大豆光周期开花控制基因gmelf4的克隆及功能验证

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密级:硕士学位论文大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证作者姓名：史丹宁指导教师:孔凡江研究员中国科学院东北地理与农业生态研究所学位类别:工程硕士学科专业:分子生物学培养单位:中国科学院东北地理与农业生态研究所2015年5月 CloningandCharacterizationofPhotoperiodFloweringTimeControllingGeneGmELF4inSoybeanByDanningShiADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInPartialFulfillmentoftheRequirementFortheDegreeofMasterofEngineeringNortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofScienceMay2015 声明声明秉承研究所严谨的学风与优良的科学道德，本人声明文中除了特别加以标注和致谢的内容外，不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与本人合作的通知对本研究做出的贡献均已在文中予以明确说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者（签名）：日期： 保护知识产权声明保护知识产权声明本人完全了解中国科学院东北地理与农业生态研究所关于对研究生在研究所攻读学位期间撰写的论文知识产权保护的规定。本人撰写的论文是在导师的具体指导下，并得到相关研究经费支持下完成的。其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属于中国科学院东北地理与农业生态研究所。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为中国科学院东北地理与农业生态研究所。研究所有权保留学位论文及其电子版；研究所可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存本论文。（保密的论文在解密后也遵守此规定）论文作者（签名）：导师（签名）：日期： 目录目录摘要..............................................................................................................................................IAbstract...........................................................................................................................................III第一章绪论.....................................................................................................................................1第一节选题依据、目的和意义......................................................................................1第二节国内外研究进展..................................................................................................2一、植物生物钟研究进展..................................................................................................2二、大豆开花调控途径......................................................................................................5三、亚细胞定位技术..........................................................................................................7四、大豆遗传转化技术......................................................................................................8五、CRISPR/Cas9基因编辑技术......................................................................................9第二章材料与方法.......................................................................................................................11第一节试验材料..............................................................................................................11一、植物材料....................................................................................................................11（一）载体和菌株............................................................................................................11（二）主要试剂................................................................................................................11第二节试验方法..............................................................................................................12一、GmELF4候选基因的获得........................................................................................12（一）提取Corsoy和Kitamishiro植株RNA................................................................12（二）合成cDNA.............................................................................................................13（三）GmELF4候选基因克隆........................................................................................13（四）凝胶回收目的DNA片段......................................................................................14（五）目的片段连接T载体............................................................................................15（六）连接产物转化Trans-T1感受态细胞...................................................................15（七）菌落PCR检测重组质粒.......................................................................................15（八）质粒提取................................................................................................................16二、GmELF4基因及其相关基因的表达分析................................................................16（一）大豆植物材料处理................................................................................................16（二）荧光定量PCR........................................................................................................17三、GmELF4基因亚细胞定位.......................................................................................18 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证（一）相关溶液................................................................................................................18（二）拟南芥原生质体转化............................................................................................19四、大豆遗传转化载体构建...........................................................................................20（一）目的片段的制备....................................................................................................20（二）大豆遗传转化载体的制备....................................................................................21（三）目的片段连接大豆遗传转化载体........................................................................21（四）农杆菌EHA101热激感受态细胞的制备............................................................21（五）重组质粒转化至EHA101感受态细胞................................................................22（六）菌落PCR检测.......................................................................................................22（七）双酶切检验重组载体............................................................................................22五、CRISPR/Cas9载体构建...........................................................................................23六、大豆遗传转化...........................................................................................................26（一）相关培养基............................................................................................................26（二）根癌农杆菌介导的大豆遗传转化........................................................................28第三章结果与分析.......................................................................................................................31第一节GmELF