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—————————————————————GmBRI1和GmCPD基因的克隆及在大豆开花过程中的功能研究—————————————————————FunctionalAnalysisofGmBRI1andGmCPDandInvestigationofTheirRolesinSoybeanFlowering————————————作者姓名：王妙专业名称：植物学研究方向：植物种质资源与利用指导教师：王庆钰教授学位类别：理学博士培养单位：吉林大学论文答辩日期：2015年6月3日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位专家1教授单位1主席王丕武教授吉林农业大学专家2教授单位2委员宋慧教授吉林农业大学专家3教授单位3王树才教授东北师范大学专家4教授单位4梁正伟研究员中国科学院东北地理所专家5教授单位5冯献忠研究员中国科学院东北地理所潘洪玉教授吉林大学原亚萍教授吉林大学 中文摘要GmBRI1和GmCPD基因的克隆及在大豆开花过程中的功能研究随着人口的快速增长，全世界的粮食安全面临严峻挑战。要使作物产量大幅度提高，必须对产量赖以形成的植物总体的生长发育状况进行重大调控。因此，更多研究开始关注控制或影响植物生长发育和产量形成的物质——植物激素。油菜素内酯是第六大植物激素，参与调控植物生长发育的多个方面，其对株型、产量和花期的调控尤其被世人关注。对油菜素内酯信号转导途径和生物合成途径的关键基因进行遗传操作，是改造植物株型和生育期，挖掘作物高产潜能的有力途径。大豆作为世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物，一直被倒伏和生育期复杂所困扰。以往育种者通过常规育种手段改良株型及生育期性状，但随着近年来生物技术的迅猛发展，尤其是一系列油菜素内酯相关基因的发现，使通过分子手段设计和改造作物株型与生育期成为可能。虽然油菜素内酯相关基因在多种物种中的研究取得了突破性进展，但大豆中的研究却非常有限。本研究是首次在大豆中克隆获得油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPD，其在株型构建和开花时间调节方面的重要功能为通过分子操作调控株型和花期性状，培育高产大豆品种创造了条件。本实验对油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPD进行了克隆及功能验证，并对其与拟南芥和大豆开花的关系和在GmFT2a转基因植株中的表达进行了探讨，主要实验结果如下：1.在大豆中克隆得到油菜素内酯受体蛋白基因GmBRI1并进行了生物信息学分析，发现其与其他物种来源的BRIs有较高的序列同源性和较近的亲缘关系。GmBRI1与AtBRI1在序列和结构域上都有很强的保守性，且蛋白三级结构极端相似，预示二者可能具有相似的功能。将GmBRI1基因转入油菜素内酯不敏感突变体bri1-5中，突变体的极端矮化、叶片小而圆、根长缩短、果荚瘦小的表型被GmBRI1基因的表达恢复至野生型状态。且通过光暗下胚轴伸长实验、BR根长抑制试验和BR标签基因的表达检测实验确认了GmBRI1基因对bri1-5突变体表型的恢复是因为修复了突变体内部受损的BR信号转导通路。从而确认我们克隆得到的GmBRI1基因是有功能的，且与AtBRI1基因功能相似。I 2.在大豆中克隆得到了4个油菜素内酯P450单加氧合成酶基因GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4。同源序列比对和进化树分析显示，4个GmCPD与其他CPD基因在序列上同源性较高且具有同一起源。4个GmCPD与AtCPD在序列上有较高的同源性，尤其四个特征结构域的序列非常保守，表明二者在结构和功能上具有高度保守的特性。将4个GmCPD基因分别转入油菜素内酯合成突变体cpd-91中都能恢复后者的表型：叶片变为长圆形、株高显著增加、果荚变大、根系更加发达，与野生型的表型接近。在光暗下胚轴伸长实验、BR根长抑制实验和对根发育与开花时间的分析中发现，4个GmCPD基因的表达都能够修复突变体BR合成路径，恢复内源BR的水平。且在植株形态建成，根发育和叶片形态的调控中发挥重要作用。3.对GmBRI1和4个GmCPD基因在大豆不同组织中的表达情况进行了分析，发现GmBRI1基因主要在下胚轴和子叶这些细胞生长和分裂旺盛的部位表达；GmCPD1、GmCPD3和GmCPD4基因主要在大豆子叶和叶片中表达；GmCPD2基因在各组织表达量都较低，主要在幼嫩果荚中表达。对大豆外源施加BR后，GmBRI1和4个GmCPD基因都有快速而强烈的响应；处理后GmBRI1基因表达上调而4个GmCPD基因都表达下调。4.对油菜素内酯相关基因与植物开花的关系进行了探索。CPD缺失突变体开花延迟的现象在本实验中也得到了证实，而GmCPD基因在cpd突变体中的表达能够恢复后者的晚花表型，表明CPD基因在开花过程中必不可少。在大豆开花逆转系统中，大豆自贡冬豆品种短日诱导13天移到长日条件下就可发生开花逆转。对短日处理、长日处理和13天短日处理后移入长日条件下的处理组进行取样检测。发现GmBRI1和4个GmCPD基因都在短日诱导第13天出现表达峰值。此时正是花原基开始出现的时期，表明GmBRI1和4个GmCPD基因与成花转换存在密切关系。在光周期敏感性不同的大豆品种，光周期不敏感的早熟品种黑河27与光周期敏感的晚熟品种自贡冬豆的叶片和子叶中进行GmBRI1和4个GmCPD基因的表达分析。结果显示，GmBRI1和4个GmCPD基因在黑河27叶片和子叶中的表达量明显高于自贡冬豆。表明不同大豆品种的开花期差异与BR途径可能存在一定关联。5.获得了GmFT2a转基因植株并进行了分子鉴定。在得到的转基因阳性植II 株中，T0-2植株中GmFT2a基因过表达且开花提前，其子代T1-2中GmFT2a基因表达量也很高但是花期未有改变。在GmFT2a过表达的T0-2和T1-2转基因植株中对GmBRI1和4个GmCPD基因的表达情况进行探究。结果显示，GmBRI1和4个GmCPD基因在转基因植株中的表达趋势都与GmFT2a基因呈正相关。说明油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPD与GmFT2a基因有一定关联。关键词：大豆、油菜素内酯、转基因植株、GmBRI、GmCPD、GmFT2a、成花转换III AbstractFunctionalAnalysisofGmBRI1andGmCPDandInvestigationofTheirRolesinSoybeanFlowering.Thesoaringdemandformoreplant-derivedproductsmakesanewgreenrevolutionessential.Forenhancingyieldswhichremainstheeternalthemeofthegreenrevolution,modulationoftheoveralldevelopmentstatueofthecropisrequired.Manyresearcheshavehighlightedtheimportantroleofphytohormonesinplantdevelopmentandarchitecturethatunderliehighyield.Amongthephytohormones,thepotentialofbrassinosteroids(BRs)inagriculturehasbeenrecognized,asthereissubstantialevidencethatthegeneticmodificationofBRsignalingandbiosynthesispathwaycancreateaplantwithidealplanttypeandmaturityperiodthatprovidesgreatyieldpotential.Brassinosteroids(BRs)areagroupofsteroidalphytohormoneswithessentialrolesinplantgrowthanddevelopment;especially,itsimpactsonplantarchitecture,productionandflorescencehaveraisedtheconsiderableconcern.Asanimportantindustrialcropprovidingoilandproteinworldwide,soybeanislimitedontheoutputbylodgingandtheinadaptablematurityperiod.Conventionalbreedingwasthecommonmeansofimprovingplanttypeandregulatingtheflorescenceinthepast,butmoleculartechniquescurrentlyprovideabroaderspaceforcreation,asarangeofgenesinvolvedintheBRsignalingandbiosynthesispathwayhavebeenidentified.However,althoughgreatprogresshasbeenmadeinotherspecies,evidenceinsoybeanislimited.ThecurrentstudyisthefirsttimethattheBRI1andCPDgenewereisolatedandcharacterizedinsoybean.OurdataprovideafoundationforfuturestudiesintotheregulationofsoybeanproductionbyBRsignaling.ThesuccessfuldecipheringoftheGmBRI1andGmCPDgeneswillcontributetowardgeneratingnewsoybeangermplasm.Inthisstudy,weclonedandcharacterizedonecDNA(GmBRI1)correspondingtotheBRIgeneandfourcDNA(GmCPD)thatarehomologoustotheCPDgene.Wepresentsequence,structuralandfunctionalevidencethatthededucedGmBRI1andfourGmCPDgeneshavesignificanthomologywithAtBRI1andAtCPD,andpossessmultiplefunctionsinplantdevelopmentprogress.TheexpressionpatternsoftheseV fiveBRrelatedgeneshavealsobeeninvestigatedanddiscussedinthefloweringinductionsystemandtheGmFT2atransgenicplantsinsoybeanwhichwillincreaseourunderstandingoftherelationshipbetweentheGmBRI1andGmCPDgenesandsoybeanfloweringpathwaytofurtherbenefitproduction.Themainresultsarementionedasfollow:1.AbrassinosteroidinsensitivegenehomologouswithAtBRI1andotherBRIswasisolatedfromGlycinemaxanddesignatedasGmBRI1.AbioinformaticanalysisrevealedthatGmBRI1sharesaconservedkinasedomainand25tandemleucine-richrepeats(LRRs)thatarecharacteristicofaBRreceptorforBRreceptionandreactionandbearastrikingsimilarityinproteintertiarystructuretoAtBRI1.ThetransformationofGmBRI1intotheArabidopsisdwarfmutantbri1-5restoredthephenotype,especiallyregardingpodsizeandplantheight.Additionally,thiscomplementationisaconsequenceofarestoredBRsignalingpathwaydemonstratedinthelight/darkanalysis,rootinhibitionassayandBR-responsegeneexpression.Therefore,GmBRI1functionsasaBRreceptortoalterBR-mediatedsignalingandisvaluableforimprovingplantarchitectureandenhancingtheyieldofsoybean.2.FourcDNAhomologouswithArabidopsisCPDwereisolatedfromGlycinemax,namedGmCPD1,GmCPD2,GmCPD3andGmCPD4respectively.AphylogeneticanalysissuggestedthatthefourGmCPDareallclosestinhomologytoCPDsfromdicotyledons,especiallyleguminousplants.AsequenceanalysisindicatedthatalltheGmCPDproteinscontaintheproline-richdomain,dioxygen-bindingdomain,steroid-bindingdomainandheme-bindingdomainwhichareconservedamongplantCPDsandarethecharacterizationofthecytochromeP450family.TheGmCPDproteinsarestrikinglysimilartoAtCPDinsequenceandstructure.Additionally,thetransformationoffourGmCPDgenesintotheArabidopsiscpd-91mutantrespectivelycanrestorethephenotypeandthiscomplementationisaconsequenceofarestoredBRbiosynthesispathway.TheseresultssupportthesefourGmCPDgenesallasnovelCPDgeneanddisplayimportantrolesinrootdevelopment,leafexpansionandplanttypearchitecture,3.TherelativeexpressionlevelofGmBRI1andfourGmCPDgenesindifferentsoybeantissues/organsandrespondingtoexogenousBRwereanalyzed.GmBRI1transcriptsweremoreabundantinsoybeanrapidlygrowingtissues,suchashypocotylsandcotyledons;GmCPD1,GmCPD3andGmCPD4aremainlyVI