：637—644．[8]袁秀云，张仙云，马杰，等安徽农业科学Sci．2010，38(2)：614．616[9]QuailPH．Phytochromephotosensorysignallingnetworks[J]．NatRevMolCeilBiol，2002，3(2)：85—93．[10】PutterillJ，LaurieR，Macknightr．Itistimetoflower：thegeneticcontrolofflo,a，eringtime[J]．Bioessays，2004，26：363—373．[11】曾群赵，仲华，赵淑清．植物开花时间调控的信号途径[J】．遗传，2006，28(8)：103l一1036[12】Ch￡mdler,JdeanC．Factorsinfluencingthevernalizationresponseandflowering60 timeoflatefloweringmutantsofArabidopsisthaliana(L．)【J】．JExpBot，1994，45：1279-1288．[13]Miguela，Greenr,NilssonO，eta1．GibberellinspromotefloweringofArabidopsisbyactivatingtheLeafypromoter[J]．ThePlantCel，1998，10(5)：791-800．[14]J．ALaw,S．E．Jacobsen，Nat．Rev．Genet．11,204(2010)．[15]AlboresiA，GestinC，LeydeckerMT，BeduM，MeyerC，TruongHN．2005．Nit-rate，asignalrelievingseeddormancyinArabidopsis．PlantCellEnviron．28：500-12[16]Ali—RachediS，BouinotD，WagnerMH，BonnetM，SottaB，eta1．2004．Changesinendogenousabscisicacidlevelsduringdormancyreleaseandmaintenanceofmatureseeds：studieswiththeCapeVerdeIslandsecotype，thedormantmodelofArabidopsisthaliana．Planta219：479-88【17]BentsinkL，SoppeW，KoornneefM．2007．Geneticaspectsofseeddormancy．SeeRefi20，pp．113—32【18]YuehuiHe，AmasinoRM，Roleofchromatinmodificationinflowering—timecontrol[J]．TrendsinPlantScience，2005，10(1)：30—35．[19]MichaelssD，AmasinorM．LossofFloweringLocusCactivityeliminatesthelate—floweringphenotypeofFRIGIDAandautonomouspathwaymutationsbutnotresponsivenesstovernalization[J]．PlantCell，2001，13(4)：935—941．[20]BastowR，MylnejS，ListerC，eta1．VemalizationrequiresepigeneticsilencingofFLCbyhistonemethylation[J]．Nature，2004，427，(6970)：164—167．A。A．Aravin，G．J．Harmon，ColdSpringHarb．Syrup．Quant．Bi01．73，283(2008)．[22]Ali—RachediS，BouinotD，WagnerMH，BonnetM，SottaB，GrappinP，JullienM．2004．Changesinendogenousabscisicacidlevelsduringdormancyreleaseandmaintenanceofmatureseeds：studieswiththeCapeVerdeIslandsecotype，thedormantmodelofArabidopsisthaliana．Planta219：479-488．【23]AlvaradoVBradfordKJ．2005．Hydrothermalanalysisofseeddormancyintrue(botanical)potatoseeds．SeedScienceResearch15：77—88．[24]DebeaujonI，KoornneefM．2000．GibberelfinrequirementforArabidopsisseedgerminationisdeterminedbothbytestacharacteristicsandembryonicabscisic61 acid．PlantPhysiology122：415--424[25]王稳琳，庞基良．拟南芥三尉，y基因的花发育中的网络调控及其生物学功能[J]．遗传，2004，(26)：137．142．[26】李建安，孙颖。林木成花分子基础研究进展[J】．经济林研究，2007，25(2)：66—70．[271胡方明，刘丽娜，李建安，等．拟南芥FLC基因抑制成花机理研究进展【J]．经济林研究，2007，25(4)：77—81[281洪薇，曹家树．FLC基因表达在植物春化过程中的作用[J]．植物学通报，2002，19(4)：406—411．[291刘丽娜，刘伟，叶庆生．春化作用相关基因FLC的研究进展[J】．西北植物学报，2003，23(12)：2229·2234．[30】杨传平，刘桂丰，魏志刚．高等植物成花基因的研究[J]．遗传，2002，24(3)：379—384．[3I】华志明，植物成花分子机理研究的迸展[J]．植物生理学通讯，1998，34(I)：74—79．[32]曹秋芬，孟玉平，孙毅，等．