4候选基因的克隆..................................................................................31第二节GmELF4基因的表达模式分析........................................................................34一、GmELF4基因的空间表达模式分析........................................................................34二、GmELF4基因的时间表达模式分析........................................................................35三、E1、E2、E3和E4对GmELF4的调控模式分析.................................................36第三节GmELF4的亚细胞定位......................................................................................38第四节GmELF4互补载体的构建................................................................................39第五节CRISPR/Cas9载体的构建................................................................................40第四章问题与讨论.......................................................................................................................43第五章全文总结...........................................................................................................................46参考文献.........................................................................................................................................47致谢............................................................................................................................................52 摘要大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证摘要大豆[Glycinemax（L.）Merr.]是我国重要的粮饲经济作物，在国民经济中起着重要的作用。提高大豆单产是大豆育种的主要目标。开花期和生育期是影响大豆生产潜力的重要因素。因此，研究大豆开花相关基因的功能，阐明调控大豆开花期的分子机制具有十分重要的科学意义和实践价值。本研究利用生物信息学，找出Tasma等（2001）报道的大豆开花期相关QTL的候选基因，通过分子克隆技术从Corsoy和Kitamishiro亲本克隆出GmELF4基因；通过荧光实时定量PCR技术，分析研究GmELF4基因在大豆中的时空表达模式；明确大豆光周期主效基因E1、E2、E3和E4对GmELF4基因的调控情况。构建GmELF4基因的融合表达载体，并利用拟南芥表皮细胞表达实验进行了亚细胞定位研究；构建GmELF4基因功能互补载体以及CRISPR/Cas9介导的基因沉默载体，有望获得大豆功能互补型和功能缺失型转基因植株。其主要研究结果如下：1.GmELF4候选基因的克隆利用生物信息学，找出Tasma等（2001）报道的大豆开花期相关QTL的候选基因Glyma.18G027500。Glyma.18G027500是拟南芥ELF4的同源基因。通过分子克隆以及生物信息学比较分析，结果表明GmELF4基因在两亲本间存在一个SNP位点，这个单碱基的突变导致DUF1313保守结构域上101位点的丝氨酸变成脯氨酸。虽然这个结构域的功能目前尚不明确，但是该结构域的改变很可能造成GmELF4编码蛋白功能改变。2.GmELF4的时空表达模式通过荧光实时定量PCR技术，分析表明GmELF4基因在大豆真叶、三出复叶、生长点等各组织器官中广泛表达，在叶片和生长点表达丰度高，可能参与开花过程。此外，GmELF4基因表达呈现24小时节律表达模式。在长日照条件下，其表达高峰出现在ZT16小时附近，而在短日条件下，其表达高峰出现在ZT12小时附近，表明GmELF4基因的节律表达模式受光周期调控。当将长日照条件下生长的植株移至连续光照条件下，GmELF4基因表达量升高，但依然呈现类似于长日照条件下的24小时节律表达模式，说明GmELF4基因受生物钟调控。I 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证3.E1、E2、E3和E4对GmELF4的调控模式分析通过荧光实时定量PCR技术，分析不同遗传背景下Harosory-NILs中GmELF4基因的表达模式，结果表明，在长日和短日条件下，E1都抑制GmELF4的表达，E3E4促进GmELF4表达；E2在长日条件下，抑制GmELF4的表达，在短日照条件下，促进GmELF4的表达。4.GmELF4的亚细胞定位将GmELF4连接至带有报告基因的融合表达载体pBSK中，与对照载体一起共转化拟南芥原生质体。结果显示，GmELF4在细胞质中特异性表达。5.GmELF4互补试验和基因沉默试验将GmELF4基因Corsoy型自身启动子加基因全长片段连接入大豆遗传转化载体pTF101.1中，以大豆品种黑农37（gmelf4）为材料，利用农杆菌介导的子叶节法进行大豆遗传转化。目前，正在进行大豆遗传中，预期能够得到功能互补型转基因大豆。利用CRISPR/Cas9技术对GmELF4基因进行DNA水平的编辑，以使GmELF4沉默，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能缺失型转基因苗。6.Corsoy和Kitamishiro群体构建为了进一步验证此开花期相关QTL的候选基因是GmELF4基因，我们以Corsoy作为母本，Kitamishiro作为父本进行杂交，构建近等基因系。打算进一步验证GmELF4基因时此开花相关QTL的候选基因。目前F4代已种植。综上所述，本研究利用生物信息学发现GmELF4是Tasma等（2001）报道的大豆开花期相关QTL的候选基因。GmELF4基因在两亲本间存在一个SNP位点，从而导致其DUF1313保守结构域上101位点的丝氨酸变成脯氨酸。GmELF4基因与拟南芥ELF4类似，其表达受光周期和生物钟调控。此外，E1抑制GmELF4的表达，E3E4促进GmELF4表达；E2在长日条件下，抑制GmELF4的表达，在短日照条件下，促进GmELF4的表达。因此，我们推测，GmELF4是此QTL的候选基因，参与大豆光周期调控开花途径，但还需进一步验证。关键词：GmELF4；光周期；CRISPR/Cas9；生物钟；QTLII AbstractCloningandCharacterizationofPhotoperiodFloweringTimeControllingGeneGmELF4inSoybeanAbstractSoybean[Glycinemax（L.）Merr.]isanimportantcropforhumanconsumptionandanimalfeedinChina.Floweringtimeandmaturitysignificantlyaffectsoybeangrainyield.Tounderstandfloweringpathwayinsoybean,therefore,functionalanalyzingthefloweringrelativegenesisvaluable.HerewedemonstratethatGmELF4isthecandidategeneoftheQTLcontrollingfloweringinsoybeandescribedbyTasmaet.al（2001）,usingbioinformatics,qPCRandmolecularcloning.TheonlydifferencebetweenCorsoyandKitamishiroatthecodingregionofGmELF4wasasinglenucleotidesubstitution（SNP）attheDUF1313domain.TheDUF1313domainofELF4isconservedacrossdiverseplantspecies.Thus,itislikelythatthesinglemutationattheDUF1313domainmayleadstolossofGmELF4functions.GmELF4waspresentthroughoutthedevelopmentofallorganswhenweanalyzedtranscriptionprofilesofGmELF4invarioustissuesofHarosoyplantsgrownunderLDconditionswithreal-timePCR.TheexpressionlevelofGmELF4exhibitsadiurnalrhythmwiththepeaksat16hafterdawnunderLDconditionsand12hafterdawnunderSDconditions,indicatingthatGmELF4isinvolvedinphotoperiodperception.WhentheplantsgrownunderLDconditionsweretransferredtoLLconditions,theGmELF4transcriptlevelscontinuedtooscillatewithaperiodof24h,showingthatGmELF4wasregulatedbythecircadianclock.Inaddition,GmELF4wasdown-regulatedbyE1andup-regulatedbyE3E4underLDorSDconditions.E2down-regulatedtheexpressionofGmELF4underLDconditions,whereasup-regulateditsexpressionunderSDcondition.TogainfurtherknowledgeregardingthefunctionoftheGmELF4protein,weconductedatransientexpressionassaytodetermineitssubcellulardistribution.ConfocalimagingshowedthattheGmELF4-eGFPfusionproteinwasdistributedprimarilyinthecytoplasm.TovalidatethefunctionofGmELF4forflowering,weintroducedtheCorsoyGmELF4alleledrivenbyitselfpromotorintopTF101andobtainedconstructpTF101-GmELF4.WealsoobtainedRNAiconstructbasedontheCRISPR/Cas9.Weareperformingthecomplementationofthegmelf4phenotypewithCorsoyGmELF4alleleusingsoybeancultivarHeinongIII 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证37andRNAiknockdownusingsoybeancultivarWilliams82.FurtherstudyisneededtorevealtheroleofGmELF4inregulatingthefloweringmechanisminsoybean.Keywords:GmELF4;photoperiod;CRISPR/Cas9;circadianclock;QTLIV 第一章绪论第一章绪论第一节选题依据、目的和意义植物的生长发育与外界环境影响密不可分。在植物整个生命过程中，有营养生长转化为生殖生长的最重要特征即为开花。植物开花受光照、温度等外界环境因素以及内在发育机制的共同调节，而影响开花期最重要的外界环境因素就是光照（Kobayashi等，2007）。光对于植物的作用主要以两方面实现，一是参与植物幼苗的光形态建成，二是引起光周期反应（王小菁，2003；Imaizumi等，2006）。生育期和开花期是光周期反应的重要指标，开花早晚以及生育期长短决定了大豆适宜种植的地理纬度区域及播种时间。大豆是人民生产生活中必不可少的粮食来源和经济作物，而我国大豆产量远不能满足巨大的需求量。大豆产量与光周期反应有密切关系，其作为短日照的典型作物，适宜种植区域被限制在比较窄的纬度范围内。所以提高大豆单位面积产量以及扩大适宜种植区域对于提高大豆产量有重要的意义。因此，研究光周期开花相关基因对于明确大豆的开花调控途径十分重要，能够为在分子水平上选育和定向改造适宜品种提供理论依据。迄今为止已确定与大豆生育期相关的基因有E系列的9个以及LJ。但是这些基因仍然不能完全解释大豆的光周期开花现象，所以探索光周期开花控制新基因并进行功能验证以及其与现已明确的光周期基因的关系是十分有必要的。