expressedinleavesandcotyledons;whereasGmCPD2displayalowerlevelineachtissuebutmainlyexpressesinyoungpods;GmBRI1andfourGmCPDgenesallexhibitarapidandefficientresponsetoexogenousBRtreatmentwithaupregulationofGmBRI1anddownregulationofallGmCPDgenes.4.ThepotentialrolesofGmBRI1andGmCPDsinfloweringregulationwereinvestigated.First,GmCPDsexpressioncomplementedthelatefloweringphenotypeofArabidopsismutantsdeficientinCPD.ItisthereforeclearthatGmCPDsareassociatedwithflowering.Moreover,WedetectedtheexpressionpatternsofGmBRI1andfourGmCPDgenesinfloweringreversionsystemofsoybean.ThefloweringreversionoccursinsoybeanvarietyZigongdongdouwhentransferredintolongdayconditionaftera13-dayshortdaytreatment.WedetectedthetranscriptlevelofGmBRI1andfourGmCPDgenesinthefloweringreversiontreatmentdescribedaboveandthetreatmentofcontinuedlongdayandshortday.TheresultsareinterestingthattheexpressionlevelsofGmCPDsareunderphotoperiodcontrolinZigongdongdouandshowasuddenpeakuponfloralmeristeminitiation.Further,GmBRI1andGmCPDsexpressioninsoybeanvarietieswithdifferentphotoperiodsensitivitieswasdetected.TheresultsshowtheincreasedGmBRI1andGmCPDsexpressionintheleavesandcotyledonsofphotoperiod-insensitiveearly-maturitysoybean,itisclearthatGmBRI1andGmCPDscontributetofloweringdevelopmentandareessentialintheearlystagesoffloweringregulation.5.TheGmFT2atransgenicsoybeanplantswereachievedandconfirmedbymolecularidentification.Amongthem,T0-2plantappearsanadvancedfloweringtimeandahighlevelofGmFT2atranscription.Thenextgeneration,T1-2,inheritsthehighexpressionofGmFT2agenebuthavethesamefloweringtimeasthenon-transgenicplants.InthesetransgenicbackgroundwithupregulatedGmFT2aexpression,GmBRI1andfourGmCPDgenesperformthesameexpressionpattern:nomatterflorescenceispromotedorunchanged,theexpressiontrendofGmBRI1andfourGmCPDgenespresentsapositivecorrelationwiththatofGmFT2agene,suggestingarelationshipbetweentheseBRrelativegenesandGmFT2aKeywords:Soybean,brassinosteroids,transgenicplant,GmBRI1,GmCPD,GmFT2a,floraltransitionVII 中英文缩略语表英文缩写英文名称中文名称6-BA6-benzylaminopurine6-苄基嘌呤Ampampicillin氨苄青霉素AP1APETALA1拟南芥AP1基因ASzcetosyringone乙酰丁香酮BAK1BRI1ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1拟南芥BAK1基因BIN2BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE2拟南芥BIN2基因BKI1BRI1KINASEINHIBITOR1拟南芥BKI1基因bpbasepair碱基对BRbrassinosteroid油菜素内酯BRI1BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE1拟南芥BRI1基因BSK1BR-SIGNALINGKINASE1拟南芥BSK1基因BSU1BRI1SUPPRESSOR1拟南芥BSU1基因BZR1BRASSINAZOLERESISTANT1拟南芥BZR1基因BZR2BRASSINAZOLERESISTANT2拟南芥BZR2基因CAB2CHLOROPHYLLA/BBINDINGPROTEIN2拟南芥CAB2基因Cbcarbenicillin羧苄青霉素CCA1CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1拟南芥CCA1基因CCR2COLDANDCIRCADIAN-REGULATED2拟南芥CCR2基因CONSTITUTIVEDIFFERENTIALGROWTHCDG1拟南芥CDG1基因1cDNAcomplementaryDNA互补DNACefcephalexin头孢氨苄Chlchloramphenicol氯霉素CNcampestanol油菜甾烷醇COCONSTANS拟南芥CO基因CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENESISCPD拟南芥CPD基因ANDDWARFISMCRcampesterol油菜甾醇I DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯dNTPdeoxynucletidetriphosphates脱氧核苷三磷酸E.coliEscherichiacoli埃希氏大肠杆菌FDFLOWERINGLOCUSD拟南芥FD基因FLCFLOWERINGLOCUSC拟南芥FLC基因FTFLOWERINGLOCUST拟南芥FT基因GAgibberellin赤霉素GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白hhour小时Hishistidine组氨酸Kankanamycin卡那霉素LDlongday长日LFYLEAFY拟南芥LFY基因富含亮氨酸重复单LRR-RLKleucine-richrepeatreceptor-likekinase位的激酶受体MES2-(N-morphplino)ethanesulfonicacid2-吗啡酸-乙磺酸minminute分钟ORFopenreadingframe开放阅读框PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PP2APROTEINPHOSPHATASE2A拟南芥PP2A基因Rifrifampicin利福平rpmroundsperminute每分钟转速RT-PCRreversetranscriptionRCR反转录PCRSDshortday短日secsecond秒SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFSOC1拟南芥SOC1基因CO1Spespectinomycin壮观霉素II 目录第1章前言.................................................................................................................11.1油菜素内酯生物途径及其生理作用...............................................................11.1.1油菜素内酯信号转导途径....................................................................11.1.2油菜素内酯合成途径............................................................................31.1.3油菜素内酯的生理作用........................................................................31.2植物开花的分子机制研究进展......................................................................61.2.1四大开花途径........................................................................................61.2.2光周期途径分子机制............................................................................71.3油菜素内酯相关基因与开花调控..................................................................81.3.1BRI1基因的研究进展及其与开花时间的关系...................................81.3.2CPD基因的研究进展及其与开花时间的关系....................................91.4本研究的目的和意义.......................................................................................9第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析........112.1材料................................................................................................................112.1.1植物材料..............................................................................................112.1.2菌株......................................................................................................112.1.3酶及试剂..............................................................................................112.1.4引物......................................................................................................112.1.5主要仪器设备......................................................................................122.2方法................................................................................................................122.2.1DNA提取.............................................................................................122.2.2Trizol法提取植物总RNA..................................................................132.2.3cDNA的合成......................................................................................132.2.4GmBRI1/GmCPD基因的PCR扩增..................................................142.2.5PCR产物回收......................................................................................142.2.6回收产物连接T载体.........................................................................152.2.7冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞........................................15I 2.2.8生物信息学分析...................................................................................162.3结果................................................................................................................162.3.1GmBRI1基因的克隆............................................................................162.3.2GmBRI1基因的生物信息学分析........................................................172.3.3GmCPD基因的克隆............................................................................212.3.4GmCPD基因的生物信息学分析........................................................222.4讨论.................................................................................................................262.5小结................................................................................................................27第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析...............293.1材料................................................................................................................293.1.1植物材料..............................................................................................293.1.2试剂.......................................................................................................