植物成花调控的分子遗传学[J]．中国生物工程杂志，：2003，23(1)：5·10．[33]Bu"’nningE：DieendogeneTagesrhythmikalsGrundlagederphotoperiodischenReaktion．BerDtschBotGes1936，54：590—607[34]PittendrighC，MinisD：Theentrainmentofcircadianoscillationsbylightandtheirroleasphotoperiodicclocks．．AmNat1964，108：261—195．[35]HayamaR，CouplandG：ThemolecularbasisofdiversityinthephotoperiodicfloweringresponsesofArabidopsisandrice．Plantphysiology2004，135(2)：677—684．[36】Vaz—NunesM，SaundersD：Photoperiodictimemeasurementininsects：areviewofclockmodels．JBiolRhythms1999，14：84—104．[37]Ga：merW，AllardH：Effectoftherelativelengthofdayandnightandotherfactorsoftheenvironmentongrowthandreproductioninplants．JAgricRes19·20．18：553—606．[38】GarnerWjAllardH：Furtherstudiesinphotoperiodism，theresponseoftheplanttorelativelengthofdayandnight．．，么gricRes1923．23(2)：871—920．[39]SunH，LiuYHuP’eta1．：CloningandcharacterizationofGmBFT,asoybeanBFThomologueencodingthephosphatidylethanolamine—bindingprotein，62 [40】[41]【42]【43】[44][45]【46】[47][48][49】[50][51]【52]MitochondrialDNA2008。LIX，WuC，MaQ，eta1．：MorphologyandAnatomyoftheDiferentiationofFlowerBudsandtheProcessofFloweringReversioninSoybeanCV．Zigongdongdou．312005，11：1437-1442．WuC，MaQ，YamK—M，eta1．：InsituexpressionoftheGmNMH7geneisphotopefiod—dependentinauniquesoybean(Glycinemax[L．】Merr．)floweringreversionsystem．Planta2006，223：725—735．BatteyN，LyndonR：Reversionofflowering．BotRev1990，56：162-189．韩天富，盖钧镒，王金陵，等：大豆开花逆转现象的发现．萨物学报1998，24：168．171．韩天富，王金陵：大豆开花后光周期反应的研究．植物≠投1995，37：863．869YanoM，KatayoseYAshikariM，etal：Hdl，amajorphotopefiodsensitivityquantitativetraitlocusinrice，iscloselyrelatedtotheArabidopsisfloweringtimegeneCONSTANS．PlantCell2000。12：2473—2484．LiuJ，YuJ，McIntoshL，eta1．：IsolationofaCONSTANSorthologfromPharbitisnilanditsroleinflowering．Plantphysiology2001，125：1821—1830．GriffithsS，DunfordR，CouplandGeta1．：TheevolutionofCONSTANS—likegenefamiliesinbarley,rice，andArabidopsis．Plantphysiology2003，131：1855。1867．TakahashiYShomuraA，SasakiT，eta1．：Hd6，aricequantitativetraitlocusinvolvedinphotoperiodsensitivity,encodestheasubunitofproteinkinaseCK2．Proc№以AcadSciUSA2001、98：7922—7927，韩天富，王金陵：大豆开花后光周期反应的研究．艚物学按1995，37：863．869．ThomasB，Vince-PrueD：PhotoperiodisminPlants．AcademicP他sS．SanDiego．翻。吲l997：63—84．WashburnC，ThomasJ：ReversionoffloweringinGlycinemax(Fabaceae)．AmJBot2000，87：1425—1438．ChristiansonM，WarnickD，CarlsonP：Amorpho—geneticallycompetentsoybean63 suspensioncultureScienceNew场纸Ⅳy1983，222：6322_6341[53jZhangZ，XingA，Staswick只ClementeT：TheLlgeofglufosinateasaselectiveagentinAgrobacterium．mediatedtransformationofsoybean。PlantCellTissOrgCultl999，56：37—46．