本研究将在大量前期工作的基础上，拟利用构建近等基因系对光周期开花控制新基因进行精细定位，同时结合实验材料基因组测序得到新基因位点，进而克隆该基因，明确其表达特性及进行初步的功能验证，揭示该基因对大豆开花的影响。1 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证第二节国内外研究进展一、植物生物钟研究进展基于对模式植物拟南芥的研究表明，生物钟基因是生物体的内部起搏器，促使植物能够适应每天24小时内的黎明黄昏交替的节律。早期研究结果表明生物钟主要由输入途径、中央振荡器和输出途径组成（Eriksson和Millar，2003）。Hsu等（2014）对生物钟的研究结果发表了综述报道。生物钟包含一系列在特定时间发挥作用的基因，在早晨，两个类MYB转录因子，CCA1（CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1）和LHY（LATEELONGATEDHYPOCOTY）的在转录水平和蛋白水平都大量富集，且相互作用，同时抑制TOC1的表达。CCA1和LHY的表达被傍晚阶段元件TOC1（TIMINGOFCABEXPRESSION1）和PRR1（PSEUDO-RESPONSEREGULATOR1）抑制，并且PRR1与TOC1启动子区域的motif结合后形成傍晚成分EE（eveningelement）。TOC1是在傍晚富集，反过来又调控CCA1和LHY的表达，从而形成第一个反馈抑制环（Schaffer等1998；Strayer等1998；Wang等1998）。CCA1和LHY还是PRR9和PRR7的促进因子。PRR9，PRR7和PRR5以及TOC1在生物钟里起着中央作用。PRR9在早晨最先表达，之后PRR7，PRR5和PRR3逐一表达，最后TOC1在傍晚表达。PRR9、PRR7和PRR5反过来也抑制CCA1和LHY的表达，从而形成第二个反馈抑制环。几个CCA1和LHY的同源基因，REV4，REV6和REV8在下午表达，它们能够促进傍晚表达的基因（如PRR5，TOE1，GI和ELF4等）大量表达。而PRR5等又抑制REV8等表达，形成反馈抑制环。晚上，TOE1表达，且像其它PRR同源基因一样，抑制CCA1和LHY的表达。EE已与中央震荡器形成主要调控关系。大多数时钟组件可以调控EE，CCA1和LHY抑制EE，RVE4、RVE6和RVE8促进EE（Huang等，2012；Rawat等，2011；Alabadi等，2001），一些生物钟元件在它们的启动子区域通过EE被其它生物钟组件（PRR5、TOC1、LUX、ELF4、GI和PRR9）调控（Nagel和Kay，2012）。这种生物钟元件之间的相互调节确保了生物钟基因的有序表达，以及形成一个复杂的包括中央振荡器的互连网络。新出现的数据表明组蛋白修饰调控也在这个转录网络中起着重要的作用（Malapeira等，2012）。中央振荡器网络中2 第一章绪论细胞和组织特异性也有变化（James等，2008；Yakir等，2011）。例如，PRR3是TOC1稳定性的调制器，主要在脉管系统和在叶片具有略微不同的自由运行的不同类型细胞中起作用（Para等，2007）。已知几个生物钟元件与其他蛋白质的互作，这种互作在生物钟的调控作用中必不可少。正如前面提到的，CCA1和LHY对傍晚基因的抑制依赖DET1（Lau等，2011）。同样，PRR9，PRR7和PRR5与转录辅阻遏物物理互作，抑制CCA1和LHY的表达（Wang等，2013）。在细胞质中和在细胞核中，GI已经显示出具有不同的功能（Sawa和Kay，2011），其在细胞分区之间功能的划分是通过与ELF4的物理互作（Kim等，2007）。用远红光照射植物，设想PHYA是唯一的光受体。出人意料的是，是在远红光下生物钟基因的表达显著改变，随着傍晚基因表达的升高以及早晨基因表达的下降（Wenden等，2011）。通过突变体分析，ELF4被确定为一个参与这些远红光的影响的潜在基因。此外，研究显示PHYA信号通路的三个正调节子，FHY3（Far-redElongatedHypocotyl3），FAR1（Far-redImpairedResponse1）和HY5（LONGHYPOCOTYL5）在白天直接激活ELF4，从而提供一个线索，即远红光如何影响中央振荡器（Li等，2011）。虽然温度日变化可以影响生物钟，但是当植物在一系列不同的生理相关的温度下生长，其速度在很大程度上是不变的，这种现象被称为温度补偿（Harmer，2009）。其主要调控网络如下图1-1。3 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证图1-1拟南芥中生物钟基因转录水平上的调控网络（Hsu等，2014）Fig1-1TranscriptionalregulationofcircadianclockgeneinArabidopsis（Hsu等，2014）生物钟影响植物生长发育众多阶段，包括下胚轴的伸长和光周期调控的开花。而ELF4在这两个调控途径中起着重要的作用。Khanna等（2003）首先报道ELF4是光敏色素介导的抑制下胚轴伸长所需要的。生长过程就是昼夜控制下胚轴伸长的过程，外界环境和内部生物钟影响生长过程中的节律。生物钟参与协调节律性下胚轴生长至少有四个通路，其中包括光，蔗糖，激素信号传导途径和生物钟元件本身的直接作用。总之，这四个通路汇集了bHLH（basichelix–loop–helix）转录因子、PIF4（PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR4）和或PIF5，促进下胚轴伸长。首先，夜间复合物生物钟蛋白（ELF3，ELF4和LUX）在晚上直接抑制PIF4和PIF5表达，因此产生了PIF4和PIF5转录峰值出现在深夜和清晨的昼夜节律（Nusinow等，2011）。此外，光和蔗糖控制PIF蛋白质的稳定性：在红光下PHYB促进PIF4和PIF5的降解，而高蔗糖含量稳定PIF5（Stewart等，2011）。生物钟影响光敏色素的信号和糖代谢，生物钟系统在多个水平上影响PIF4和PIF5的丰度（Yamashino，2013）。4 第一章绪论EC复合物同时调控白昼基因PRR9的表达，从而产生生物钟表达节律（Dixon等，2011；Helfer等，2011）。如果EC复合物中任何组分的突变都会导致植物生物钟失调（Nagel和Kay，2012）。elf3，elf4和lux突变体会出现提早开花的表型（Scialdone等，2013），证明ELF4参与生物钟节律的调控同时调控开花。尽管对模式植物拟南芥中生物钟了解地比较全面，但是生物钟在其他农作物中的重要性越来越明显（McClung，2013）。许多作物物种经历全基因组倍增，随后大量基因丢失或者成倍增加。有作物芜菁的研究表明，生物钟基因，包括PRR和RVE家族基因，在这个过程中被优先保留，也许是因为基因剂量的限制（Lou等，2012）。大量研究表明，生物钟对农艺性状起着重要的作用。例如，开花时间的光周期控制是一个决定作物性能的关键因素。在光照-1基因，PRR7的同源基因，在大麦[Hordeumvulgare]和小麦[Triticumaestivum]中参与开花调控（Shaw等，2012）。最近，据报道水稻[Oryzasativa]ELF3（OsELF3），在长日照时控制抽穗期（Yang等，2013）。两项研究也报道说，一个短生长季商业大麦品种携带一个突变的ELF3同源基因，使得这个大麦品种从营养到生殖生长的转变加快，可以在短生长季地区种植（Zakhrabekova等，2012；Faure等，2012）。另一个大麦的早熟品种很可能是与拟南芥生物钟LUX的同源基因突变有关（Campoli等，2013）。此外，在小麦和高粱[Sorghumbicolor]的研究还已经确定，生物钟是控制光周期开花基因的关键。除了传统育种，通过操控生物钟基因的转基因方法提高产量也获得了成功。在大豆中，一个与拟南芥同源的调节生物钟的B-box结构域基因（AtBBX32），调节生物钟同源基因的表达并且显著增加产量，可能是通过调节生殖发育关键阶段的时间（Preuss等，2012）。二、大豆开花调控途径大豆属于典型的短日照作物。对大豆开花调控途径主要集中在光周期调控途径。目前研究表明，10个成熟期位点调控大豆的开花以及成熟期，分别为E1和E2（Bernard，1971），E3（Buzzell，1971），E4（Buzzell和Voldeng，1980），E5（Mcblain和Bernard，1987），E6（Bonato和Vello，1999），E7（Cober和Voldeng，2001），E8（Cober等，2010），E9（Kong等，2014），以及LJ（Ray5 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证等，1995）。在这些位点中，E1、E2、E3、E4已经被克隆。其中，E1是一个豆科植物特有的重要生育期基因，是大豆光周期调控开花的信号通路的核心，E1基因对于大豆开花的抑制作用在已明确的E系列光周期相关基因中效用最强；E2被鉴定是拟南芥GI的同源基因（Watanabe等，2011）；E3基因和E4基因被确定为PHYA的同源基因（Liu等，2008；Watanabe等，2009）。Mcblain和Bernard1987年的报告显示E5位点对于花期和生育期的延长作用大致和E2位点相同。E7位点能够在白炽灯（远红光丰富）长日照条件下延长花期和生育期（Cober等，2001）。E6位点和LJ位点在短日照条件下能够缩短开花期和生育期，E6位点和LJ位点的隐性性状是大豆适应低纬度地区延长生育期提高产量的必要性状（Bonato等，1999；Ray等，1995）。E8基因从一个早熟大豆材料中分离出来，被定位在C1连锁群上的Sat_404和Satt136之间，显性纯合的E8基因会延长大豆的生育期（Cober等，2010）。E1对E9存在上位效应，E9通过促进FT表达促进大豆开花。大豆光周期调控的开花途径中FT的表达同样受保守的CO-FT调控途径所控制（Fan等，2014），即通过光受体感受光周期信号，通过昼夜节律钟系统进行调节，随后影响下游基因CO、FT的表达进而调节植物开花途径。大豆植物光受体蛋白包括GmPHYA、GmCRY1、ZEITLUPE（ZTL）、FLAVIN-BINDINGKELCHREPEATF-BOX1（FKF1）和LOV-KELCHPROTEIN2（LKP2）（Hecht等，2005；Quecini等，2007）。迄今，大豆中已经鉴定出了许多与拟南芥同源的中央振荡子相关联的重要基因（Liu等，2009）；中央振荡子为功能部分冗余的MYB样转录因子，LATEELONGATEDHYPOCOTYL（LHY）和CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1（CCA1）（Hecht等，2005；Quecini等，2007），他们能够调控TOC1及GI的表达水平，TOC1/PRR1是伪应答调控蛋白（pseudo-responseregulator，PRR）家族的时钟特异性转录因子，而GI是植物脉管特异性表达蛋白，但这两种蛋白的分子功能和作用机理人们还尚不清楚。清晨时LHY和CCA1表达水平达到最高峰，白天开始时LHY和CCA1的蛋白量逐渐增加并抑制白天TOC1和GI的表达，这是因为CCA1和LHY直接与TOC1内9bp的夜晚元件（EE，theeveningelemnt，AAATATCT）结合并抑制启动子的转录活性（Alabadi等，2001；Gendron等，2012）。另外，TOC1是LHY和CCA1基因表达所必须的促进因子，所以LHY和CCA1基因的表达量会随着6 第一章绪论TOC1的表达抑制出现下调；到夜晚时，LHY和CCA1蛋白量减少到最低程度，从而可解除对TOC1基因表达的抑制作用。在黑夜条件下，由于TOC1基因表达上调，TOC1蛋白量逐渐升高，再次启动LHY和CCA1基因的表达，因此凌晨时转录水平达到最高峰，从而进入下一个循环（周期）（Gendron等，2012；Pokhilko等，2012）。最近研究证实，LHY/CCA1对夜晚表达的TOC1，LUX，ELF3和GI都存在抑制作用（Pokhilko等，2012）。另外两个类似的调控环路也是如此，凌晨时LHY和CCA1激活PRR5、PRR7和PRR9的表达，而随后PRR5、PRR7和PRR9又反馈抑制LHY和CCA1的表达（Farre等，2005；Nakamichi等，2010）。大豆基因组中拥有4个MYB转录因子LHY1/CCA1样的基因，所以这些基因每日节律性的表达变化，意味着这些基因在大豆中也发挥着核心震荡子的作用（Liu等，2009；Thakare等，2011）。所以，在大豆中已经发现一些同源基因，其功能的解析有助于理解大豆的生物钟在光周期中的分子机制。实验室前期研究已经成功克隆大豆结荚习性控制基因GmDt1（Liu等，2010）及调控大豆生育期相关的E1（Xia等，2012）、E3（Watanabe等，2009）和E4（Liu等，2008）基因，以及开花调控基因FT2a和FT5a的过程中，对光周期调控大豆开花途径的信号通路有了更为深入的了解。即使生物钟在不同物种之间的基本运行模式可能是相似的，但是除了模式生物拟南芥，人们对各个物种中的生物钟运行机制甚至组成尚不明确（Song等，2010）。大豆作为重要的粮食及经济作物，生物钟的明确与其产量及其他重要农艺性状直接相关，而对大豆生物钟相关基因及调控通路的研究还是不够清晰明确，所以对大豆光周期开花以及生物钟相关基因表达模式和功能验证以及与其他基因的相互关系对于大豆产量质量的提升具有十分重要的意义。三、亚细胞定位技术高等生物体行使功能的最基本单位是细胞。真核细胞中的亚细胞结构十分复杂，细胞中存在数以几十计的细胞器，特定的蛋白在特定的细胞器中行使相应的功能，维持生物体的功能运转。即不同的蛋白会定位于不同的亚细胞结构内，而他们的功能也不尽相同（Emanuelsson等，2001）。