293.1.3引物......................................................................................................293.1.4主要仪器设备......................................................................................303.2方法................................................................................................................303.2.1材料种植与取样...................................................................................303.2.2Trizol法提取植物总RNA..................................................................303.2.3cDNA的合成......................................................................................303.2.4荧光实时定量PCR..............................................................................303.3结果................................................................................................................313.3.1在大豆不同组织中的表达..................................................................313.3.2外源BR处理下基因的表达..............................................................333.4讨论................................................................................................................353.5小结................................................................................................................37第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析....................................384.1材料................................................................................................................384.1.1植物材料..............................................................................................384.1.2菌株......................................................................................................384.1.3酶及试剂..............................................................................................38II 4.1.4引物及序列..........................................................................................384.1.5主要仪器设备......................................................................................394.2方法................................................................................................................394.2.1质粒的提取..........................................................................................394.2.2XbalI和KpnI/SacI双酶切...........................................................404.2.3酶切产物回收......................................................................................404.2.4用T4连接酶连接目的基因与载体..................................................414.2.5GV3101根癌农杆菌感受态细胞的制备............................................414.2.6电击法转化GV3101感受态细胞.......................................................414.2.7蘸花法转化拟南芥..............................................................................424.2.8Trizol法提取植物总RNA..................................................................434.2.9cDNA的合成......................................................................................434.2.10PCR反应验证基因表达....................................................................434.2.11拟南芥的处理及培养........................................................................444.2.12数据的测量与分析............................................................................444.3结果................................................................................................................444.3.1转基因拟南芥的获得与鉴定..............................................................444.3.2GmBRI1基因的表达恢复了拟南芥突变体bri1-5的表型....................514.3.3GmBRI1基因在bri1-5中的表达修复了BR信号通路....................564.3.4GmCPD基因的表达恢复了拟南芥突变体cpd-91的表型...................614.3.5GmCPD基因在cpd-91中的表达修复了BR合成途径...................704.4讨论................................................................................................................764.4小结................................................................................................................78第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系...................................805.1材料................................................................................................................805.1.1植物材料..............................................................................................805.1.2试剂.......................................................................................................805.1.3引物.......................................................................................................805.1.4主要仪器设备......................................................................................81III 5.2方法.................................................................................................................815.2.1Trizol法提取植物总RNA..................................................................815.2.2cDNA的合成......................................................................................815.2.3荧光实时定量PCR..............................................................................815.3结果................................................................................................................815.3.1对拟南芥开花的影响..........................................................................815.3.2在大豆开花逆转系统中的表达..........................................................845.3.3在不同光周期敏感性大豆品种中的表达..........................................885.4讨论................................................................................................................935.5小结................................................................................................................94第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析........................................................................................................................976.1材料................................................................................................................976.1.1植物材料..............................................................................................976.1.2菌种......................................................................................................976.1.3试剂.......................................................................................................976.1.4引物.......................................................................................................976.1.5主要仪器设备......................................................................................986.2方法.................................................................................................................996.2.1质粒的提取...........................................................................................996.2.2PCR反应..............................................................................................996.2.3XbalI和SacI双酶切.........................................................................996.2.4用T4连接酶连接目的基因与载体...................................................996.2.5EHA101根癌农杆菌感受态细胞的制备.........................................1006.2.6电击法转化EHA101感受态细胞...................................................1006.2.7根癌农杆菌介导的的大豆子叶节转化法.........................................1006.3结果..............................................................................................................1016.3.1GmFT2a转基因大豆植株的获得.....................................................1016.3.2GmBRI1和4个GmCPD同源基因在转基因植株中的表达..........112IV 6.4讨论..............................................................................................................1176.5小结..............................................................................................................118结论...................................................................................................................119参考文献...................................................................................................................121附录...................................................................................................................133作者简介及科研成果...............................................................................................136致谢...................................................................................................................137V 第1章前言第1章前言1.1油菜素内酯生物途径及其生理作用油菜素内酯（brassinosteroid，BR）是一种甾类植物激素.