[54】OlthoftP，SomerD：L-cysteineincreasesAgrobacterium—mediatedT-DNAdeliveryintosoybeancotytedonary-nodecells．Plantceltreports2001。20：706．711．[55]OlhoftPM，FtagelLE，DonovanCM,etal，：EfficientsoybeantransformationusinghygromycinBselectioninthecotyledonary—nodemethod．Planta2003，216(5)：723—735，[561、KoTS，LeeS，KrasnyanskiS，KorbanSS：Twocriticalfactorsarerequiredforefficienttransformationofmultiplesoybeancukivars：Agrobacteriumstrainandorientationofimmaturecotyledonaryexplant．TAGTheoreticalandappliedgenetics2003，107(3)：439-447。[57]HildebrandE：Lifehistoryofthehairy-rootorganisminrelationtoitspathogenesisOilnurseryappletrees．JAgricRes1934，48：857—885．【58】CtdltonM—D，TepferDA，PetitA，eta1．：AgrobacteriumrhizogenesinsetsT-DNAintothegeaomesofthehos￡plantrootcells．Nature1982，295(5848)：432—434．[59】KeresztA，LiD，Indrasumunm"A，NguyenCD，NontachaiyapoomS，KinkemaM，GresshoffPM：Agrobacteriumrhizogenes—mediatedtransformationofsoybearltostudyrootbiology．Natureprotocols2007，2(4)：948—952．【60】PetitA，DavidC，DahlGeta1．：Futherextentionoftheopineconcept：plasmidsinAgrobactefiumrhizogenescooperateforopinedegradation．．MolGenGenet1983，190：204—214．McCullenCA，BinnsAN：Agrobacteriumtumefaciensandplantcellinteractiortsa∞dactivitiesrequiredforinterkingdommacromoleculartransfer．Annualreviewofcellanddevelopmentalbiology2006，22：101—127． 致谢时光如梭，入学报到时校园中熙熙攘攘的景象还清晰的浮现于脑海中，我的研究生生活却已进入了尾声。回首这三年时光，自己成长了许多。从一个刚刚本科毕业的毛头青年，已渐渐成熟，慢慢成为一个真正的男人。这三年之中，成长最多的还是我的专业知识。从本科阶段粗略的学习到现在可以参与完成一个课题。这成绩不得不让我对所有指导和帮助过我的人表示深深的谢意。首先要感谢我的指导老师毕玉蓉教授，这篇论文就是在毕老师不厌其烦的悉心指导下完成的。在撰写论文的过程中，导师倾注了大量的心血和汗水。无论是在论文的选题、开题、构思、设计方面，还是在实际操作过程中对所遇到问题的解决方面，以及在论文的结构安排以及成文定稿方面，我都得到了毕老师悉心细致的教诲和无私的帮助。更重要的是，多年来她严谨的治学态度，广博深厚的学识，高度的敬业精神，敏捷的思维都使我终生受益。而且在生活中我也得到了毕老师无微不至的关怀和照顾。在此谨向毕老师表示我诚挚地感谢和深深的敬意!论文的顺利完成，也离不开纳小凡师兄对我在实验过程中的悉心指导。他从我开始实验一直到论文完成，都一步步的手把手教导我，使我从一个实验基础知识匮乏的学生变成现在可以独立完成实验的研究生。在论文撰写过程中，纳师兄更是不厌其烦的一个一个解答我的问题并提出各种解决办法，更重要的是在生活中纳师兄也扮演着一个大哥哥的角色，帮助我解决遇到的一切艰难困苦，在此我衷心的向纳师兄表示无比的谢意!感谢中国农业科学院国家大豆研发中心的韩天富、吴存祥、侯文胜、蒋炳军老师和于洋、岳岩磊、王秒、黄姗、韩祥东、刘玲娜等师兄、师姐和同学。没有他们的无私帮助，我的研究生论文将不会完成，没有他们的无私关怀，我的研究生生活也将没有这样丰富多彩，再一次感谢!还要感谢我的同窗好友史程圆、许东婷、周雅楠、刘明飞、乌日汗、马婷婷、刘冉、黄潇，我的室友孙雷、马帅、王向伟、柴汉魁、黄万成。没有他们的支持与帮助，我的研究生生活也不会顺利。最后感谢我的家人，我的女朋友蒋玉婷，我的各位朋友，衷心的谢谢你们!谢谢! 攻读学位期间发表的学术论文目录【1】燕瀚翔，纳小凡，毕玉蓉，等：表观遗传对植物开花相关基因的调控．现代农业科技．2012，6：34．36． 中央民族大学研究生学位论文作者声明本人声明：本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研究成果。对前人及其他人员对本文的启发和贡献已在论文中作出了明确的声明，并表示了谢意。论文中除了特另tlDl：l以标注和致谢的地方外，不包含其他人和其它机构已经发表或者撰写过的研究成果。本人同意学校根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等有关规定将本人学位论文向国家有关部门或资料库送交论文或电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权中央民族大学可以将本人学位论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复印手段和汇编学位论文(保密论文在解密后遵守此规定)。作者签名：趁翰蕴日期：卫!蔓年』月旦日