故通过亚细胞定位技术可以为初步分析蛋白功能。7 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证近年，亚细胞定位技术通过不断完善发展，主要形成免疫组织化学定位、共分离标记酶辅助定位、蛋白组学定位以及融合报告基因定位几种方法（邢浩然等，2006）。融合报告基因定位由于操作简单、成本低廉、适用性强、实验周期较短等优点，是较常用的亚细胞定位技术。融合报告基因定位是将目的蛋白基因与便于检测的报告基因构建形成融合表达载体，检测报告基因表达产物来定位目的蛋白。目前应用比较广泛的报告基因表达产物为绿色荧光蛋白（GFP）和β-葡糖苷酸酶（GUS）。GFP能够催化自身形成发色结构，蓝光激发下可以发出绿色荧光，它与目标蛋白结合，作为荧光标记分子能够被观察到，即可以特异地进行目标蛋白的亚细胞定位。GFP在蛋白的C端或N端可以融合且保持天然蛋白特性，并且灵敏性高，对活体细胞无毒性。近年，人工改造GFP形成具有更高灵敏度和荧光强度的增强型GFP（EGFP）。用Thr替代Ser65，用Leu替代Phe64，EGFP荧光强度提高了35倍（Cinelli等，2000）。本研究中使用带有EGFP报告基因的融合表达载体，将目标片段插入构建GmELF4融合表达载体，将载体共转化拟南芥原生质，孵育后以激光共聚焦显微镜观察。四、大豆遗传转化技术分析基因功能最直观的手段即是进行遗传转化，构建遗传转化载体，将目的基因片段连接至遗传转化载体，将重组载体转化至植物体内，观察植物的表型是否发生变化，可能会导致原有表型增强或减弱、原有表型消失或新表型出现，以此来验证目的片段的功能。农杆菌介导的遗传转化技术第一次应用是在烟草中，Zambryski等首次实现这一技术，并且成功第一次得到烟草转基因植株（Brich等，1997），此后遗传转化成为进行基因功能验证的最重要最有效手段之一。自19世纪开始，科学家一直致力于大豆遗传转化及组织培养技术的提升与研究，但是时至今日，大豆遗传转化依然是一项技术性的难题，主要原因是大豆组织在组织培养中难以再生，不同转化批次之间的重复性较差，且在不同大豆品种之间存在转化效率的差异较大等问题。目前大豆遗传转化的方法主要有PEG法、基因枪法、电激法、农杆菌介导法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道8 第一章绪论法等。其中，农杆菌介导法是最常用的大豆转基因方法。用农杆菌介导的大豆转基因研究从野生型植株开始，Owens等研究大豆品种对农杆菌的敏感性（Owens等，1985），Byrnemi等用21个大豆品种研究了不同大豆与农杆菌之间的相互关系（Byrnemi等，1987）。王罡等的研究表明不同的大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在着较为显著的差异（王罡等，2002）。王连铮等利用致癌农杆菌的15个菌种对2759个大豆品种的致癌能力进行了研究，筛选出了7个致癌能力较强的菌种（王连铮等，1984）。农杆菌介导的大豆遗传转化技术近年来通过各种实验技术手段不断改良提升，例如加入硫醇类化合物（Paz等，2006），AgNO3（Wang和Xu，2008）和表面活性剂（Liu等，2008）作为辅助试剂；改变筛选策略，引入bar基因（Zhang等，1999；Flores等，2008）；使用超声波、针簇和刷子（Santarem等，1998；Xue等，2006；Yamada等，2010）。农杆菌介导法的遗传转化效率在以上改良下逐步提高（Cao等，2011），效率能够达到3%以上。五、CRISPR/Cas9基因编辑技术基因编辑技术是指，对DNA序列进行敲除、修改、插入等操作。此前，基因编辑可以通过物理诱变、化学诱变以及同源重组的方法来实现。物理和化学诱变只能随机突变DNA序列，不能保证诱变一定能达到突变的目的，更不能对DNA进行精确操作。同源重组能够对指定DNA片段进行精确操作，但是需要构建重组载体进行转化，整个操作过程周期较长，可能造成目的片段的丢失，且成本较高。CRISPR/Cas9系统来源于细菌中，用于应对诸如病毒等外来DNA。细菌基因组中存在一系列成簇排列的规律间隔成簇短回文重复序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR），CRISPR被发现与一些噬菌体的DNA序列相同，当序列转录形成RNA后，可以与一类Cas蛋白形成复合物，并对Cas蛋白起到导向作用，故这段RNA因其作用被称为导向RNA（guideRNA，gRNA），当上述复合物检测到与gRNA序列一致的入侵外源DNA时，Cas蛋白即可切割外源DNA，使其片段破碎从而达到防御目的（Cong等，2013）。JenniferA.Doudna等在2012年提出了一个CRISPR（TypeII）系统，一个巨9 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证大的160KD的蛋白Cas9利用RNA，可以完成识别和切割靶向的DNA（Jennifer等，2012），为现在CRISPR/Cas9的应用奠定了最根本的基础。随后有报道在哺乳动物细胞的应用，并对CRISPR/Cas9系统进行进一步改进，利用该技术，可以方便高效廉价地在细胞上做基因编辑。目前已经有研究者将CRISPR/Cas9系统用于植物DNA编辑，但是尚无应用于大豆的报道。本研究的技术路线：10 第二章材料与方法第二章材料与方法第一节试验材料一、植物材料大豆品种Corsoy、Kitamishiro、黑农37；Harosoy（PI548573）及其近等基因系e3（PI547716；H-e3），e4（PI591435；H-e4），e3/e4（PI546043；H-e3/e4）。（一）载体和菌株克隆载体pEASY-BluntCloningVector自北京全式金公司购买。大肠杆菌Trans-T1感受态细胞自北京全式金公司购买。亚细胞定位载体pBSK，农杆菌菌株EHA101以及大豆遗传转化载体pTF101.1，由中国科学院东北地理与农业生态研究所大豆分子设计育种重点实验室保存。pYLCRISPR/Cas9-DB菌种（TOP10F’）及CRISPR/gRNAvectors菌种（DH10B）由华南农业大学生命科学学院刘耀光教授惠赠。（二）主要试剂TransEasyTaq聚合酶、dNTPs自北京全式金公司购买；KOD-plus-Neo高保真聚合酶自上海东洋纺公司购买；2×TaqMasterMix自康为世纪公司购买；限制性内切酶自NEB公司购买；SYRBRealTimeMix自Takara公司购买。AS、Asp、Cys、Glu、Glufosinate、MES、Na-thiosulfate、Phytagel、Washedagar、X-Gluc以及植物生长调节物质等产品自Sigma公司购买；Timentin自中科瑞泰公司购买；潮霉素（Hygromycin）自罗氏公司购买；MS盐以及B5盐和B5有机自Phytotech公司购买；一次性培养皿自CORNING和Fisher公司购买；医用胶带自3M公司购买；11 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证封口膜自PARAFILM公司购买。胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒为Axygen产品；反转录试剂盒为Invitrogen产品。其它化学类药品均为国产分析纯。第二节试验方法一、GmELF4候选基因的获得（一）提取Corsoy和Kitamishiro植株RNA1.叶片取样：分别盆栽种植携带有ELF4基因突变类型及非突变类型的大豆材料，取植株三出复叶的顶叶，用液氮冷冻，然后转移至-80℃超低温冰箱。2.相关一切实验用品预先用DEPC水过夜浸泡，120℃高压湿热灭菌20min，60℃烘干冷却备用。3.取少量大豆叶片材料在液氮冷冻条件下研磨至细粉状，用药匙将研磨粉末小心移至1.5mleppendof管内。4.加入1mlTrizol试剂，剧烈混匀；室温，静置5分钟；5.4℃，12000rpm，离心1min，取上清，加入200μlTris-平衡酚，200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5分钟；6.4℃，12000rpm，离心10min，此时样品分为三层，上层为水相，下层为有机相，中间层是蛋白质，RNA主要集中在水相中，吸取上清液于一个新的1.5ml离心管；7.加入0.2倍体积的氯仿萃取，涡旋震荡，4℃，12000rpm，离心10min，取上清至新的1.5ml离心管，重复一次。8.加入等量的异丙醇（约500μl），混匀，置于-20℃静置1h以上沉淀RNA；9.4℃，12000rpm，离心15min，小心去上清，加入270μlddH2O，30μlDNAbuffer，2μlDNase，置于37℃中处理DNA1h；10.加入200μl酚，200μl氯仿，剧烈震荡后，4℃，12000rpm，离心10min，取上清至新的1.5ml离心管，重复一次；11.加入1/10体积3M醋酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，-80℃静置1h；12 第二章材料与方法12.4℃，12000rpm离心15min，小心去上清，用75%乙醇清洗沉淀；13.吸出乙醇，干燥后DEPC水溶解。14.总RNA质量电泳检测。同时以定量Marker估测RNA浓度，保存于-80℃超低温冰箱。（二）合成cDNARNA作为模板，合成cDNARNA（200ng/μl）5μl50μMoligo-dT2μl10mMdNTP1μlddH2O5μl混合物，65℃，5min，冰上5min。而后进行：5×First-StandBuffer4μl0.1MDTT2μlM-MLV1μlPCR仪：42℃60min99℃1min（三）GmELF4候选基因克隆在phytozome上查得基因Glyma.18G027500以及Glyma.18G042000序列，将反转录得到的cDNA做为模板。引物：18G027500-F:TGTCTGACCCAACAAAACTT18G027500-R:CTTTTCACCGTCCTTATCG18G042000-F：GTTGGAGGAATCTTGTATGT18G042000-R：AAGGTGGTGGTGGTGATAGTPCR反应体系cDNATemplate1μlKODPlusNeo10×Buffer2μl2mMdNTPs2μl13 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证25mMMgSO41.2μlPrimerF（10mM）0.6μlPrimerR（10mM）0.6μlKODPlusNeoDNAPolymerase1μlddH2O12.1μlPCR反应条件：94℃2min98℃10s55℃30s35cycles72℃20s72℃5min15℃∞反应结束后，电泳，回收目的片段。（四）凝胶回收目的DNA片段1.紫外线照射下，将含有目的片段的琼脂糖凝胶切出。2.将切下的含有DNA条带的凝胶放入2mleppendof管，加入3个凝胶体积的BufferDE-A溶液。3.置于75℃金属浴中6-8min（直至胶完全溶解），每2-3min颠倒混匀一次（DE-A溶液为红色可以帮助观察）。4.加入1/2Buffer-A体积的Buffer-B，而后溶液变为均一黄色。5.将上一步所得到的液体吸出，加入离心套管滤芯中，12000×g，1min，外层离心管中流出液丢弃。6.500μl，BufferW1，12000×g，1min，外层离心管中流出液丢弃。7.700μl，BufferW2，12000×g，1min，外层离心管中流出液丢弃。8.重复上述步骤一次。9.不加液体，12000×g离心套管空离1min。10.滤芯转移到干净1.5mleppendof管中。向离心套管滤芯中心加25μl65℃预热的Eluent或去离子水，以提高洗脱效率，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。14 第二章材料与方法（五）目的片段连接T载体反应体系：PCR产物2μlpEASY-BluntCloningVector1μl无菌水2μl轻轻混合，室温（20℃-37℃）反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上。（六）连接产物转化Trans-T1感受态细胞1.加连接产物于50μlE.coli感受态细胞，移液枪吹打温和混合，置于冰中30分钟。2.42℃水浴30秒，立刻转移至冰中2分钟。3.加0.5ml25℃状态的LB液体，37℃，转数200rpm，1h。4.4μl的500mMIPTG+20μl的20mg/mlX-gal，混匀加到LB平板上，在37℃放置30min，待IPTG，X-gal被吸收后备用。5.4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，用移液枪吹打混合后取全部剩余菌液涂板，37℃，平板封口倒置12h以上。（七）菌落PCR检测重组质粒蘸取白色单菌落为模板，用通用引物M13进行PCR检测PCR反应体系如下：2×TaqMasterMix5μlPrimerF0.5μlPrimerR0.5μlddH2O4μlPCR反应条件：94℃4min94℃30s55℃30s35cycles72℃30s72℃5min15℃∞15 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证电泳检测结果。（八）质粒提取1.已确定正确的阳性克隆，5ml液体LB培养基，37℃，振荡过夜190rpm培养。2.取培养过夜后菌液1-4ml，12000×g离心1min，收集菌体，尽可能去尽上清。3.加入250μl溶液BufferS1（加入RNase），涡旋剧烈震荡至菌体溶液为悬浊液。4.加入250μl溶液BufferS2，而后迅速温和并充分地上下翻转4-6次，使菌体充分裂解，直至溶液呈透亮。