人们很早就发现其对植物茎秆伸长的促进作用[1]，于1979年在油菜中首次将其提取纯化出来[2]。油菜素内酯调控多种植物生长发育过程[3,4]，如株型[5]、花期[6]、产量[7]及抗性[8,9]等，被称为第六大植物激素。1.1.1油菜素内酯信号转导途径油菜素内酯对生长发育的调控是通过油菜素内酯信号途径达成的[10]。简要来说，油菜素内酯信号转导的过程大体分为三个阶段：受体感知BR信号并被激活、胞内的信号转导以及激活下游转录调控。1.1.1.1BR信号的感知与受体活化来自胞外的BR信号分子首先被定位在质膜上的油菜素内酯受体结合。此受体是由BRI1(BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE1)基因编码的一种富含亮氨酸重复单位的激酶受体（LRR-RLKs）。BR信号的接收与传导跟BRI1蛋白的结构密不可分。BRI1是一个跨膜蛋白，其结构主要分为胞外区，穿膜区和胞内激酶区。胞外区包括一个氮端信号肽，一个亮氨酸拉链基序，25个亮氨酸重复单位（LRR）以及插在第21和第22个LRR之间的ID（islanddomain）区[11,12]。信号肽区和亮氨酸拉链基序主要用于BRI1蛋白的膜定位，且也可能参与受体的二聚化。LRRs是油菜素内酯受体中非常重要的结构域，它直接参与BR的结合和蛋白之间的互作[13,11,14]。胞内激酶区可以分为胞内近膜区，激酶催化域和碳端尾巴。胞内近膜区在胞外信号向胞内转换的过程中是必须的。而激酶催化区决定了受体的活性[15]。碳端尾巴的存在削弱了受体的活性，因去掉残端尾巴的激酶受体蛋白活性更强，因此认为碳端尾巴的功能是使受体保持一种稳定的基态[16]。另外，碳端尾巴被发现具有自磷酸化活性[16]，据此猜测油菜素内酯激酶受体存在一种可能的活性调控机制：当胞外没有BR信号时，受体同源二聚体会在碳端尾巴的作用下保持基态；当BR分子结合的时候，由于构象的改变引起碳1 吉林大学博士学位论文端尾巴自磷酸化，从而解除其对受体活性的抑制。另外，还有一种抑制蛋白的参与使受体保持低活性基态，BKI1(BRI1KINASEINHIBITOR1)蛋白，它一方面与BR受体结合抑制其活性，另一方面阻止受体与其他激活因子结合[17]。因此，当BR被BRI1蛋白的胞外域结合，BRI1蛋白的构象发生改变，胞内的结构域构象的改变使碳端尾巴自磷酸化，同时BKI1蛋白也被磷酸化从而与BRI1分离。BRI1蛋白的活性得以释放成为预激活状态。此种状态下的BRI1得以与BAK1(BRI1ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1)蛋白接近，两者相互磷酸化而彼此增强活性，最后BRI1蛋白进入完全活化状态。1.1.1.2胞内的信号转导活化的BRI1蛋白会磷酸化很多锚定在细胞膜上的胞内蛋白酶，引发一系列的蛋白磷酸化反应，最终激活转录因子，达成对生长发育相关基因的调控。BRI1蛋白最具代表性的两个磷酸化底物是BSK1(BR-SIGNALINGKINASE1)和CDG1(CONSTITUTIVEDIFFERENTIALGROWTH1)[18,19]。BRI1与BSK1相互作用通过磷酸化丝氨酸S230将其激活。同时BRI1能够磷酸化丝氨酸S234活化CDG1。BSK1和CDG1是同属RLCK家族的激酶，二者活化后会与另一种磷酸酶BSU1(BRI1SUPPRESSOR1)结合并将其磷酸化[18,20,21]。BSU1通过在一个保守的酪氨酸上脱磷酸化使BIN2(BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE2)失活[18]。BIN2抑制转录因子的活性，在BR信号通路中发挥负向调节功能。1.1.1.3转录因子的激活当没有BR或BR浓度很低的情况下，BIN2在其酪氨酸Y200位点自身磷酸化而保持活性，进而磷酸化两个同源转录因子，BZR1(BRASSINAZOLERESISTANT1)和BZR2(BRASSINAZOLERESISTANT2)[3,22,23]，抑制他们的DNA结合活性并通过14-3-3蛋白的结合使他们滞留在胞质中[24-26]。当BR含量较高时，被激活的BSU1使BIN2去磷酸化而失活，且其分子被蛋白酶降解[27]，解除了BIN2对BZR1和BZR2的抑制作用。于是BZR1和BZR2的磷酸基团可以被PP2A(PROTEINPHOSPHATASE2A)脱去[28]。脱磷酸的BZR1和BZR2能够进入细胞核结合到目标基因的启动子上，或促进或抑制的调控目标基因的表达[29,30,4,31]。2 第1章前言1.1.2油菜素内酯合成途径油菜素内酯的前体物质为Campesterol(CR)，经三条主要途径转变为[32]Brassinolide（BL），一条为早期C-22氧化途径，另外是以中间产物Campestanol[33-35](CN)为起始的两条平行的合成途径：早期C-6氧化途径和晚期C-6氧化途径。另有报道C-22羟化物可以直接转变为3-Dehyro-6-deoxoteasterone(6-deoxo3DT)，[36][37,38]这一捷径也使各合成途径形成交叉。因此油菜素内酯的主要合成路径为：CR羟基化为(22S)-22-Hydroxycampesterol(22-OHCR),再氧化为(22S,24R)-22-Hydroxyergost-4-en-3-one(22-OH-4en-3one)，还原生成(22S,24R)-22-Hydroxy-5α-ergostan-3-one(22-OH-one)，转变为3-Dehyro-6-deoxoteasterone(6-deoxo3DT)或6-Deoxotyphasterol（6-deoxoTY）进而生成6-Deoxocastasterone（6-deoxoCS），再生成Castasterone（CS），最终转化为BL。以上六个反应分别由六种主要酶参与，依次为CYP90B1、CYP90A1、DET25α、CYP90C1/D1、[5]CYP85A1/A2、CYP85A2。除DET25α外同属于细胞色素P450酶类(CYPs)。1.1.3油菜素内酯的生理作用油菜素内酯是一种广谱的促生长的植物激素，在多种植物生长发育进程中发挥作用。在细胞层面，BR能够控制细胞的伸长、分裂与分化。在植物整体水平，BR能够调控光形态建成和暗形态发生，下胚轴的伸长，根的生长发育，花期等生理过程。1.1.3.1促进细胞伸长早在BR激素被分离纯化之前人们就已经知道油菜花粉的提取物能够促进植物茎秆的伸长[1]。在对一系列拟南芥BR缺失和BR不敏感突变体的研究发现，多数突变体的细胞伸长迟缓，表现为黑暗条件下下胚轴长度缩短和光下的极端矮化株型[39]。对于BR缺失突变体cpd和dwf4的矮化表型，只有补充BR激素才能使其恢复为野生型状态，其他激素没有这种效果[40,41]。在另一个细胞伸长被抑制的BR缺失突变体bul1-1中，其细胞骨架的显微观察发现，一种平行的微管组织减少了[42]。在水稻BR缺失突变体brd1中，BRC-6氧化酶失活，使叶片和茎细胞表现出反常的组织结构和极性伸长，导致多个器官组织出现发育缺陷[43]。随着分子生物学和基因研究的深入，人们发现BR对细胞伸长的促进作用3 吉林大学博士学位论文很大程度上依赖于XET基因的表达，XET的功能是将木葡聚糖整合进生长的细胞壁中。大豆的BRU1基因和拟南芥的TCH4基因都被报道编码XET蛋白，在伸长的最初阶段，他们都被BR高效的诱导表达[44,45]。在棉花中，BR能够通过促进纤维细胞的伸长而促进棉花纤维的生长[46]。但是，BR高浓度过高也会对细胞的伸长造成抑制，此种作用突出表现在主根的生长和侧根的形成中[47]。1.1.3.2促进细胞分裂在体外培养条件下，BR能够促进白菜原生质体和薄壁细胞的分裂[48,49]。BR调控细胞分裂的机制可能为上调了CycD3基因的表达，CycD3是一种D型细胞周期蛋白，在促进拟南芥幼苗的细胞分裂中发挥一定作用[50]。但是，仍有证据表明，在体外培养条件下，BR并不能促进胡萝卜和烟草细胞的分裂[51,52]，而显微观察的结果也显示，BR缺失和不敏感突变体的矮化表型并不是细胞数量的减少造成的，而主要是细胞变小的缘故[53]。因此，BR对细胞分裂的促进作用有待进一步的研究。1.1.3.3促进细胞分化BR能够促进维管束尤其是木质部的分化。BR信号途径受损或合成受阻的缺陷突变体，如bri1–116，bri1–301[11,54]，bin2[54]，cpd[55]等，都出现了不同程度的维管束数目减少的情况，相反，在BR信号途径增强或BR水平增高的突变体或转基因植株中，维管束的数目增多[56]。尤其在拟南芥功能缺陷型突变体brl1中，韧皮部与木质部的分化比率失常，并伴随维管束发育缺陷，bri1brl1brl3三重突变体不仅加重了bri1的矮化表型，也出现了不正常的维管束分化[57]。另外，除BRL1基因在各组织中普遍表达外，BRL2和BRL3基因都主要在维管束组织中表达[57]。在两种研究木质部分化的组培体系，菊芋(Helianthustuberosus)外植体培养体系[58]和百日草（Zinniaelegans）叶肉细胞悬浮培养体系[59]中都发现外源施加的BR能够促进木质部分化。一般情况下，木质部诱导培养基将菊芋块茎外植体诱导为木质部组织需要3到4天的时间，且在最初的24小时中，只有少量维管组织出现；但在培养基中添加BR后，木质部的分化速度增加了近十倍，而且，木质部结构和细胞数量都有显著增加[58]。在百日草叶肉细胞培养体系中加入烯效唑，一种植物生长阻滞剂，能够抑制叶肉细胞分化为导管分子。而外源BR能够抵消烯效唑的抑制作用，促进导管分子的形成[59]。4 第1章前言1.1.3.4光响应调节种子的发育是一个从黄化（暗形态发生）到脱黄化（光形态建成）的过程，这一过程通过光抑制细胞伸长同时促进叶绿素合成和叶片展开而得以实现。BR不仅在细胞伸长中非常重要，而且需要其压制暗条件下的光诱导基因[60-64,41]。虽然一般观点认为环境因素通过改变植物激素来影响植物的生长，但光并没有明显作用于BR含量水平或BR信号途径的上游[65,66]。相反，BR信号途径似乎能够通过BZR1多层次的调控光信号途径[67]。首先，BZR1能够抑制光信号网络中正向调节因子的表达水平并激活反向调节因子[68,65,64]。BZR1还能够直接与PIFs结合，共调控一系列光响应和BR响应基因[69]。PIFs是光形态建成的反向调节因子，可与光激活的光敏色素相互作用而被降解，但是会在黑暗，阴影和热激条件下提高表达[70]。FIPs和BZR1直接相互作用相互依存，调控许多下游基因，包括编码细胞壁和叶绿体的功能蛋白和转录因子[69]。1.1.3.5对根发育的调节虽然BR一般被认为是一种促进生长的激素，但是BR对于根生长的作用是有剂量效应的[71]。最近的研究表明，只有当BR对于细胞分裂和分化的作用达到一种平衡时才能获得理想的根生长状态和稳定的分生组织[72,73]。BR能够促进有丝分裂和根分生组织中CYCLIND3和CYCLINB1的表达[72,73]。然而，高浓度的BR加速细胞的分化与伸长，减小分生组织的尺寸和减弱根的生长。BR也促进静止中心的分裂和柱状细胞的分化[72]。有趣的是，用表皮特异启动子控制BRI1基因的表达能够恢复bri2突变体的根生长。表明BR在表皮层的感知就能够控制根的生长和分生组织的尺寸。这一过程很有可能是通过一个可运动的因子进行调控的而不是BZR1或BZR2[73]。1.1.3.6对下胚轴伸长的调节BR与生长素、赤霉素和乙烯共同调控下胚轴的伸长。植物幼苗在光下和暗处萌发时，BR通过调控多种生长素响应基因尤其是生长素转运相关基因的表达调控下胚轴的伸长[74]。BR能够与生长素而不是赤霉素共同作用促进南瓜下胚轴的伸长[75]。而且，BR能够通过加强豌豆向地性生长中有重要作用的生长因子的活性加速下胚轴的生长[76]。另外，BR可能作用于乙烯途径下游，因为外施BR能够抑制hookless突变体对乙烯的不敏感性[77]。另有报道显示，一种在5 吉林大学博士学位论文正常花粉管接受和细胞伸长中不可缺少的受体激酶FERONIA可能参与BR信号途径，其在黄化苗下胚轴的伸长中与乙烯作用相反[78]。BR还能通过增加细胞壁的延展性促进小白菜下胚轴的伸长[79]。1.1.3.7对花期的调节在对油菜素内酯相关突变体dwf4[40]、det2[60]、bri1[80]和cpd[11]的研究中都出现了对其花期延迟现象的报道。det2突变体中内源BR的含量很低，只有野生型的10%[81]。dwf4和cpd突变体是BR合成缺陷突变体，内源积累了较多的BR合成前体[40,41]。bri1突变体中也被报道含有较高水平的BR前体物质[82]。因此，内源BR及其前体物质在植物体内的含量变化可能对开花时间产生影响。bri1突变体中BR信号转导途径的受损，致使开花抑制基因FLC(FLOWERINGLOCUSC)的表达被加强，也因此花期延迟[80]。另外，外施BR能够调控CCA1(CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1)、CCR2(COLDANDCIRCADIAN-REGULATED2)和CAB2(CHLOROPHYLLA/BBINDINGPROTEIN2)基因的表达[83]，这些基因是开花途径中重要的生物钟基因，通过调节生物节律控制开花时间。而且光信号还能够调节BR合成基因CPD的表达[84]。1.2植物开花的分子机制研究进展1.2.1四大开花途径随着分子生物学和遗传学的深入研究，已在模式植物拟南芥中建立了较为完整的开花分子机制模型，主要分为4个开花诱导途径：光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主途径[85]。昼夜长短变化控制植物开花的现象被称为植物的光周期反应。外界的光长信号能够被叶片中的光受体捕捉和感知，并由内部的生物钟系统对信号进行衡量，符合诱导条件的光长信号能够诱导下游成花关键基因CO(CONSTANS)、FT(FLOWERINGLOCUST)的表达，FT的表达产物长距离运动到茎尖，启动茎尖分生组织中花发育基因AP1(APETALA1)、SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1)和LFY(LEAFY)的表达，引起成花转变。此为光周期途径的主要通路。