此步骤不宜超过5min。5.加入350μl溶液BufferS3，温和并且充分地上下翻转6-8次使其充分混匀，随后出现白色沉淀，室温静置2min，12000×g离心10min。6.小心吸取上一步骤中上清液转移至离心套管滤芯，12000×g离心1min，外层离心管中流出液丢弃。7.将离心套管滤芯置回eppendof管，加入500μlBufferW1，12000×g离心1min，外层离心管中流出液丢弃。8.将离心套管滤芯放入2mleppendof管，加入700μl含无水Etoh的BufferW2，12000×g，1min，外层离心管中流出液丢弃；重复上述操作，700μlW2溶液洗涤一次，外层离心管中流出液丢弃。9.将离心套管滤芯放入2mleppendof管中，12000×g，2min，以去除残留的乙醇，防止对后续实验产生影响。10.将离心套管滤芯转移至新的1.5mleppendof管中，在滤芯中央加入60μl65℃预热的Eluent或去离子水，以提高洗脱效率，25℃室温条件下1分钟。11.离心机12000×g条件下1分钟，洗脱滤芯中的DNA，测定浓度。二、GmELF4基因及其相关基因的表达分析（一）大豆植物材料处理节律表达取样：分别在长日照条件下（16h光照/8h黑暗）及短日照条件下16 第二章材料与方法（12h光照/12h黑暗）种植大豆品种Harosoy，出苗后，待植株三出复叶展开，取1片幼叶。空间表达取样：短日照条件下（12h光照/12h黑暗）种植大豆品种Harosoy，对三出复叶、生长点、根、下胚轴、真叶等7个部位取样。Harosoy及其近等基因系取样：分别在长日照条件下（16h光照/8h黑暗）及短日照条件下（12h光照/12h黑暗）种植大豆品种Harosoy及其近等基因系，出苗后，待植株三出复叶展开，取1片幼叶。提取上述取样材料的RNA并反转录成cDNA，根据GmELF4基因序列设计RT-PCR特异引物进行表达分析。引物：GmELF4-RT-F：GGAATTCGCCCTCATATATAAGAACAAGGGmELF4-RT-R：ACGCGTCGACCAGATTGTGTTTCGCTGGTTG内参基因Tublin引物：Tub-F：GAGAAGAGTATCCGGATAGGTub-R：GTTTCCGAACACTCAAGCTC（二）荧光定量PCR反应体系：2×SYBRpremix5μl10μlprimerF0.5μl10μlprimerR0.5μlcDNA模板4μl反应条件：95℃10s95℃10s60℃30s40cycles72℃20s72℃30s15℃∞溶解曲线定义为从60℃到95℃，读板0.5℃/s。17 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证三、GmELF4基因亚细胞定位根据GmELF4的CDS序列，去除序列的终止密码，设计带有酶切位点的引物，并将带有双酶切位点的插入片段克隆，然后用PCR产物纯化试剂盒回收。用EcoRI和XbaI双酶切pBSK质粒，用T4连接酶将插入片段连接到pBSK质粒上构建GmELF4-pBSK载体。（一）相关溶液1.纤维素酶解液试剂15ml酶液体系1-1.5CellulaseR10（YaKultHonsha）0.225g干粉0.2-0.4%MecerozymeR10（YaKultHonsha）0.045g干粉0.4Mmannitol1.09g干粉20mMKCl1ml0.3MKCl母液20mMMES，pH5.71ml0.3MMES，pH5.7母液水10ml10mMCaCl1ml0.15MCaCl20.1%BSA1ml1.5%BSA（4℃保存）5mMβ-Mercaptoethanol1ml75mMβ-Mercaptoethano母液过滤灭菌，待用2.PEG4000溶液配置后的溶液保质期为五天，现用现配，100μlPEG4000溶液可以进行一个样品的实验。PEG40001g水0.75ml0.8Mannitol0.625ml1MCaCl20.25ml3.W5溶液W5（1000ml）154mMNaClNaCl9g125mMCaCl2CaCl2.H2O18.4g5mMKClKCl0.37g18 第二章材料与方法5mMglucoseglucose0.9g0.03%MESMES0.3gKOH调节pH，120℃，高压湿热灭菌20min，室温保存。4.MMG溶液（pH5.6）MaMg溶液（500ml）15mMMgCl2MgCl0.71g0.1%MESMES0.5g0.4MmannitolMannitol36.5gKOH调节pH，120℃，高压湿热灭菌20min，室温保存。5.WI溶液WI（200ml）0.5MMannitolMannitol18.217g4mMMES，pH5.7MES0.3g20mMKClKCl0.12g120℃，高压湿热灭菌20min，室温保存。（二）拟南芥原生质体转化1.选取未开花拟南芥叶片裁成1mm条形。2.将裁后叶片放入酶解液。3.无光条件下真空处理半个小时。4.无光条件下静置3小时。5.酶解液呈现绿色时柔和晃动令原生质体脱离。6.用显微镜观察，视野内可见40μm左右原生质体即为正确，可以用W5溶液稀释。7.W5溶液预先浸润尼龙膜或镍丝网筛，过滤。8.50ml圆底离心管，100×g，2min。9.弃掉上清液，预冷W5溶液轻柔重悬。10.放入冰中30min。11.100×g，8min，弃掉上清液。12.1ml的MMG溶液重悬，20μg融合载体质粒，110μlPEG溶液，温和混合，静置10min。19 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证13.向混合液中加入420μlW5溶液，温和颠倒混合液体。14.100×g，2min，弃掉上清液。15.1ml的W5溶液重悬洗涤，100×g，2min，弃掉上清液。16.1ml的WI溶液温和重悬。17.室温过夜培养。四、大豆遗传转化载体构建（一）目的片段的制备用来自Corsoy中的GmELF4cDNA作为模板，将自身启动子及基因克隆，构建大豆遗传转化功能互补载体。GmELF4-Promoter-F：GGGTAAGTGAAAACAGTAGAAGmELF4-Promoter-R：CTTTTCACCGTCCTTATCGcDNATemplate1μlKODPlusNeo10×Buffer2μl2mMdNTPs2μl25mMMgSO41.2μlPrimerF（10mM）0.6μlPrimerR（10mM）0.6μlKODPlusNeoDNAPolymerase1μlddH2O12.1μl电泳检测结果，凝胶回收纯化目的DNA片段。将目的DNA片段连接至pEASY-BluntCloningVector，转化入大肠杆菌，提取质粒进行测序检验。用XbaI和SacI双酶切已构建并测序正确的pEASY-BluntCloningVector，反应体系：质粒DNA0.5μl10×NEBBuffer1μlXbaI0.2μlSacI0.2μlddH2O8.1μl20 第二章材料与方法37℃条件下酶切6h，完全酶切获得GmELF4自身启动子及基因全长片段。酶切结束后，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段进行纯化。（二）大豆遗传转化载体的制备pTF101.1质粒0.5μl10×NEBBuffer1μlXbaI0.2μlSacI0.2μlddH2O8.1μl37℃水浴6h，酶切，电泳，回收目的片段，纯化。（三）目的片段连接大豆遗传转化载体GmELF4基因片段1.5μlpTF101.11.5μl2×ligationbuffer5μlT4DNAligase1μl16℃，金属浴，连接，过夜。（四）农杆菌EHA101热激感受态细胞的制备1.用接种环挑取-80℃冻存的EHA101甘油菌在YEP固体培养基平板（含利福平50mg/L）上划线，28℃培养，直至长出单克隆；2.用牙签或接种环挑取农杆菌单克隆加入3ml的YEP液体培养基中，28℃过夜培养。3.取10-1000μl培养液转移至100mlYEP培养基中（使用300ml三角瓶），28℃培养至OD600=1.0左右。4.将三角瓶置于冰上10min。5.3500rpm，4℃离心10min收集菌体。6.加入预冷的20mMCaCl2溶液1ml，用切头枪头轻轻悬浮。7.将1.5ml离心管提前标记名称且放入冰中预冷，将感受态细胞按每管50μl分装。21 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证8.将离心管用液氮冷冻后置于-80℃保存。（五）重组质粒转化至EHA101感受态细胞1.将水浴锅设置为37℃备用。2.在冰中将感受态细胞融化至冻融状态。3.取1-2μl（约几十ng）质粒加入感受态细胞中。4.用移液枪轻轻悬浮后，在冰中放置30min。5.将离心管放入37℃水浴锅中5min。6.加入1mlYEP液体培养基，混合均匀后将离心管置于28℃180rpm条件下培养2h。7.10℃，3500rpm离心10min收集菌体。8.弃掉上清液，用剩余100μl左右的YEP液体培养基轻轻悬浮细胞。9.在含有Kanamycin（50mg/ml）的YEP固体培养基上铺板。（六）菌落PCR检测引物：GmELF4-Promoter-F/GmELF4-Promoter-RPCR反应体系如下：2×TaqMasterMix5μl10μMPrimerF0.5μl10μMPrimerR0.5μlddH2O4μlPCR反应条件：94℃4min94℃30s55℃30s35cycles72℃30s72℃5min15℃∞电泳检测PCR结果。（七）双酶切检验重组载体pTF101.1-GmELF40.5μl22 第二章材料与方法10×NEBBuffer1μlXbaI0.2μlSacI0.2μlddH2O8.1μl37℃水浴6h，酶切，电泳。五、CRISPR/Cas9载体构建按图2-1所示路线构建大豆GmELF4功能缺失型CRISPR/Cas9载体。具体操作如下：1.菌种活化和质粒提取：将pYLCRISPR/Cas9-DB菌种（TOP10F’）及CRISPR/gRNAvectors菌种（DH10B）分别在含卡那霉素（25μg/ml）和氨苄青霉素（50μg/ml）平板培养基划线，培养出单菌落，扩大培养，提取质粒，取部分质粒稀释成约100ng/L冷冻保存备用。2.靶点接头制备：将接头引物用1×TE溶解成100μM母液，再稀释为1μM备用。PCR仪设置程序90℃30S，移至室温冷却完成退火。3.gRNA载体酶切：取pYLgRNA-AtU3d/LacZ等质粒各1ug，在25μl反应体系用10UBsaI酶切20min，70℃金属浴5min使酶失活。冷冻保存备用。4.gRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLgRNA-AtU3/LacZ等载体与各对应接头连接反应：target1:（AtU3d）GmELF4-AtU3d-F：GTCAACGGTGAGCACGACGACCGGmELF4-AtU3d-R：AAACCGGTCGTCGTGCTCACCGTtarget2:（AtU3b）GmELF4-AtU3b-F：GTCACGTCGGGGATCCCGAGGCGGmELF4-AtU3b-R：AAACCGCCTCGGGATCCCCGACG10×T4DNAligasebuffer1μlpYLgRNA-AtU质粒（约20ng）0.5μl接头（终浓度0.05μM）0.5μl加ddH2O至总体积为10μl最后加约20-35U（0.05μl-0.1μl）T4DNAligase，室温连接约10-15min。23 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证5.扩增gRNA表达盒（两轮PCR）（1）第一轮PCR（每个表达盒2个反应）：取1μl上一步得到的连接产物为模板。引物：U-F：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCGgRNA-R：CGGAGGAAAATTCCATCCACtarget1反应1Primer：U-F+GmELF4-AtU3d-Rtarget1反应2Primer：GmELF4-AtU3d-F+gRNA-Rtarget2反应1Primer：U-F+GmELF4-AtU3b-Rtarget2反应2Primer：GmELF4-AtU3b-F+gRNA-RPCR反应体系：模板0.5μl10×KODBuffer1μl2mMdNTPs1μl2.5mMMgSO40.6μl0.05μMPrimerF0.5μl0.05μMPrimerR0.5μlKODPlusNeo0.2μlddH2O6.2μlPCR反应条件：95℃2min98℃10s60℃15s35cycles68℃20s68℃5min15℃∞PCR产物，4μl，2.0%琼脂糖凝胶，电泳。取第一轮PCR反应产物1μl加9μlddH2O，混合物作为第二轮PCR反应模板。（2）第二轮PCR：24 第二章材料与方法Uctcg-B1’：TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGGgRctga-B2：AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTCUctga-B2’：TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGGgRcggt-BL：AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCtarget1模板：target1第一轮PCR反应1产物5μl+反应2产物5μltarget2模板：target2第一轮PCR反应1产物5μl+反应2产物5μltarget1PCRPrimer：Uctcg-B1’+gRctga-B2target2PCRPrimer：Uctcg-B2’+gRcggt-BL模板10μl10×KODBuffer5μl2mMdNTPs5μl2.5mMMgSO43μlPrimer5μlKODPlusNeo1μlddH2O21μlPCR反应条件：95℃2min98℃10s58℃15s35cycles68℃20s68℃5min15℃∞3μlPCR产物，电泳，回收目的DNA片段，并测定回收产物浓度。6.将pYLCRISPR/Cas9-DB质粒用BsaI酶切30min,用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除ccdB片段）。分装成每管40-60ng冷冻保存备用。pYLCRISPR/Cas9-DB质粒2-3ng10×NEBBuffer1μlBsaI30U加ddH2O至总体积为10μl7.在切好分装pYLCRISPR/Cas9-DB质粒中，加入步骤（6）中得到的回收产物，使载体与每种插入片段摩尔为1:4-6。酶切后的pYLCRISPR/Cas9-DB质粒60-80ng25 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证target1胶回收产物15ngtarget2胶回收产物15ng10×T4DNAligasebuffer1μlT4DNAligase35U加ddH2O至总体积为10μlPCR仪中连接：10℃5min，20℃5min；10-15循环。8.化学热激法转化，涂板培养基为LB+25μg/mlKan,0.5mMIPTG，适量X-gal，蓝色菌斑为阳性克隆，提取质粒测序检测。(B1’)LacZT1(B2’)T2ctcgctga(B-R)gagcU3dprgRNAU3bprgRNAcggtgactgcca(B-L)E.coliPr(B2)(BL)GoldenGateligationB-LB-RRBT35spCas9P35SPAscI3535N::BpYLCRISPER/Cas9-DBpVS1arepliconrLBrSpepBR322oripBR322born图2-1大豆Cas9-GmELF4载体图谱Fig2-1Cas9-GmELF4vectormap六、大豆遗传转化（一）相关培养基1.发芽培养基（GM）（pH5.8）B5盐B5有机蔗糖20mg/LAgar7.6g/L2.共培养培养基（CCM）（pH5.4）AS0.04g/LBAP1.6mg/LB5盐1/10B5有机26 第二章材料与方法Cys400mg/LDTT150mg/LMES3.9g/LGA30.25mg/L蔗糖30g/LWashedagar8g/L3.芽诱导培养基（SIM）（pH5.7）B5盐B5有机BAP1.6mg/LMES3mM蔗糖20g/LPhytagel3g/LCb200mg/LCef200mg/LTimentin50mg/L4.芽伸长培养基（SEM）（pH5.7）MS盐B5有机MES3mMAsp1ml/LGA3500ug/LGlu1ml/LIAA300ug/LPhytagel3g/LZeatin-R1mg/L蔗糖20g/LCb200mg/LCef200mg/LTimentin50mg/L5.生根培养基（RM）27 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证MS盐B5有机Asp1ml/LGlu1ml/LMES3mMagar8g/LCb200mg/LCef200mg/LTimentin50mg/L（二）根癌农杆菌介导的大豆遗传转化1．种子灭菌：挑取无病害、无外伤、无菌且饱满的豆子装于培养皿，敞开培养皿放入干燥器中。干燥器中放入装有100ml次氯酸钠的烧杯，并沿烧杯壁缓缓加入4ml浓盐酸。迅速关闭干燥器，利用氯气灭菌16小时。灭菌后，打开干燥器，迅速封闭培养皿，转移至无菌操作台中，吹风1小时以上，释放残余氯气。2．种子发芽：配制发芽培养基（GM）（1L）：B5盐3.1g+20g蔗糖，调节pH为5.8，加入琼脂6.5g，121℃高压灭菌20分钟，取出，冷却后加入1mlB5有机盐（1000×），混匀倒大约13个培养皿。待培养基凝固后，将灭菌的豆子，种脐朝下接种于培养基上。盖好培养皿盖子，用保鲜袋封住，用刀划4-5个口，用于通风。24℃光照培养箱培养5天。3．菌液准备：挑取单克隆的农杆菌于2ml含有壮观霉素（Spe50mg/L）和卡那霉素（Kana50mg/L）的YEP液体培养基中，28℃，250rpm过夜培养。将饱和的菌液加入200ml含有壮观霉素（Spe50mg/L）和卡那霉素（Kana50mg/L）的YEP液体培养基中,28℃，250rpm培养至OD600=1.1-1.2。将菌液转移至50ml离心管中，室温，3500rpm离心10分钟。用共培养（CCM）液体培养基重悬菌液值OD600=0.6。4．侵染与共培养：配制共培养培养基（CCM）（1L）：0.31gB5盐+30g蔗糖+3.9gMES，调节pH为5.4，固体培养基加入琼脂6.5g，121℃高压灭菌20分钟取出，冷却。1L液体培养集中加入1mlB5有机盐（1000×）+0.25mlGA3（1mg/ml）+1mlBAP（1.6mg/L）+0.04gAS（DMSO溶解），混匀备用。1L固体培养基加入B5有机盐（1000×）+0.25mlGA3（1mg/ml）+1mlBAP（1.628 第二章材料与方法mg/L）+0.04gAS+0.4gL-cysteine+0.154gDTT（AS、L-cysteine和DTT用水定容至100ml,过滤灭菌）。于灭菌的三角瓶中加入用液体共培养基重悬的菌液。选择没有污染且生长良好的豆苗，用镊子轻轻剥去种皮。沿下胚轴竖直切开两片子叶，去除胚芽，用手术刀轻轻划伤子叶节向下的部位8-10次，然后放置于装有菌液的三角瓶中，侵染30分钟，在摇床上轻轻摇晃。倒净菌液，将子叶节有伤口的部位向下，平放在表面附有灭菌滤纸的固体共培养基中，用Parafilm封口膜封口，24℃培养箱，18小时光照，共培养5天。5．芽诱导：配制芽诱导培养基（SIM）（1L）：3.1gB5盐+30g蔗糖+0.6gMES，调节pH为5.7，固体培养基中额外加入琼脂6.5g，121℃高压灭菌20分钟取出，冷却。1L液体/固体培养集中加入1mlB5有机盐（1000×）+1mlBAP（1.6mg/L）+1mlTimentin（50mg/L）+1mlMeropen（25mg/L）。芽诱导分两次进行，第一次回复培养时不加Glufosinate,第二次筛选时加入8mg/L的Glufosinate。先用液体培养基清洗3-4次共培养后的外植体，100rpm，浸泡30分钟。去除掉液体后，用滤纸吸取表面多余的液体，将子叶内侧向上，倾斜45℃插入固体培养基中，24℃，光照18小时，培养14天。然后取出，用刀片出去真芽，保留丛生芽，在下胚轴包埋方向下方进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体放进加入Glufosinate的培养基中，24℃，光照18小时，培养14天。6．芽伸长：配制芽伸长培养基（SEM）（1L）：4.33gMS盐+0.6gMES+30g蔗糖，调节PH=5.8，加入6.5g琼脂，121℃高压灭菌20分钟取出，冷却。加入1mlB5有机盐（1000×）+1mlTimentin（50mg/L）+1mlMeropen（25mg/L）+2mlAsp（50mg/ml）+1mlGlu（50mg/ml）+0.1mlIAA（1mg/ml）+0.5mlGA3（1mg/ml）1mlZeatin-R（1mg/ml）。选取分化好的外植体，除去死芽和大芽，切掉外植体地面，露出新鲜的组织，转入芽伸长培养基中，24℃，光照18小时，培养14天。此过程重复3-4次。7．生根：配制生根培养基（RM）（1L）：4.33gMS盐+20g蔗糖，调节PH=5.8，加入6.5g琼脂，121℃高压灭菌20分钟取出，冷却。加入1mlB5有机盐（1000×），混匀倒三角瓶。当再生芽达到2-3cm后，从外植体上剪下。将切面放入1mg/ml的IBA中侵泡50秒，然后插入固体生根培养基中，24℃，光照18小时，培养至出现足够的根为止。8．再生苗移栽：将再生苗从培养基中轻轻拿出，用流动的水冲掉固体培养29 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证基，将其移栽至土壤中，并注意保湿，待生长良好后，转移至大盆中生长。30 第三章结果与分析第三章结果与分析第一节GmELF4候选基因的克隆Tasma等（2001）利用Corsoy和Kitamishiro（RILs）在G染色体顶端SSR标记Satt394附近发现1个与大豆光周期开花相关QTL位点（Tasmaetal.，2001）。为了找出它们的候选基因，我们将Satt394附近的大豆基因和拟南芥开花期基因比对，结果发现拟南芥ELF4的同源基因Glyma.18G027500和AGL的同源基因Glyma.18G042000在此区间内。可能是大豆开花期期相关QTL位点的候选基因。因此，我们以Phytozme公布的Glyma.18G027500和Glyma.18G042000的CDS为模板，设计特异引物，分别以Corsoy和Kitamishiro叶片cDNA为模板，进行PCR扩增。其电泳结果如图3-1所示：M200012M5000342000bp1500bp500bp图3-1GmELF4候选基因全长的PCR扩增Figure3-1CandidatesofGmELF4gene1和2分别为Glyma.18G027500的Corsoy型和Kitamishiro型；3和4分别为Glyma.18G042000的Corsoy型和Kitamishiro型将目的片段用DNA纯化回收试剂盒进行回收，连接到pEASY-BluntCloningVector，挑取转化后生长良好的单菌落，进行菌落PCR检测，检测结果正确的克隆进行测序，测序结果表明：Glyma.18G042000基因在两个亲本中序列完全一致，31 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证而Glyma.18G027500基因在两个亲本间存在一个SNP（图3-2），这个单碱基的突变导致101位点的丝氨酸变成脯氨酸（图3-3）。因此，我们推测Glyma.18G027500可能是此开花期QTL的一个候选基因。图3-2Corsoy和Kitamishiro中GmELF4基因CDS序列的分析Figure3-2CDSofGmELF4inCorsoyandKitamishiro图3-3Corsoy和Kitamishiro中GmELF4基因氨基酸序列的分析Figure3-3AminoacidofGmELF4inCorsoyandKitamishiro32 第三章结果与分析将Glyma.18G027500基因序列翻译为氨基酸序列（图3-4），利用NCBI网站的Blast功能对序列进行保守结构域分析，结果显示第54-136个氨基酸形成一个DUF1313结构域（图3-5）。将Glyma.18G027500基因蛋白与拟南芥、豌豆、玉米的ELF4-Like蛋白序列进行分析比对，结果显示他们均含有DUF1313结构域（图3-6）。将其与拟南芥等5个物种中的ELF4-Like基因编码的蛋白序列进行聚类分析时，结果显示大豆GmELF4基因与豌豆（PisumsativumL.）、蒺藜（TribulusterrestrisL.）相似性最高，同属于一个进化分支上（图3-7）。图3-4GmELF4基因的氨基酸序列Figure3-4AminoacidofGmELF4图3-5GmELF4基因的DUF1313保守结构域Figure3-5TheDUF1313DomainofGmELF4图3-6ELF4-Like基因的DUF1313保守结构域Figure3-6TheDUF1313DomainofELF4-Like33 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证图3-7大豆GmELF4编码蛋白与其他物种中ELF4编码蛋白的聚类分析Figure3-7PhylogeneticrelationshipofsoybeanELF4-likeproteinsandELF4sfromotherspecies第二节GmELF4基因的表达模式分析一、GmELF4基因的空间表达模式分析利用荧光定量PCR分析GmELF4基因在各组织器官中的表达模式。结果显示，GmELF4基因的表达量在真叶、三出复叶和生长点中表达量较高；而在茎、下胚轴和子叶中表达相对较低（图3-8）。该基因在植物个体各组织器官中广泛表达，在叶片和生长点表达丰度高，可能参与开花过程。图3-8大豆GmELF4基因的空间表达Fig3-8SpatialexpressioncharacteristicsofGmELF434 第三章结果与分析二、GmELF4基因的时间表达模式分析利用荧光定量PCR分析GmELF4基因的24h表达规律。结果表明，在长日照（16h光照/8h黑暗）条件下，GmELF4基因的表达呈现24小时节律变化，亮灯后16小时表达最高（图3-9）。在短日照（12h光照/12h黑暗）条件下，GmELF4基因表达量高峰提前，在亮灯后12小时出现高峰（3-10）。这表明，GmELF4基因表达受光周期调控。图3-9长日条件下GmELF4基因的表达Fig3-9ExpressionofGmELF4intheconditionoflongday图3-10短日条件下GmELF4基因的表达Fig3-10ExpressionofGmELF4intheconditionofshortday为了验证GmELF4基因是否受生物钟调控，将长日照条件下生长的植株分别移至连续光照和连续黑暗条件下，每4小时取样一次，连续取样48小时。结果表明，转移到连续光照条件下，GmELF4基因表达量升高，但依然呈现24小时表达规律，表达模式与在长日照条件类似（图3-11）。在连续黑暗条件下，表35 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证达量降低（图3-12）。说明GmELF4基因受生物钟调控。