6 第1章前言春化途径(Vernalizationpathway)是经一段时间的低温处理加快植物开花进程的现象。FLC基因在春化途径中发挥主要作用。它是一种开花抑制因子，其编码的含MADS结构域的转录因子能够直接或间接的抑制开花关键基因FD(FLOWERINGLOCUSD)、FT和SOC1的表达[86,87]。低温通过诱导组蛋白甲基化改变FLC染色质结构，关闭其表达以解除抑制，启动开花程序[88]。赤霉素（GA）作为一种植物激素，能够调控植物生长发育的多个方面，同时直接或间接的作用于植物开花相关基因从而诱导和调控花的发育。它一方面直接参与促进FT、SOC1、LFY开花关键基因的表达，推动花发育的进程，另一方面降解DELLA蛋白解除花器官形成基因的抑制，保证花器官的发育[89-91]。环境因子能够诱导植物成花，但在缺乏诱导而营养生长状态又满足要求的情况下，植物可以自行启动开花，被称作植物的自主开花途径。此途径的主要基因有：FLD、LD、FLK、FY、FCA、FPA、FVE。各基因相互独立，平行作用于FLC基因，通过对FLC基因的表达抑制开启成花转变[92,93]。这四条途径在前期感知和诱导阶段都相对独立，但最终整合于开花途径的几个关键基因：FT、SOC1和LFY。最终引起茎尖分生组织向花分生组织的转变，开启花器官的建成与发育，最终导致开花。FT基因是一个非常重要的整合点，它不仅汇总了四条途径的开花信号，还通过长距离运动联通了感应部位（叶片）与反应部位（茎尖）。1.2.2光周期途径分子机制光周期途径的反应过程主要分为4个阶段：光信号的感知、生物钟的评测、信号的长距离转运和成花的启动。植物体内存在一系列光受体蛋白，能够感知光照的长短和强弱。在植物的光周期开花调节中主要有2类9种光受体的参与，分别是PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE五种吸收红光和远红光的光敏色素，和CRY1、CRY2两种吸收蓝光和紫外光的隐花色素[94]。其中，PHYA能够促进开花[95,96]；而PHYB[97]、PHYD和PHYE[98,94]抑制开花启动；CRY2在长日照条件下对具有开花促进效应[99]；CRY1也能够促进开花[100]。活化的光受体激活下游基因PIF3、ELF3、FKF1，将光信号传递给生物钟系统。生物钟是植物内置的自发生物节律，以接近24小时为一个周期。上游传导7 吉林大学博士学位论文而来的光长信号引起生物钟核心组分的振荡表达，诱导其振荡模式与昼夜模式达成一致。核心组分的日规律性表达模式能够调控下游与生长发育相关基因的表达，从而将光长信号转变为生理信号[101]。生物钟系统的主要基因有：TOC1、CCA1、LHY、GI、ELF3、ELF4和LUX。它们共同组成多种连锁反馈环[102-105]。在光周期途径中，生物钟的信号输出主要是调控下游CO基因的表达，一方面调控COmRNA的昼夜节律变化，另一方面通过调控CO蛋白的降解控制CO的积累[106]。从而启动下游开花基因。在诱导光长下，CO启动下游FT基因的表达。FT是开花关键基因，目前的研究表明FT蛋白是成花素的主要成分。它在叶片中被诱导产生，其表达产物能够通过韧皮部筛管长距离运动到茎尖分生组织[107]。FT蛋白与茎尖分生组织中的FD蛋白相结合，FT-FD活性复合物能够激活下游开花基因的表达，主要有SOC1、AP1、AGL24和LFY。使茎尖分生组织向花分生组织的转变，启动花的发育[108]。1.3油菜素内酯相关基因与开花调控1.3.1BRI1基因的研究进展及其与开花时间的关系BRI1基因编码油菜素内酯受体蛋白，在BR信号转导途径中发挥BR分子的胞外接收和胞内激活作用。在水稻和大麦的研究中发现，人工调控BRI1基因的表达量可以构建半矮化植株，在密植条件下获得高产[109,110]。最近又有报道显示，BRI1基因与开花途径具有密不可分的关系，BR不敏感突变体bri1能够增强自主开花途径突变体ld的晚花表型。双突变体bri1fca和bri1FRI的开花时间比fca和FRI自主途径突变体的更加延迟。所有这些双突变体内的FLC基因表达量都有所升高。用RNA干涉的方法在双突变体bri1ld中抑制FLC基因表达可以挽救晚花表型。两个油菜素内酯途径基因的双突变体cpdld也出现开花延迟的表型，而且FLC基因的表达水平也增高。与ld突变体相比，bri1ld双突变体中组蛋白H3的乙酰化程度增强了。由此可以看出，BRI1基因可以通过控制FLC基因的表达调控开花时间[80]。8 第1章前言1.3.2CPD基因的研究进展及其与开花时间的关系CPD(CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENESISANDDWARFISM)基因被称作持续光形态建成与矮化基因，最早分离自拟南芥cpd突变体。该突变体生长受到严重抑制，主要表现为植株极端矮化，叶片皱缩且雄性不育。暗培养条件下表现为去黄化现象。外源施加生长素、细胞分裂素以及赤霉素等植物激素，其表型不能被恢复，而施加C-23轻化的BR中间物，表型可以恢复。因此，推测CPD编码一种重要BR合成酶(CYP90A1)，催化C-23轻化反应[41]。但最近发现CYP90C1和CYP90D1才是真正的C-23轻化酶[37]，因此推测CPD在C-23经化之前的反应中起作用，CPD编码一种细胞色素P450单加氧化酶基因，在BR合成过程中可能作为C-3氧化酶起限速作用，催化22-OH-CR转化成22-OH-4-en-3-one[111]。目前，拟南芥[112,113]、水稻[5]中的CPD基因功能与表达模式已有相关研究，但CPD基因在大豆中的研究还较少。用CPD::LUC系统检测到CPD基因表达具有日节律性。CPD的日节律性表达在BRI1突变体中也能够维持，表明这种表达模式的出现不是BR信号的反馈调节。然而，这种日节律性却表现为光依赖性和生物钟调控。CPD在光敏色素缺陷和红光诱导的野生型植株中表达下降，说明CPD表达的光调控主要依赖光敏色素信号；CPD表达量的节律性变化和植物体内BR含量的变化同步，使BR激素在光照阶段的中期积累；CPD表达在黑暗条件下受抑制，且BR的水平也未有升高；而且光线也能够影响植物对BR的敏感性[114]。另外，短日生长7天的CPD::LUC植株在连续光照和连续黑暗的条件下仍能保持之前的表达节律；对CPD启动子分析发现，其上存在光响应元件和CCA1结合区；喷施BR后能够缩短连续日照和连续黑暗情况下的CCA1的节律周期；cpd突变体中，CCR2的节律周期延长，外加BR后CAB2的节律周期缩短[83]。说明BR途径与生物钟系统存在互作，共同调控开花时间。1.4本研究的目的和意义大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。而倒伏问题一直是困扰大豆高产稳产的主要问题之一。倒伏使大豆平均减产56.1%，当倒伏发生在开9 吉林大学博士学位论文花或结荚期时减产率会更高。在大豆育种中，抗倒伏性是被关注的重要性状之一。一般选取株型适中，抗倒伏能力强的植株作为亲本，挖掘品种在密植条件下的高产潜能。作物的进化和品种演变在很大程度上也是株型改良的结果。以往对作物株型的改良和调节是在发现或创造优异材料的基础上进行常规育种,或者通过改变外界环境条件来影响植物器官的形态建成。近年来,随着分子生物学的发展，对BRI1和CPD等控制株型性状和植物总体生长状况的基因进行克隆和验证，为通过分子手段设计和改造作物株型提供了理论基础，为培育高产大豆品种创造了条件。大豆是典型的短日植物且生育期多样。在不同地区，同一大豆品种的开花期会发生较大改变，造成生育期不适，影响产量潜力的发挥，限制了大豆优良品种的全国性推广；在同一地区，由于不同品种间的生育期差异，致使花期不遇，相互杂交较为困难，难以大量利用异源种质资源，导致育成品种遗传基础狭窄，限制了大豆产量的大幅度提高。目前迫切需要利用分子育种手段，通过对外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，对大豆生育期进行定向调节。我们关注的FT基因是光周期反应中关键的开花促进基因且是四大开花途径的整合点；BRI1和CPD基因也被报道与开花途径基因相作调控植物开花时间。因此，对油菜素内酯途径关键基因GmBRI1和GmCPD以及开花途径关键基因GmFT2a的功能研究以及关联性分析为完善大豆植株的株型构建和生育期改造提供了可能，从而实现大豆广适应性和丰产性的双重突破。10 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析2.1材料2.1.1植物材料选用大豆基因组测序品种William82作为实验材料，品种由本实验室扩繁与保存。2.1.2菌株大肠杆菌（E.coli）DH5α2.1.3酶及试剂TRNzol总RNA提取试剂和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自全式金生物技术有限公司；植物DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；高保真LongAmp®TaqDNA聚合酶购自NEB公司；pMD™18-TVectorCloningKit购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞和DNA分子量标准购自康润生物；引物合成和基因序列测定由华大基因完成。2.1.4引物引物名称用途5'到3'序列GmBRI1-S基因克隆CTTAACCTTTCACCTTCCATATCTGGmBRI1-A基因克隆TGTCTGTTTCCCAAAGAATCCACGmCDP1-F基因克隆ATGGCATCTTTCATCATCATACCACGmCDP1-R基因克隆TCATGGCGATTTACTTAGTCTGGACGmCDP2-F基因克隆ATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGGmCDP2-R基因克隆TCATGGCGATTTACTTAGTTTGGACGmCDP3-F基因克隆ATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCCAA11 吉林大学博士学位论文GmCDP3-R基因克隆CTAGTCTCTACGCTGCACAATAATTGmCDP4-F基因克隆ATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTGmCDP4-R基因克隆CTAATGTCTACGCTGCACAATAATA2.1.5主要仪器设备PCR扩增仪；电泳仪；高速台式离心机；恒温摇床；紫外凝胶成像仪；电热恒温培养箱；-80℃超低温冰箱；超净工作台；紫外分光光度计；电热恒温水浴锅；连接仪；pH计；万分之一天平；灭菌锅；电热恒温水浴锅；连接仪；冷冻离心机；金属浴；光照培养箱2.2方法2.2.1DNA提取（参照天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒说明书）1．取William82的新鲜叶片约100mg，在液氮中快速充分研磨至粉末状；2．将缓冲液GP1在65℃水浴中预热，取700µl加入离心管中，液氮研磨后的粉末也迅速转移到此离心管中，立刻颠倒混匀，然后放入65℃水浴中，水浴过程中多次颠倒混合离心管内样品，20min后取出；3．然后向离心管中加入700µl氯仿，充分混匀，12000rpm，离心5min；4．吸取上层水相，转入新离心管，再加入缓冲液GP2700µl，充分混匀；5．混合液转移入吸附柱CB3中，12000rpm，离心30sec，倒掉废液；6．加入500µl缓冲液GD于吸附柱CB3中，12,000rpm，离心30sec，倒掉废液；7．加入600µl漂洗液PW于吸附柱CB3中，12,000rpm，离心30sec，倒掉废液，并将此步骤重复一次；8．吸附柱CB312,000rpm空转2min，弃掉收集管，吸附柱CB3放入干净的离心管中，室温放置10分钟左右，晾干；10.向吸附柱CB3的吸附膜中间部位悬空滴加55℃预热的无菌水50μl，室温放置1min帮助溶解，12000rpm，离心1min，收集到离心管中的溶液即为DNA12 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析溶液；11.DNA溶液-20℃保存。2.2.2Trizol法提取植物总RNA(参照天根公司的TRNzol总RNA提取试剂说明书)1)取已冷冻的新鲜叶片于液氮中，用研杵迅速充分研磨，其间不断加入液氮，保持研钵中总有液氮，直至研磨成粉末状；2)将样品转移入1.5ml无RNase离心管中，并加入1mlTRNzol，震荡混匀，室温放置5min；3)加入200μl氯仿，剧烈充分振荡，室温放置2min；4)4℃，12000rpm，离心10min，吸取最上层水相500μl到新离心管中；5)在得到的水液中加入500μl异丙醇，缓慢的上下颠倒混匀，室温放置10min；6)4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；7)加入1mlRNase-FreeddH2O配置的75%乙醇，上下颠倒洗涤沉淀；8)4℃，5000rpm，离心8min，倒出上清液，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀，室温放置10min左右，晾干；9)加入30μlRNase-FreeddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA，-80℃保存。2.2.3cDNA的合成(参照天根公司的TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix说明书)1)配制反应体系，如下：Component20μlVolumeTotalmRNA2μgRandomPrimer(0.1μg/μl)1μl2³TSReactionMix10μlTransScript®RT/RIEnzymeMix1μlgDNARemover1μl1μlRNase-freeWaterto20μl13 吉林大学博士学位论文2)在PCR仪中进行孵育，程序如下：25℃10min42℃30min85℃5min3)反应液-20℃保存。2.2.4GmBRI1/GmCPD基因的PCR扩增用LongAmp®TaqDNA聚合酶（NEBM0323）扩增GmBRI1/GmCPD基因1）PCR反应体系如下：试剂成分25l反应体系5×PCRBuffer5μlLongAmpTaq1μlGmBRI1-S(10μM)1μlGmBRI1-A(10μM)1μldNTP(2.5mM)3μlWilliam82DNA4μlddH2O10μl2）设定PCR程序为：StepTemperatureDurationCyclesEnzymeactivation95℃2minholdDenature95℃30secAnnel55℃30sec33cyclesExtend65℃3min20sec/1min50secExtend65℃10minhold3）PCR的扩增产物回收纯化后进行琼脂糖凝胶电泳。2.2.5PCR产物回收（参照天根公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书）1.切下琼脂糖凝胶中的目的条带，放入灭菌的离心管；14 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析2.加入溶液PN，加入的量为1g/mL，50℃下溶胶，其间不断颠倒，加速溶解；3.胶的溶解液转入吸附柱CA3中，室温条件下2min，然后12000rpm，离心1min，弃废液；4.加入600μl洗液PW于吸附柱CA3中，12000rpm，离心1min，弃废液，再重复此步骤一次。5.吸附柱CA312,000rpm空转2min；6.吸附柱CA3放入干净的离心管中，室温放置10分钟左右，晾干；7.向吸附柱CA3的吸附膜中间部位悬空滴加55℃预热的无菌水50μl，室温放置1min帮助溶解，12000rpm，离心1min，收集到离心管中的溶液即为回收产物；8.回收产物-20℃保存。2.2.6回收产物连接T载体（参照TaKaRa公司的pMD™18-TVectorCloningKit说明书）1.