图3-11连续光照48h条件下GmELF4基因的表达Fig3-11ExpressionofGmELF4intheconditionof48h-continuouslight图3-12连续黑暗48h条件下GmELF4基因的表达Fig3-12ExpressionofGmELF4intheconditionof48h-continuousdark三、E1、E2、E3和E4对GmELF4的调控模式分析研究表明在大豆中，E1、E2、E3和E4对于大豆开花期和成熟期就有重要的作用。为了阐明E1、E2、E3和E4是否对GmELF4有调控作用，本研究分别在长日照（16小时光照/8小时黑暗）和短日照（12小时光照/12小时黑暗）条件下，以不同遗传背景下Harosory-NILs为材料，研究E1、E2、E3和E4对GmELF4的调控模式。结果表明，在长日照条件下，GmELF4的表达模式都呈现24小时表达节律模式，但是，E1和E2抑制GmELF4的表达，E3E4共同作用促进GmELF4的表达（图3-13）。在短日条件下，E1和E3E4的调控作用与在长日条件下一样，但是，却恰好相反，在短日条件下促进GmELF4的表达（图3-14）。36 第三章结果与分析综上所述，E1抑制GmELF4表达，E3和E4促进GmELF4表达，E2对GmELF4的调控依赖光照条件。图3-13长日条件下GmELF4基因与主要生育期基因的表达关系Fig3-13RelationshipofexpressionofGmELF4andmainPhotoperiodgenesintheconditionoflongday图3-14短日条件下GmELF4基因与主要生育期基因的表达关系Fig3-14RelationshipofexpressionofGmELF4andmainPhotoperiodgenesintheconditionofshortday37 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证第三节GmELF4的亚细胞定位为了对GmELF4基因功能进行深入研究，将敲除掉终止密码子的GmELF4基因的CDS序列，连入亚细胞定位载体（pBSK载体）。EcoRI和XbaI序列的正反向引物克隆插入片段，结果如图3-15所示。M1500bp图3-15带有XbaI和SacI位点的GmELF4目的片段Fig3-15TargetfragmentofGmELF4withdigestionsitesM:DSMarker2000;1:TargetfragmentofGmELF4将目的片段连接至pBSK载体中，构建融合表达载体pBSK-GmELF4，菌落PCR检测，电泳检验结果如图3-16所示。摇菌活化阳性克隆提取质粒进行测序，结果正确，证明融合表达载体pBSK-GmELF4构建成功。M12345678500bp图3-16pBSK-GmELF4重组载体的菌落PCRFig3-16ClonyPCRofpBSK-GmELF4constructM:DS2000;1-8:ClonyPCRofpBSK-GmELF4将测序正确的pBSK-GmELF4载体及空pBSK载体分别转化拟南芥原生质体，孵育过夜后，压片，用激光共聚焦显微镜观察并成像。结果表明，该基因主要在细胞质中特异性表达（图3-17）。38 第三章结果与分析图3-17GmELF4基因蛋白的亚细胞定位图3-17ProteinSubcellularLocalizationofGmELF4第四节GmELF4互补载体的构建为了进一步验证验证GmELF4基因在大豆中功能，我们构建GmELF4基因的互补载体用于大豆遗传转化。将GmELF4启动子加基因CDS序列设计带XbaI和SacI酶切位点的引物，从大豆Corsoy中克隆出目的片段（图3-18）连接至pEASY-Blunt载体中。酶切测序正确的质粒，将酶切得到的目的片段连接入pTF101.1载体中，构成pTF101.1-GmELF4功能互补型遗传转化载体，挑取单克隆进行菌落PCR检验，筛选阳性克隆，结果如图3-19所示。挑选阳性克隆，摇菌活化提取质粒，进行双酶切检验，电泳检测结果如图3-20所示。证明pTF101.1-GmELF4功能互补型载体构建成功。M123000bp图3-18带有XbaI和SacI酶切位点的GmELF4全长片段Fig3-18PCRproductsofGmELF4withXbaI和SacIdigestionsiteM:DS5000;1and2:PCRproductsofGmELF4withXbaI和SacIdigestionsite39 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证M12345678500bp图3-19pTF101.1-GmELF4菌落PCRFig3-19ClonyPCRofpTF101.1-GmELF4M:DSMarker20001-8:ClonyPCRofpTF101.1-GmELF4M14000bp3000bp图3-20pTF101.1-GmELF4载体的双酶切鉴定Fig3-20DigestionofpTF101.1-GmELF4vectorM:DS2000;1:DigestionofpTF101.1-GmELF4vector第五节CRISPR/Cas9载体的构建为了验证GmELF4在大豆中的功能，我们利用华南农业大学刘耀光教授提供的载体与方法，构建了基因沉默载体，用于大豆遗传转化，获得功能缺失转基因苗。针对GmELF4的CDS序列设计了两个特异性靶点，CRISPR/Cas9系统中，蛋白Cas9利用RNA，可以完成识别和切割特异性靶点的DNA，从而通过转基因苗表型明确GmELF4在大豆中的功能。对Cas9-DB载体以BsaI进行酶切，电泳检测结果如图3-21所示。证明BsaI酶活性良好，Cas9-DB载体提取效果佳，可以进行下一步实验。40 第三章结果与分析M121000bp500bp图3-21Cas9-DB载体BsaI酶切的鉴定Fig3-21DigestionofCas9-DBvectorbackbonewithBsaIM:DS2000;1:Cas9-DBvector;2:DigestionofCas9-DBvectorM1234400bp100bp图3-22gRNA表达盒的第一步PCR检测Fig3-22FirststepPCRamplificationofgRNAexpressioncassettesM:DNAMarker100bp;1:U3d;2:T1-gRNA;3:U3b;4:T2-gRNAM12500bp图3-23两个gRNA表达盒的PCR检测Fig3-23PCRamplificationoftwogRNAexpressioncassettesM:DNAMarker100bp;1:U3d-T1-gRNA;2:U3b-T2-gRNA41 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证图3-24Cas9-DB-GmELF4基因序列的分析Figure3-24AnalysisofCas9-DB-GmELF4gRNA表达盒的扩增，第一轮PCR，电泳检测结果如图3-22所示。gRNA表达盒的扩增，第二轮PCR扩增，电泳检测结果如图3-23所示。证明两个靶点的gRNA表达盒已分别构建完成。将构建载体测序分析，两个靶点的gRNA表达盒U3d-T1-gRNA和U3b-T2-gRNA已顺序连接至Cas9-DB载体中，如图3-24所示。证明Cas9-DB-GmELF4构建成功。42 第四章问题与讨论第四章问题与讨论光照是影响大豆个体生长发育以及产量品质的最重要的环境因素之一。光既可以为大豆供给光合作用需要的能源，同时也向植物传递各种光质信号。光对于植物的作用主要以两方面实现，一是参与植物幼苗的光形态建成，二是引起光周期反应。生育期和开花期是光周期反应的重要指标，开花早晚以及生育期长短决定了大豆适宜种植的地理纬度区域及播种时间。所以这两个性状与大豆的质量以及产量关系十分紧密。Tasma等（2001）利用Corsoy和Kitamishiro（RILs）在G染色体顶端SSR标记Satt394附近发现3个与大豆光周期开花相关QTL位点。本研究结合生物信息学以及分子生物学，发现GmELF4基因可能是这个开花期相关的QTL的候选基因。测序结果表明，GmELF4基因在两亲本间存在一个SNP，导致氨基酸的置换。将GmELF4基因蛋白与拟南芥、豌豆、玉米的ELF4-Like蛋白序列进行分析比对，结果显示他们均含有DUF1313结构域。因此，DUF1313结构域的突变可能导致其功能的改变。为了进一步验证GmELF4基因是这个开花期相关的QTL的候选基因。我们以Corsoy和Kitamishiro重新构建了RHL群体，利用GmELF4基因的在两亲本间的差异设计dCAPS，计划将GmELF4基因重新定位，目前F4代已经种植，预计2015年8月收获种子。利用荧光定量PCR分析GmELF4基因在各组织中的表达量。结果显示，其在各组织中表达量从高到低依次为真叶、三出复叶、生长点、根、茎、下胚轴、子叶。即该基因在植物个体各组织器官中广泛表达，在叶片和生长点表达丰度高，可能参与开花过程。在长日照（16h光照/8h黑暗）及短日照（12h光照/12h黑暗）条件下，GmELF4基因表达量随着见光时间长度增加而升高，在光照消失黑暗开始时表达量达到峰值，而后从暗期开始，表达量随着暗期时间长度增加而降低。而后为了验证这一表达规律是否单纯由光照引起，将长日照条件下生长的植株移至全光照无暗期条件下，进行48h表达特性分析，结果显示，GmELF4基因依然呈现24小时表达规律，表达模式与在长日照条件下一致，而且随时间增加，表达振幅降低。同时，将长日照条件下生长的植株移至全暗期无光照条件下，进行43 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证48h表达特性分析，结果显示，0-4h是由于外部条件光照消失表达量迅速下降，但仍可发现GmELF4基因呈现24小时节律表达规律，表达模式与在短日照条件下相似，且随时间增加，表达振幅降低。综上，与拟南芥中ELF4类似（Doyle等，2002），GmELF4基因同样受光周期调控的同时也受生物钟调控，说明ELF4在大豆中的功能可能具有保守性，GmELF4可能参与生物钟和光周期调控的开花途径。但需要利用基因沉默植株或elf4重组自交系，对其下游生物钟基因（如CCA1等）和开花相关基因（如CO等）进行下一步分析，确认GmELF4是否参与生物钟和光周期调控的开花途径。此外，研究表明在大豆中，E1、E2、E3和E4对于大豆开花期和成熟期具有重要的作用。E1基因对于大豆开花的抑制作用在已明确的E系列光周期相关基因中效用最强；E2基因虽然影响光周期反应能力较小，但对于大豆生育期的贡献值高，受外界环境的影响较小（Watanabe等，2011）；E3基因和E4基因都对光周期反应敏感，其中E3基因对生育期贡献较大（Liu等，2008;Watanabe等，2009）。分析GmELF4与已克隆的大豆光周期主效基因E1、E2、E3、E4的表达关系可知：E1抑制GmELF4表达，E3、E4促进GmELF4表达，E2对GmELF4表达的影响因长短日照条件的不同而产生不同，以上结果表明GmELF4可能参与光周期调控开花的途径，具体情况需进一步验证。高等生物体行使功能的最基本单位是细胞。真核细胞中的亚细胞结构十分复杂，细胞中存在数以几十计的细胞器，特定的蛋白在特定的细胞器中行使相应的功能，维持生物体的功能运转。即不同的蛋白会定位于不同的亚细胞结构内，而他们的功能也不尽相同（Emanuelsson等，2001）。故通过亚细胞定位技术可以为初步分析蛋白功能。将GmELF4连接至带有报告基因的融合表达载体pBSK中，报告基因表达产物为高灵敏度和荧光强度的增强型GFP（EGFP）。将载体共转化拟南芥原生质，孵育后在激光共聚焦显微镜下观察。观察显示GmELF4在细胞质中特异性表达，根据实验结果猜测，其功能可能与调控开花的基因表达网络有关。同时，我们构建了GmELF4基因的互补载体和基因沉默载体，计划在大豆中进行互补试验和基因沉默试验，有望进一步验证GmELF4的基因功能，并进一步确定GmELF4的基因是否为上述开花期相关的QTL的候选基因。分析基因功能最直观的手段即是进行遗传转化，构建遗传转化载体，将目的基因片段连接至遗传转化载体，将重组载体转化至植物体内，观察植物的表型是否发生变化，44 第四章问题与讨论可能会导致原有表型增强或减弱、原有表型消失或新表型出现，以此来验证目的片段的功能。目的将正常型GmELF4自身启动子加基因全长片段连接入大豆遗传转化载体pTF101.1，并转化入突变型GmELF4品种黑农37中，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能互补型转基因苗。CRISPR/Cas9系统中，蛋白Cas9利用RNA，可以完成识别和切割靶向的DNA（Jennifer等，2012），该技术可以实现方便高效廉价地在细胞上做基因编辑。本实验中利用CRISPR/Cas9技术对GmELF4基因进行DNA水平的编辑，以使GmELF4沉默，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能缺失型转基因苗，为进一步验证GmELF4基因的功能提供了充分证据。本研究成功地将CRISPR/Cas9DNA编辑技术首次应用到大豆中，并成功实现大豆遗传转化，这一技术的实现为进行大豆品种改良以及育成新品种提供了新方法。由于大豆遗传转化实验周期较长，故实验仍在进行中，转基因实验结果会使文章功能验证部分内容更加充实。生物钟影响植物生长发育众多阶段，包括下胚轴的伸长和光周期调控的开花。而ELF4在这两个调控途径中起着重要的作用。（Khanna等，2003）首先报道ELF4是光敏色素介导的抑制下胚轴伸长所需要的。最近，Nusinow等（2011）研究表明ELF4和ELF3已经LUX一起形成蛋白复合物，直接调控植株的生长。这种蛋白复合物同样受生物钟调控，在黄昏时达到最大值。ELF4、ELF3和LUX复合物抑制PIF4和PIF5的表达，使其产生生物钟表达节律，在深夜和早晨表达最高从而调控下胚轴的伸长。因此，当或获得转基因大豆时，对GmELF4在调控下胚轴伸长的研究，将进一步阐明GmELF4的功能。45 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证第五章全文总结1.成功克隆Glyma.18G027500，分析比对两亲本中的基因以及序列编码的氨基酸，发现两个亲本间存在一个SNP位点，这个碱基的突变造成其编码的氨基酸发生变化，而该氨基酸位于GmELF4编码的DUF1313保守结构域上，虽然这个结构域的功能目前尚不明确，但是该单氨基酸改变很可能造成GmELF4编码蛋白的功能改变。2.GmELF4基因在植物个体真叶、三出复叶、生长点等各组织器官中广泛表达，说明GmELF4基因广泛参与个体发育。GmELF4基因表达呈现24h节律性，且这一节律性不会因光照存在与否改变，故可进一步证实GmELF4基因与大豆光周期的关系，可能与生物钟的中央震荡器有关。分析GmELF4与已克隆的大豆光周期主效基因E1、E2、E3、E4的表达关系可知：E1抑制GmELF4表达，E3、E4促进GmELF4表达，E2对GmELF4表达的影响因长短日照条件的不同而产生不同。更加说明GmELF4是一个光周期相关基因。3.将GmELF4连接至带有报告基因的融合表达载体pBSK中，报告基因表达产物为高灵敏度和荧光强度的增强型GFP（EGFP）。将载体共转化拟南芥原生质，孵育后在激光共聚焦显微镜下观察。观察显示GmELF4在细胞质中特异性表达，进一步暗示其功能可能与调控开花的基因表达网络有关。4.将来自于Corsoy中的正常型GmELF4自身启动子加基因全长片段连接入大豆遗传转化载体pTF101.1，并转化入突变型GmELF4品种黑农37中，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能互补型转基因苗。利用CRISPR/Cas9技术对GmELF4基因进行DNA水平的编辑，以使GmELF4沉默，目前正在进行大豆遗传转化，预期得到功能缺失型转基因苗。46 参考文献参考文献BassettAR,LiuJ-L(2014)CRISPR/Cas9andgenomeeditinginDrosophila.JournalofGeneticsandGenomics41:7-19BlázquezMA,AhnJH,WeigelD(2003)AthermosensorypathwaycontrollingfloweringtimeinArabidopsisthaliana.Naturegenetics33:168-171BrachiB,FaureN,HortonM,FlahauwE,VazquezA,NordborgM,BergelsonJ,CuguenJ,RouxF(2010)LinkageandassociationmappingofArabidopsisthalianafloweringtimeinnature.PLoSGenet6:e1000940ChengL,WangY,ZhangC,WuC,XuJ,ZhuH,LengJ,BaiY,GuanR,HouW(2011)GeneticanalysisandQTLdetectionofreproductiveperiodandpost-floweringphotoperiodresponsesinsoybean.Theoreticalandappliedgenetics123:421-429ChouML,YangCH(1999)Late-floweringgenesinteractwithearly-floweringgenestoregulatefloweringtimeinArabidopsisthaliana.Plantandcellphysiology40:702-708CoberER,MorrisonMJ(2010)Regulationofseedyieldandagronomiccharactersbyphotoperiodsensitivityandgrowthhabitgenesinsoybean.Theoreticalandappliedgenetics120:1005-1012CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA(2013)MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339:819-823CouplandG(1995)Regulationoffloweringtime:Arabidopsisasamodelsystemtostudygenesthatpromoteordelayflowering.PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyB:BiologicalSciences350:27-34CreganP,JarvikT,BushA,ShoemakerR,LarkK,KahlerA,KayaN,VanToaiT,LohnesD,ChungJ(1999)Anintegratedgeneticlinkagemapofthesoybeangenome.CropScience39:1464-1490DingZ,MillarAJ,DavisAM,DavisSJ(2007)TIMEFORCOFFEEencodesanuclearregulatorintheArabidopsisthalianacircadianclock.ThePlantCell19:1522-1536FlowersJM,HanzawaY,HallMC,MooreRC,PuruggananMD(2009)PopulationgenomicsoftheArabidopsisthalianafloweringtimegenenetwork.Molecularbiologyandevolution26:2475-2486FujimoriT,SatoE,YamashinoT,MizunoT(2005)PRR5(PSEUDO-RESPONSEREGULATORPlaysAntagonisticRolestoCCA1(CIRCADIANCLOCK-ASSOCIATED1)inArabidopsisthaliana.BioscienceBiotechnology&Biochemistry69:426-430GratzSJ,WildongerJ,HarrisonMM,O'Connor-GilesKM(2013)CRISPR/Cas9-mediatedgenomeengineeringandthepromiseofdesignerfliesondemand.Fly7:249-255HerreroE,KolmosE,BujdosoN,YuanY,WangM,BernsMC,UhlwormH,CouplandG,SainiR,JaskolskiM(2012)EARLYFLOWERING4recruitmentofEARLYFLOWERING3inthenucleussustainstheArabidopsiscircadianclock.ThePlantCell24:428-44347 大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证HsuPY,HarmerSL(2014)Wheelswithinwheels:theplantcircadiansystem.Trendsinplantscience19:240-249JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierE(2012)Aprogrammabledual-RNA–guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337:816-821KantolicAG,SlaferGA(2001)Photoperiodsensitivityafterfloweringandseednumberdeterminationinindeterminatesoybeancultivars.FieldCropsResearch72:109-118KeimP,DiersBW,OlsonTC,ShoemakerRC(1990)RFLPmappinginsoybean:associationbetweenmarkerlociandvariationinquantitativetraits.Genetics126:735-742KikisEA,KhannaR,QuailPH(2005)ELF4isaphytochrome‐regulatedcomponentofanegative‐feedbackloopinvolvingthecentraloscillatorcomponentsCCA1andLHY.ThePlantJournal44:300-313KimY,YeomM,KimH,LimJ,KooHJ,HwangD,SomersD,NamHG(2012)GIGANTEAandEARLYFLOWERING4inArabidopsisexhibitdifferentialphase-specificgeneticinfluencesoveradiurnalcycle.Molecularplant5:678-687KimY,LimJ,YeomM,KimH,KimJ,WangL,KimWY,SomersDE,NamHG(2013)ELF4regulatesGIGANTEAchromatinaccessthroughsubnuclearsequestration.Cellreports3:671-677KolmosE,DavisSJ(2007)ELF4asacentralgeneinthecircadianclock.Plantsignaling&behavior2:370-372KolmosE,NowakM,WernerM,FischerK,SchwarzG,MathewsS,SchoofH,NagyF,BujnickiJM,DavisSJ(2009)IntegratingELF4intothecircadiansystemthroughcombinedstructuralandfunctionalstudies.HFSPjournal3:350-366KongF,LiuB,XiaZ,SatoS,KimBM,WatanabeS,YamadaT,TabataS,KanazawaA,HaradaK(2010)TwocoordinatelyregulatedhomologsofFLOWERINGLOCUSTareinvolvedinthecontrolofphotoperiodicfloweringinsoybean.PlantPhysiology154:1220-1231KoornneefM,Alonso-BlancoC,PeetersAJ,SoppeW(1998)GeneticcontroloffloweringtimeinArabidopsis.Annualreviewofplantbiology49:345-370KuittinenH,SillanpääM,SavolainenO(1997)Geneticbasisofadaptation:floweringtimeinArabidopsisthaliana.Theoreticalandappliedgenetics95:573-583LiuB,KanazawaA,MatsumuraH,TakahashiR,HaradaK,AbeJ(2008)GeneticredundancyinsoybeanphotoresponsesassociatedwithduplicationofthephytochromeAgene.Genetics180:995-1007LiuB,AbeJ(2010)QTLmappingforphotoperiodinsensitivityofaJapanesesoybeanlandraceSakamotowase.Journalofheredity101:251-256LiuB,WatanabeS,UchiyamaT,KongF,KanazawaA,XiaZ,NagamatsuA,AraiM,YamadaT,KitamuraK(2010)ThesoybeanstemgrowthhabitgeneDt1isanorthologofArabidopsisTERMINALFLOWER1.PlantPhysiology153:198-210LiuH,WangH,GaoP,XüJ,XüT,WangJ,WangB,LinC,FuY-F(2009)Analysisofclock48 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大豆光周期开花控制基因GmELF4的克隆及功能验证致谢首先，衷心感谢导师孔凡江研究员对我的悉心教导和对论文的全面指导。从论文的选题到实验的进展、结果的分析与讨论，孔老师都给予了我细致耐心的引导。他全面的指导帮助我在思考问题、解决问题和实验实践等方面都得到了充分的提升。感谢孔老师专心学术、严谨治学、孜孜不倦的品格给我带来必将受益终身的积极影响，同时，也感谢老师生活中对我的关怀和照顾。感谢大豆分子设计育种课题组全体老师给予我的帮助。感谢刘宝辉研究员为课题组搭建良好先进的平台，感谢袁晓辉研究员在生物信息学方面提供不可或缺的资源和支持；感谢黄治军老师、曹东老师、王家麟老师、翟红老师在我实验遇到问题的时候毫不保留地耐心讲解。感谢杜维广老师、潘相文老师在田间育种方面和南繁期间的巨大帮助。感谢马凤鸣老师在论文写作时进行积极有效的指导和在论文修改方面做出的巨大帮助。感谢并肩奋斗的徐泽恒、芦思佳、李晓明、方超、史新奕、徐琰等在学习和生活中提供的大力帮助，感谢课题组大豆转基因团队对本研究做出的不可替代的贡献。感谢家人一直以来对我无私的奉献、包容与支持。感谢朋友帮我分担工作和生活中的困难和烦恼。感谢所有帮助、关心过我的人。最后要感谢参与论文评审的各位专家老师在百忙中提出的宝贵建议，弥补我论文中的不足。52