反应液体系配制如下：Component10μlVolumeSolutionI5μlpMD18-TVector1μl回收纯化的PCR产物4μl2.16℃条件下，反应3h；2.2.7冻融法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞1）从一80℃冰箱中，取出大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自康润生物），冰上融化；2）将全部的10μlT载体连接产物加入100μl的感受态细胞中，缓慢混匀后冰浴30min；3）42℃条件下热激60sec，冰上放置5min；4）加入800μlLB液体培养基，37℃摇床200rpm振荡培养1h；5）在超净工作台中，取100μl菌液加入含50μg/mlAmp的LB固体培养基中，用灭菌后的涂布棒均匀涂布在固体培养基表面；15 吉林大学博士学位论文6）37℃下倒置培养12-16h，待长出明显菌落时取出；7）在超净工作台中挑取单菌落，加入1mlLB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养3h；8）取1μl菌液为模板进行菌落PCR，鉴定为阳性的菌液，取700μl加入300μl50%无菌甘油进行保菌，剩余300μl送北京六合华大基因公司测序；2.2.8生物信息学分析在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行基因和蛋白序列的搜索。使用NCBI的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)进行序列分析及比对。利用软件Primer5进行引物设计。根据软件EXPASY(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)和DNAMAN分析蛋白质理论分子质量和等电点。应用ClustalW2进行同源序列比对。通过MEGA5.02构建系统进化树。利用PHYRE(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre)预测蛋白三级结构。2.3结果2.3.1GmBRI1基因的克隆用AtBRI1基因(GenBank检索号：AAC49810)的蛋白序列在NCBI的大豆cDNA数据库中进行比对，搜索获得与AtBRI1基因同源性最高的大豆cDNA序列，命名为GmBRI1（Glyma06g15270,GenBank检索号：XM_003526791）。此序列与其同源序列AtBRI1一样没有内含子，所以可以在DNA中克隆其编码序列。因此，我们以大豆William82品种的DNA为模板，用引物GmBRI1-S和GmBRI1-A进行PCR反应，扩增得到长度为3632bp的DNA片段（图2.1），此DNA片段回收纯化后与pMD18-Tsimple载体连接，挑取阳性克隆，经测序后，发现有一个阳性克隆的序列与预测的GmBRI1基因序列完全一致，此克隆既为获得的GmBRI1基因。16 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析图2.1GmBRI1基因的PCR扩增产物电泳图谱Marker：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1,2,3：GmBRI1基因的PCR扩增产物；4：阴性对照Fig.2.1PCRproductsofGmBRI1Marker:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1,2,3:PCRofGmBRI1;4：Nagetivecontrol2.3.2GmBRI1基因的生物信息学分析2.3.2.1GmBRI1蛋白的氨基酸序列特征分析及同源比对GmBRI1基因的开放阅读框为3555bp，编码了1184个氨基酸。预测GmBRI1蛋白的分子量为129.33kDa，等电点pI=6.27。用GmBRI1蛋白质的氨基酸序列与其他物种BRI同源蛋白的氨基酸序列进行比对（图2.2），发现GmBRI1与拟南芥AtBRI1的同源性为69%；与另一种十字花科植物油菜（Brassicanapus）的BnBRI1同源性为67%。GmBRI1与豆科植物BRI的同源性更高，与苜蓿（Medicagotruncatula）MtBRI1的同源性为80%，而与豌豆（Pisumsativum）PsBRI1的同源性高达81%。其与可可（Theobromacacao）TcBRI1的同源性为73%，与单子叶植物水稻（Oryzasativa）OsBRI1的同源性为54%。以上结果可以发现，GmBRI1与其他物种BRIs之间有很高的同源性。17 吉林大学博士学位论文图2.2GmBRI1蛋白与其他物种BRIs的序列同源比对与结构域分析七个序列全部相同的区域标记为黑色，有四到六个序列相同的区域标记为灰色，其他无标出；预测的结构域在相关区域标出；物种名缩写：Gm，Glycinemax；At,Arabidopsis;Bn,Brassicanapus;Mt,Medicagotruncatula;Ps,PisumSativum;Tc,Theobromacacao;Os,Oryzasativa；GenBank基因检索号：GmBRI1,XP_003526839;PsBRI1,BAC99050.1;MtBRI1,XP_003602504.1;TcBRI1,EOX92323.1;BnBRI1,AFU83229.1;AtBRI1,AAC49810;OsBRI1,NP_001044077.1.Fig.2.2MultiplealignmentofthededucedGmBRI1proteinwithbrassinosteroidinsensitive(BRIs)fromvariousspecies(Gm，Glycinemax；At,Arabidopsis;Bn,Brassicanapus;Mt,18 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析Medicagotruncatula;Ps,PisumSativum;Tc,Theobromacacao;Os,Oryzasativa).Thepredictedfunctionaldomainsaremarkedintherelativepositions.TheaminoacidsequenceswereobtainedfromtheNCBIproteindatabase.Theaminoacidsequencesthatareidenticalinallsevenmoleculesareshadedblack,whilesequencesthatareconservedinfourtosixspeciesareshadedgray;Theaccessionnumbersareasfollows:GmBRI1,XP_003526839;PsBRI1,BAC99050.1;MtBRI1,XP_003602504.1;TcBRI1,EOX92323.1;BnBRI1,AFU83229.1;AtBRI1,AAC49810;OsBRI1,NP_001044077.1.2.3.2.2GmBRI1蛋白的进化树分析应用进化树分析软件分析了不同物种来源BRIs之间的进化关系（图2.3）。结果表明，GmBRI1与豆科植物来源的BRIs，如豌豆（Pisumsativum）的PsBRI1和苜蓿（Medicagotruncatula）的MtBRI1，之间的亲缘关系最近；与十字花科植物BRIs，拟南芥AtBRI1和油菜（Brassicanapus）BnBRI1，也有较近的亲缘关系。双子叶植物同在一个进化分枝上，单子叶植物，如水稻（Oryzasativa）OsBRI1，虽亲缘关系也较近，但单独为一分枝。总体看来，各BRIs之间亲缘关系都较近，说明他们有共同的起源。图2.3GmBRI1蛋白的进化树分析GenBank基因检索号：GmBRI1,XP_003526839;PsBRI1,BAC99050.1;MtBRI1,XP_003602504.1;TcBRI1,EOX92323.1;BnBRI1,AFU83229.1;AtBRI1,AAC49810;NbBRI1,ABO27628.1;StBRI1,ABO27627.1;SlBRI1,AAN85409.1;OsBRI1,NP_001044077.1.19 吉林大学博士学位论文Fig.2.3PhylogeneticanalysisofGmBRI1andhomologsfromotherorganisms.Abootstrapconsensustreewasgeneratedusingtheneighbor-joiningmethodinMEGA5.02.Thebootstrapvaluesfrom1000bootstrapreplicatesareshownnexttothebranches.Theaccessionnumbersareasfollows:GmBRI1,XP_003526839;PsBRI1,BAC99050.1;MtBRI1,XP_003602504.1;TcBRI1,EOX92323.1;BnBRI1,AFU83229.1;AtBRI1,AAC49810;NbBRI1,ABO27628.1;StBRI1,ABO27627.1;SlBRI1,AAN85409.1;OsBRI1,NP_001044077.12.3.2.3GmBRI1蛋白结构域的同源性分析对GmBRI1蛋白的结构域预测发现，其包含BR受体蛋白所需具备的全部特征结构和功能域，如N端信号肽，LRR，激酶催化域和C端尾巴（图2.2）。并且，GmBRI1与其他物种BRIs结构域的同源性都很高，尤其是激酶催化域和LRR区的保守性非常高（图2.2）。GmBRI1与AtBRI氨基酸序列的同源性为69%，而激酶催化域的同源性达到92%；LRR，这一BR受体蛋白的特征基序，相似性也达到了64%；保守性较弱的是N端信号肽，但同源性也达到了53%。结果表明，GmBRI1蛋白具备了富含亮氨酸重复单位的蛋白激酶受体所应具备的所有结构域。这些结构域在受体结合BR分子并活化下游反应上都是必须的，那么GmBRI1蛋白也极有可能具备了BR受体的结合与活化功能。2.3.2.4GmBRI1蛋白的三级结构预测对GmBRI1蛋白的三级结构进行预测，与AtBRI1蛋白三级结构进行比较，发现两者的结构极为相似，除了N端稍有不同外，结构几乎相同。从结构域分析的结果可以看出，N端是信号肽区。信号肽在蛋白的加工和膜定位中发挥重要作用。不同物种间的蛋白加工转运机制的不同可能是信号肽区域结构差异的原因。GmBRI1与AtBRI1蛋白结构上的相似性预示着二者功能相似的可能性。20 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析图2.4GmBRI1与AtBRI1蛋白的三级结构预测红色箭头指出了结构差异区域Fig.2.4PredictedtertiaryproteinstructureoftheGmBRI1andAtBRI1proteins.Arrowsindicatethedifferingregion.2.3.3GmCPD基因的克隆用AtCPD(GenBank检索号：XP_002873219)氨基酸序列在NCBI的大豆cDNA数据库中进行比对，搜索获得4个与AtCPD基因同源性最高的大豆cDNA序列，分别命名为GmCPD1（GenBank检索号：XM_003545184.1）、GmCPD2（GenBank检索号：XM_003519345.1）、GmCPD3（GenBank检索号：XM_003552797.1）和GmCPD4（GenBank检索号：XM_003538412.1）。我们以大豆William82品种的cDNA为模板，分别用引物GmCPD1-S和GmCPD1-A、GmCPD2-S和GmCPD2-A、GmCPD3-S和GmCPD3-A、GmCPD4-S和GmCPD4-A进行PCR反应，扩增得到长度分别为1437bp、1440bp、1425bp和1419bp的DNA片段（图2.5），4组DNA片段分别回收纯化后与pMD18-T载体连接，挑取阳性克隆，经测序后，每组获得的测序序列与预测的基因序列完全一致的克隆既为获得的目的基因，分别命名为GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4。21 吉林大学博士学位论文图2.5GmCPD基因的PCR扩增产物电泳图谱M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1：GmCPD1基因的PCR扩增产物；2：GmCPD2基因的PCR扩增产物；3：GmCPD3基因的PCR扩增产物；4：GmCPD4基因的PCR扩增产物Fig.2.5PCRproductsofGmCPDMarker:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1:PCRofGmCPD1;2:PCRofGmCPD2;3:PCRofGmCPD3;4:PCRofGmCPD42.3.4GmCPD基因的生物信息学分析2.3.4.1GmCPD蛋白的氨基酸序列特征分析及同源比对氨基酸序列同源比对结果（图2.6）显示，4个GmCPD之间的氨基酸序列一致性都较高，最高达到97%，最低也为82%。在与拟南芥CPD氨基酸序列的比对中，GmCPD1与AtCPD的氨基酸序列相似性最高，为81%；GmCPD2与AtCPD的氨基酸序列相似性最低，为79%。与其他物种来源的CPD氨基酸序列进行比对发现，4个GmCPD与苜蓿（Medicagotruncatula）的MtCPD1（XP_003616626）氨基酸序列相似性为81-87%；与黄瓜（Cucumissativus）的CsCPD（XP_004149251）氨基酸序列相似性为75-77%；与杨树（Populustrichocarpa）的PtCPD（XP_002311214）氨基酸序列相似性为76-80%；与水稻（Oryzasativa）的OsCPD1（NP_001066117）氨基酸序列相似性为59-63%。以22 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析上的结果表明，各物种来源的CPD都具有高度的保守性。图2.6大豆GmCPD与其他物种CPD氨基酸同源序列比对黑色为完全匹配一致；有4个细胞色素P450结构域：PROLINE(脯氨酸富集区域)、DomainA(氧结合区)、DomainB(类固醇结合区)和HEME-Binding（血红素结合区）；箭头代表有重要功能的氨基酸残基；各蛋白的Genebank检索号为：AtCPD(XP_002873219),GmCPD1(XP_003545232.1),GmCPD2(XP_003519393.1),GmCPD3(XP_003552845.1),GmCPD4(XP_003538460.1),MtCPD1(XP_003616626),PtCPD(XP_002311214),CsCPD(XP_004149251),OsCPD1(NP_001066117).Fig.2.6GmCPDaminoacidsequencehomologywithsequencesofAtCPDExactmatchesareboxedinblack;FourdomainsfoundincytochromeP450s:Proline-rich,A(dioxygen-binding),B(steroid-binding)andheme-bindingareunderlined.Arrowheads:Aminoacidresidueswithimportantfunction;Theaccessionnumbersareasfollows:AtCPD(XP_002873219),GmCPD1(XP_003545232.1),GmCPD2(XP_003519393.1),GmCPD3(XP_003552845.1),GmCPD4(XP_003538460.1),MtCPD1(XP_003616626),PtCPD(XP_002311214),CsCPD(XP_004149251),OsCPD1(NP_001066117).23 吉林大学博士学位论文2.3.4.2GmCPD蛋白的进化树分析采用MEGA软件分析拟南芥等14个已报道CPD与4个大豆GmCPD的进化关系，结果(图2.7)显示，18条CPD氨基酸序列分为双子叶植物和单子叶植物2簇，4个GmCPD都与双子叶植物同源关系更近。双子叶植物主要分为两大簇，一簇是来自拟南芥、野草莓、黄瓜和杨树的CPDs的聚类；4个大豆来源的CPD与苜蓿，鹰嘴豆、葡萄来源的CPDs聚于另一簇上。4个GmCPD中，GmCPD1和GmCPD2亲缘关系最近，与豆科植物来源的CPD，如苜蓿（Medicagotruncatula）的MtCPD1、MtCPD2和鹰嘴豆（Cicerarietinum）的CaCPD，亲缘关系也较近，聚类于一簇。GmCPD3与GmCPD4则另立一簇。总体看来，各CPDs之间较近的亲缘关系说明他们有共同的起源。图2.7基于NJ法构建的CPD蛋白质系统进化树各蛋白的Genebank检索号为：AtCPD(XP_002873219),GmCPD1(XP_003545232.1),GmCPD2(XP_003519393.1),GmCPD3(XP_003552845.1),GmCPD4(XP_003538460.1),MtCPD1(XP_003616626),MtCPD2(XP_003600878),CaCPD(XP_004490985),CsCPD(XP_004149251),FvCPD(XP_004307639),PtCPD(XP_002311214),VvCPD(XP_002270553),OsCPD1(NP_001066117),OsCPD2(NP_001065721),BdCPD(XP_003578946),SiCPD(XP_004978643),SbCPD(XP_002450249),ZmCPD(NP_001140596).Fig.2.7PhylogenetictreeofCPDproteinsbyneighbor-joiningmethod24 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析Theaccessionnumbersareasfollows:AtCPD(XP_002873219),GmCPD1(XP_003545232.1),GmCPD2(XP_003519393.1),GmCPD3(XP_003552845.1),GmCPD4(XP_003538460.1),MtCPD1(XP_003616626),MtCPD2(XP_003600878),CaCPD(XP_004490985),CsCPD(XP_004149251),FvCPD(XP_004307639),PtCPD(XP_002311214),VvCPD(XP_002270553),OsCPD1(NP_001066117),OsCPD2(NP_001065721),BdCPD(XP_003578946),SiCPD(XP_004978643),SbCPD(XP_002450249),ZmCPD(NP_001140596).2.3.4.3GmCPD蛋白的结构域分析对GmCPD的保守域分析结果显示，其属于细胞色素P450亚家族。主要的功能域有：脯氨酸富集区域、氧结合区、类固醇结合区和血红素结合区。序列比对结果（图2.6）显示，4个GmCPD和拟南芥AtCPD的氧结合区序列一致性为100%；在类固醇结合区，4个GmCPD的氨基酸序列完全一致，和AtCPD仅差一个氨基酸；其他两个功能域的序列相似性也在90%以上；各功能域的关键氨基酸也完全一致。因此推测GmCPD具有与拟南芥AtCPD类似的功能。2.3.4.4GmCPD基因的染色体定位根据SoyBase(http://www.soybase.org)和Phytozomedatabase(http://phytozome.jgi.doe.gov)两个数据库上提供的大豆序列信息，将4个GmCPD同源基因进行了染色体定位。结果（图2.8）显示，4个GmCPD基因分别定位在不同的染色体上：GmCPD1(Glyma.14g059900)定位于染色体Gm14(B2)；GmCPD2(Glyma.02g256800)定位于染色体Gm02(D1b)；GmCPD3(Glyma.18g028300)定位于染色体Gm18(G)；GmCPD4(Glyma.11g228900)定位于染色体Gm11(B1)。同时，对各GmCPD位点附近的SSR标记进行了搜索与分析。GmCPD1附近的Sat_177和Sat_264与花朵数目相关；Satt126与倒伏相关；Sat_287与种皮颜色相关。在GmCPD2位点周围，Satt189,Satt350和Satt546与大豆第一朵花相关；Satt189和Satt350与叶柄形状和叶面积相关；Satt546与节间长度相关；Sat_139,Satt546和Satt172与种子的多种品质性状有关。在25 吉林大学博士学位论文GmCPD3附近，Satt309和Satt356与豆荚成熟相关；Satt356还与节间长度有关；Satt570与种子蛋白含量和侧根数相关。GmCPD4位点附近，Satt415与节间长度有关；Satt583与生育期长度有关；Sat_123与果荚的成熟与植株倒伏相关；Sat_123,Satt583和Sat_095都与种子重量有关。由以上结果可以看出，4个GmCPD同源基因与控制大豆生长发育各主要方面的QTL都有很强的相关性。图2.8GmCPD基因在大豆染色体上的定位基因间的物理距离参照Soybase和Phytozome数据库中的信息。同时标出了GmCPDs基因位点附近的SSR标记。Fig.2.8ThegenomiclocationoffourGmCPDsonsoybeanphysicalmap.DistancealongtheverticalbarsindicatesthephysicaldistancereportedintheSoybaseandPhytozomedatabase.TheSSRmarkersneartoGmCPDslocationwerealsolabeledonthecorrespondingpositionsofchromosome.2.4讨论在大豆品种William82中克隆得到了GmBRI1和4个GmCPD同源基因基因，由于William82是大豆基因组测序品种，因此我们克隆得到的测序结果与预26 第2章GmBRI1基因和4个GmCPD同源基因的克隆及生物信息学分析测序列相一致的GmBRI1和GmCPDs基因是有一定可靠性的。GmBRI1的生物信息学分析揭示了GmBRI1与已被报道的其他物种BRIs在序列和结构上的同源性以及进化关系。从这些已知的BRIs蛋白的结构和功能出发，可以预测GmBRI1的功能，为后续GmBRI1基因的功能鉴定提供指导。对GmBRI1蛋白的结构域预测发现其具备了富含亮氨酸重复单位的激酶蛋白受体所具备的所有特征结构和功能域，证明GmBRI1蛋白是LRR-KLR家族的受体蛋白。在序列和结构的同源比对结果中可以看出，各BRIs蛋白的序列和结构域的同源性很高，进化关系较近，这种结构和进化上的保守性是作为BR受体发挥BR分子结合和下游分子活化功能所必须的，预示着BRIs蛋白功能的保守性。拟南芥AtBRI1蛋白的功能已有很多报道，因此我们着重比较了GmBRI1蛋白与AtBRI1蛋白的序列，结构域和蛋白三级结构的同源性，结果表明，二者不但序列的同源性很高，结构域的同源性更高，主要结构域的同源性在80%以上，预测的蛋白三级结构又极端相似，因此我们推测，GmBRI1蛋白具有与AtBRI1蛋白相似的功能。我们在大豆品种William82中克隆得到了4个GmCPD同源基因。生物信息学分析揭示了4个GmCPD与已被报道的其他物种的CPD在序列和结构上的同源性以及进化关系，发现各CPD之间亲缘关系较近，序列保守性强，预示其功能的相似性。对GmCPD蛋白的结构域预测发现4个GmCPD蛋白都具备细胞色素P450的特征结构域，证明GmCPD蛋白属于细胞色素P450家族。对4个GmCPD蛋白在序列和结构上进行了同源比对，结果发现，4个GmCPD蛋白序列相似性很高，尤其是结构域的序列非常保守。其中GmCPD1和GmCPD2亲缘关系较近，序列较相似，而GmCPD3和GmCPD4亲缘关系较近，序列相似性较高。推测两个关系较近的同源基因之间功能更相近，4个同源基因在发挥共同作用的同时可能还分别扮演不同的角色。在与拟南芥AtBRI1蛋白的同源比对中发现，4个GmCPD蛋白都与AtCPD具有很高的序列一致性，且DomainA氧结合区的序列100%一致，其他结构域也仅有几个氨基酸的差异。因此我们推测，GmCPD蛋白具有与AtBRI1蛋白相似的功能。2.5小结通过PCR方法在大豆品种William82中克隆得到了GmBRI1基因和4个27 吉林大学博士学位论文GmCPD同源基因。GmBRI1基因的ORF区（openreadingframe）序列长度为3555-bp，编码1184个氨基酸。氨基酸序列同源比对显示，GmBRI1与其他物种的BRIs之间有较高的序列同源性。结构域分析发现，GmBRI1蛋白具有N端信号肽、LRR、激酶催化域、C端尾巴等BR受体蛋白必不可少的功能域，且这些结构域在序列和结构上与其他物种的BRIs高度保守。GmBRI1与AtBRI1蛋白的三级结构预测表明，二者在三级结构上十分相似，预示了二者功能相似的可能性。4个GmCPD同源基因的ORF区（openreadingframe）序列长度分别为1437bp、1440bp、1425bp和1419bp，编码氨基酸个数分别为479、480、475、473。氨基酸序列。同源比对显示，4个GmCPD都与其他物种CPD具有较高的序列同源性。结构域分析发现，4个GmCPD蛋白都具有脯氨酸富集区域、氧结合区、类固醇结合区和血红素结合区等细胞色素P450亚家族必不可少的功能域，且这些结构域在序列和结构上与AtCPD高度保守。4个GmCPD与AtCPD在序列和结构上的相似性预示了其功能相似的可能性。28 第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析3.1材料3.1.1植物材料大豆品种William823.1.2试剂1nM2,4-epibrassinolide购自TCR;TRNzol总RNA提取试剂购自天根生化科技有限公司；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自全式金生物技术有限公司；KAPASYBRPremixExTaq购自KAPAbiosystem；Hoagland水培营养液（配方见附录）。3.1.3引物引物名称用途5'到3'序列qGmBRI1-SqRT-PCRTCTCCGTCTGTTCTGCATCTTCTTqGmBRI1-AqRT-PCRGAGGTCTATGGAAGTGAGGTGCTGGmG6PDH-SqRT-PCRGTCTGTTATCCGCCTACAGCCTGmG6PDH-AqRT-PCRACTCCTTGATACCGTTGTCCATGmELF1B-SqRT-PCRGTTGAAAAGCCAGGGGACAGmELF1B-AqRT-PCRTCTTACCCCTTGAGCGTGGqCPD1-SqRT-PCR,GCATCTTTCATCATCATACCACTCCqCPD1-AqRT-PCRCAACAAAGGGGAGTCCGAGCqCPD2-SqRT-PCRATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGqCPD2-AqRT-PCRCGAAGGGGAGCCCGAGTGTACqCPD3-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCqCPD3-AqRT-PCRCGGCGGAGGAAGAGGAGGAGqCPD4-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTqCPD4-AqRT-PCR,GAACACGCGGCGGAGGTATAAG29 吉林大学博士学位论文3.1.4主要仪器设备PCR扩增仪；-80℃超低温冰箱；高速台式离心机；冷冻离心机；ABI7900；光照培养箱3.2方法3.2.1材料种植与取样1）大豆品种William82在温室中盆栽，在下列条件下培养：12h光照，温度26°C，湿度60%，光强250μmol²m−2²s−1light；2）萌发后7天，取大豆幼苗的根、下胚轴和子叶；3）出苗后20天，取大豆的叶片和茎尖；4）大豆花朵的取样是在开花期，当果荚长到0.5-2cm长时进行取样。5）进行BR处理实验的大豆植株，出苗10后转入Hoagland水培营养液中进行培养，环境条件同1）所述；6）培养3天后，分成两组，一组进行外源24-epiBL的喷施，另一组在相同培养条件下隔离培养，处理后每隔0.5h取样一次。3.2.2Trizol法提取植物总RNA实验方法同2.2.23.2.3cDNA的合成实验方法同2.2.33.2.4荧光实时定量PCR按照KAPASYBRFASTqPCRKitMasterMix(2X)Universal说明书进行操作。1）按照下表配制PCR反应体系，加入PCR管中；components20μlKAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2X)Universal10μlForwardPrimer(10μM)0.4μl30 第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析ReversePrimer(10μM)0.4μROXHigh/low（Asrequired）0.4μlcDNA1μlPCR-gradewater7.8μl2）短暂离心将各成分混合均匀；3）在ABIPRISM7500SequenceDetectionSystem上进行PCR反应，PCR反应条件如下；StepTemperatureDurationCyclesEnzymeactivation95℃2minholdDenature95℃50secAnnel60℃30sec40cyclesExtend72℃30secDissociation95℃15sec60℃15sec4）数据分析使用KEYPLOT软件。3.3结果3.3.1GmBRI1基因和4个GmCPD基因在大豆不同组织中的表达选取了七个不同的大豆组织：根、下胚轴、子叶、叶片、茎尖、花、幼嫩果荚。用荧光实时定量PCR方法检测了大豆不同组织中GmBRI1基因和4个GmCPD基因的表达情况。GmBRI1基因在大豆中的表达模式如图3.1所示，GmBRI1基因在大豆的根、下胚轴、子叶、叶片、茎尖、花、幼嫩果荚中都有表达，其中，下胚轴和子叶中的表达量最高；其他组织中GmBRI1基因虽都有表达，但水平较低；幼嫩果荚中GmBRI1基因表达量最低。31 吉林大学博士学位论文图3.1GmBRI1基因在大豆不同组织中的表达结果内参基因为GmELF(GenBank检索号：NM_001249608)；数据为三次重复实验的mean±SDFig.3.1qRT-PCRanalysisofGmBRI1mRNAindifferenttissuesofsoybeanTherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmELF(GenBankaccessionNo.NM_001249608);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments4个GmCPD基因在大豆组织中的表达各有特色（图3.2）：GmCPD1基因的表达主要集中在叶片和子叶中，叶片的表达量最高，其次是子叶，茎尖的表达量最低；GmCPD2基因也在叶片和子叶中集中表达，但子叶的表达量最高，其次是叶片，茎尖和花的表达量最低；GmCPD3基因在各组织的表达水平都不高，主要在幼嫩果荚中表达，下胚轴和茎尖的表达量最低；GmCPD4基因的总体表达水平是4个基因中最高的，也主要集中在子叶和叶片中表达，子叶中最高，在幼嫩果荚中的表达量仅次于叶片，根中表达量最低。32 第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析图3.2GmCPD基因在大豆不同组织中的表达结果内参基因为GmELF(GenBank检索号：NM_001249608)；数据为三次重复实验的mean±SDFig.3.2qRT-PCRanalysisofGmCPDmRNAindifferenttissuesofsoybeanTherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmELF(GenBankaccessionNo.NM_001249608);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments总体来看，4个GmCPD基因在大豆各组织中普遍表达；除GmCPD3外的3个GmCPD基因在叶片和子叶中都有明显的高表达；4个基因在幼嫩果荚中的表达量也较高，GmCPD3和GmCPD4基因尤其显著；根和下胚轴中4个GmCPD基因表达都在较低水平；除GmCPD4外的3个GmCPD基因在茎尖的表达量都最低；GmCPD1和GmCPD2基因在花朵中的表达量也较低。3.3.2外源BR处理下大豆中GmBRI1基因和和4个GmCPD基因的表达为了验证油菜素内酯途径相关基因在大豆中对BR信号的响应情况，我们对大豆品种William82外源施加BR激素。对于BR处理组和未处理对照组每半小时取一次叶片样品，分别记为0h（处理前），0.5h（BR处理后0.5小时），1h（BR处理后1小时），1.5h（BR处理后1.5小时），2h（BR处理后2小时）。样品进行总RNA的提取并反转录为cDNA，以此cDNA为模板通过荧光实时定33 吉林大学博士学位论文量PCR方法对GmBRI1基因和和4个GmCPD基因的表达情况进行检测。GmBRI1基因的检测结果（图3.3）显示，在BR处理的起始阶段，GmBRI1基因的表达水平迅速上升，0.5小时时出现峰值，然后缓慢下降。从总体趋势来看，与未处理的对照组相比，GmBRI1基因经BR处理后表达上调。图3.3GmBRI1基因响应外源BR信号的表达结果CK：未处理组（黑色柱子）；BL：处理组（白色柱子）；x轴表示处理时间：0h（处理前），0.5h（处理后0.5小时），1h（处理后1小时），2h（处理后2小时）；内参基因为GmG6PDH(GenBank检索号：XM_003547631)；数据为三次重复实验的mean±SDFig.3.3TheinducibleexpressionofGmBRI1inthesoybeanleavesunderBRtreatment.CK,untreatedgroup(blackcolumn);BR,treatedgroup(whitecolumn).Thex-axisrepresentsthetimeofthetreatment:0h(beforetreatment),0.5h(treatedfor0.5h),1h(treatedfor1h)and2h(treatedfor2h).TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.经外源BR处理后，4个GmCPD基因的表达量都趋于下调；GmCPD3和GmCPD4基因自处理开始表达量就急剧下降，1h时达到低谷，1.5h后有缓慢回升，但趋于平稳；GmCPD1和GmCPD2基因的表达情况虽总体趋于下调，但在34 第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析处理开始的0.5h内是表达上调的，0.5h后急剧下降，也在1h时达到低谷，1.5h后缓慢回升，趋于平稳；总体表达水平方面，GmCPD4基因最高，GmCPD1和GmCPD2基因中等，GmCPD3基因最低（图3.4）。图3.4四个GmCPD基因响应外源BR信号的表达结果0h：处理前；0.5h：处理后0.5小时；1h：处理后1小时；2h：处理后2小时；内参基因为GmG6PDH(GenBank检索号：XM_003547631)；数据为三次重复实验的mean±SDFig.3.4TheinducibleexpressionoffourGmCPDgenesinthesoybeanleavesunderBRtreatment.0h:beforetreatment;0.5h:treatedfor0.5h;1h:treatedfor1h;1.5h:treatedfor1.5h;2h:treatedfor2h;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.3.4讨论BR激素对于植物生长发育的影响主要是促进细胞伸长、分裂和维管组织的分化。下胚轴和子叶是植物生长初期细胞活动最活跃的部位，进行着强烈的细胞分裂和维管束发育活动，编码BR受体蛋白的GmBRI1基因在此部位高表达也是35 吉林大学博士学位论文符合预期的。大豆的BR处理实验中，处理开始的0.5小时内，GmBRI1基因表达水平迅速提高，表明GmBRI1基因对外源BR的响应很敏感。当胞外的BR分子数量增加时，需要更多的BR受体蛋白进行接受，因此GmBRI1基因迅速做出响应，表达量激增。当GmBRI1蛋白已满足需求（处理0.5小时后），GmBRI1基因的表达量降低。直到BR处理2小时GmBRI1基因的表达水平仍略高于处理前，可能原因是施加BR后对GmBRI1蛋白的高需求需要GmBRI1基因的高表达进行维持。GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4虽为同源基因，但表达模式各有特点。GmCPD4基因表达最活跃，而GmCPD3基因表达量偏低。GmCPD1、GmCPD2和GmCPD4基因主要在子叶和叶片中表达，这与拟南芥研究中报道的AtCPD的表达模式相同[112]，但与活性BR的分布模式不符[115,116]。活性BR主要集中在生殖器官中[115,117-119]，在叶片中的含量非常低[115,120,121]。这是由于BR不能长距离运输，只能集中于生殖器官这种BR发挥功能的部位[121,116]。很多BR合成基因也被报道在BR含量高的部为有高表达[122,117,120,119]，然而CPD基因的表达却并不符合这种模式。CPD基因所编码的CYP90A/CPD催化BR合成的早期步骤，因此推测CYP90A/CPD的催化产物必然要经过长距离运输到达BR作用部位。但这种运输即费时又消耗能量，植物体为什么一定需要CPD基因在叶片中表达呢？目前的研究资料显示，CPD的表达具有光依赖性的，且通过光敏色素途径达成[114]。叶片和子叶正是光敏色素最丰富的部位。另外，BR被报道在光合作用中光合器的组装和功能发挥中起主导作用，且cpd突变体中氧气生成出现异常，表明CPD可能在光合作用中承担一定角色[123]。这些推测都需要进一步研究的验证。而GmCPD3基因主要在幼嫩果荚中表达，GmCPD4基因在幼嫩果荚中的表达量也很高，在cpd-91突变体中也出现育性和结实量下降的现象，猜测GmCPD3基因可能参与幼胚或种子的发育，且GmCPD3和GmCPD4基因发挥主要作用。大豆经外源BR处理后，4个GmCPD基因的表达都迅速且显著地下调。表现出明显的反馈抑制调节效应：当环境中有足够的BR分子时，一部分BR合成基因的表达被关闭。GmCPD基因对BR处理快速而强烈的响应也说明了其在BR合成途径中扮演主要角色。而4个基因的响应模式也不尽相同，GmCPD3和36 第3章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在大豆中的表达模式分析GmCPD4基因是直接下调表达，而GmCPD1和GmCPD2基因的表达量是在波动中下降，在最初处理的0.5小时内先上调表达然后才开始下降。说明4个GmCPD基因在BR途径中发挥作用时是既有合作又有分工。3.5小结大豆不同组织中基因的表达实验表明，GmBRI1基因在下胚轴和子叶这两个细胞分裂和维管束发育活跃的部位表达量较高。这与BR激素促进植物细胞伸长、分裂和维管组织分化的生理作用相对应，侧面反映了GmBRI1基因在BR信号途径中可能发挥重要作用。GmCPD1、GmCPD2和GmCPD4基因在子叶和叶片中表达量最高与拟南芥中的报道相符，GmCPD3基因的表达主要在幼嫩果荚中，GmCPD4基因在此部位的表达量也很高，猜测二者可能与幼胚或种子的发育有关。外源BR处理大豆后的基因表达的情况显示，GmBRI1基因对外施的BR信号能够迅速回应，在最初的0.5小时内表达量激增而后下降，2小时内仍维持在上调水平。GmBRI1基因表达对BR处理的这种响应情况正符合GmBRI1蛋白在BR信号转导途径中所扮演的受体角色。4个GmCPD基因的总体表达趋势都为在开始处理的1小时内表达水平迅速下降，然后在1.5到2小时间达到稳定。这种BR激素对GmCPD基因表达强烈的反馈抑制调节正说明GmCPD基因在BR基因合成中发挥重要作用。4个GmCPD基因的表达模式除有共性外还各具特点，说明其在发挥主要功能的同时又各有侧重。37 吉林大学博士学位论文第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析4.1材料4.1.1植物材料拟南芥油菜素内酯不敏感突变体bri1-5（WS2背景），拟南芥野生型WS2；拟南芥油菜素内酯合成缺失突变体cpd-91（Col-0背景），拟南芥野生型Col-04.1.2菌株根癌农杆菌GV31014.1.3酶及试剂质粒小量提取试剂盒、TRNzol总RNA提取试剂和胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司，酶XbalI、KpnI、SacI和LongAmpTaq酶购自NEB公司；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自全式金生物技术有限公司；T4连接酶购自TaKaRa公司；MES、spe、kan、chl和rif均购自sigma公司；2,4-epibrassinolide购自TCR；DNA分子量标准购自康润生物；引物合成和基因序列测定由华大基因完成。4.1.4引物及序列引物名称用途5'到3'序列GmBRI1-S基因克隆CTTAACCTTTCACCTTCCATATCTGGmBRI1-A基因克隆TGTCTGTTTCCCAAAGAATCCACGmBRI1-X添加酶切位点GCTCTAGACTTAACCTTTCACCTTCCATATCTGGmBRI1-K添加酶切位点CGGGGTACCTGTCTGTTTCCCAAAGAATCCACATGmBRI1-35S转基因植株DNA检测ATACGTAAGGGATGACGCACAATCGmBRI1-NOS转基因植株DNA检测GGTTAATGTGGAGGCGCACTTGGAtACTIN2-SRT-PCRACTCTCCCGCTATGTATGTCGCAtACTIN2-ART-PCRAGAAACCCTCGTAGATTGGCAC38 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析CDP1-X添加酶切位点GCTCTAGAATGGCATCTTTCATCATCATACCACCDP1-S添加酶切位点CGAGCTCTCATGGCGATTTACTTAGTCTGGACCDP2-X添加酶切位点GCTCTAGAATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGCDP2-S添加酶切位点CGAGCTCTCATGGCGATTTACTTAGTTTGGACCDP3-X添加酶切位点GCTCTAGAATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCCAACDP3-S添加酶切位点CGAGCTCCTAGTCTCTACGCTGCACAATAATTCDP4-X添加酶切位点GCTCTAGAATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTCDP4-S添加酶切位点CGAGCTCCTAATGTCTACGCTGCACAATAATAqCPD1-SRT-PCRGCATCTTTCATCATCATACCACTCCqCPD1-ART-PCRCAACAAAGGGGAGTCCGAGCqCPD2-SRT-PCRATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGqCPD2-ART-PCRCGAAGGGGAGCCCGAGTGTACqCPD3-SRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCqCPD3-ART-PCRCGGCGGAGGAAGAGGAGGAGqCPD4-SRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTqCPD4-ART-PCRGAACACGCGGCGGAGGTATAAG4.1.5主要仪器设备EpsonperfectionV700photo扫描仪；WinRHIZOProv.2009c软件；NikonSMZ1500体视解剖镜；NIS-ElementsFImaging软件；PCR扩增仪；电泳仪；冷冻离心机；高速台式离心机；恒温摇床；紫外凝胶成像仪；电热恒温培养箱；-80℃超低温冰箱；超净工作台；紫外分光光度计；电热恒温水浴锅；连接仪；电转仪；pH计；灭菌锅。4.2方法4.2.1质粒的提取（参照天根公司的质粒小提试剂盒说明书）1)离心管中加入2ml菌液，12,000rpm，离心1min，弃去上清；2)将250μl溶液P1加入离心管中，涡旋振荡器使菌体重悬；39 吉林大学博士学位论文3)再250μl溶液P2，上下轻柔翻转，使菌体充分裂解；4)最后加入350μl溶液P3，立即温和翻转混匀，此时出现白色絮状沉淀，然后12000rpm，离心10min；5)将上清液移入吸附柱CP3中，12000rpm，离心1min，弃废液；6)加入600μl洗液PW于吸附柱CP3中，12000rpm，离心1min，弃废液，再重复此步骤一次。7)吸附柱CP312,000rpm空转2min；8)吸附柱CP3放入干净的离心管中，室温放置10分钟左右，晾干；9)向吸附柱CP3的吸附膜中间部位悬空滴加55℃预热的无菌水50μl，室温放置1min帮助溶解，12000rpm，离心1min，收集到离心管中的溶液即为质粒DNA溶液；10)质粒DNA溶液-20℃保存。4.2.2XbalI和KpnI/SacI双酶切（参照NEB公司试剂说明书）1）配置酶切体系，如下：试剂成分20l反应体系10×NEBBuffer2/Buffer42l100×BSA0.2lXbalI0.5lKpnI/SacI0.5l加酶切位点的PCR产物4l/pTF101.1-GFP质粒ddH2O12.8l2）37℃条件下反应3小时；3）酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。4.2.3酶切产物回收实验方法同2.2.540 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析4.2.4用T4连接酶连接目的基因与载体1)按下表配制连接反应体系：试剂成分20l反应体系10×T4Buffer2lDNA片段6l载体片段4lT4DNALigase1lddH2O7l2)将反应物混和均匀离心后，16℃过夜反应。4.2.5GV3101根癌农杆菌感受态细胞的制备1）挑取长势良好的GV3101单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。2）用LB液体培养基按照1:100比例进行稀释，继续培养菌种密度OD600至0.6到0.8之间。3）菌液冰上放置30min，然后4℃5000rpm离心5min。4）弃去上清，用少量冰浴处理的冷无菌水重复悬浮菌体并补充至50ml，然后4℃5000rpm离心10min；5）弃去上清，用少量冰浴处理的冷无菌水重复悬浮菌体并补充至25ml，然后4℃5000rpm离心10min；6）弃去上清，用少量冰浴处理的冷无菌水重复悬浮菌体并补充至5ml，然后4℃5000rpm离心10min；7）弃去上清，用2ml10%的无菌甘油悬浮菌体后，每管100l分装于1.5ml的无菌离心管中，放入液氮中速冻，后置于-80℃保存。4.2.6电击法转化GV3101感受态细胞1）电极杯放置于超净台中、吸水纸平铺其下，紫外灭菌20min；2）在超净台中将电极杯用吸水纸包裹，密封，-20℃放置20min；3)从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞于冰上解冻。4）在超净工作台中，取1l纯化后的质粒加入100l解冻后的感受态细胞41 吉林大学博士学位论文中，缓慢混匀，然后将混合物缓缓注入预冷电极杯的底部，重新将电极杯用吸水纸包裹，密封。5）启动BIO-RADGenePulserXcell电穿孔系统，将电极杯从吸水纸中取出，放入电极槽中；7）主界面选择Pre-setprotocols，然后选择Bacterial，然后选择Agrobacteriumtumefaciens，页面显示电击程序，然后按下pulse键，听见蜂鸣声后，取出电极杯；8）迅速向电击杯中加入1mlLB液体培养基，重新悬浮细胞后，将菌液转移至1.5ml离心管中。9）28℃，180rpm振荡培养3h。10）在超净工作台中，取20l转化产物，涂布在含50mg/LKan、50mg/LSpe、25mg/LChl和20mg/LRif的YEP固体培养基上，28℃倒置培养过夜。11）挑取单菌落加入1mlYEP液体培养基中，28℃振荡培养3h后，取1μl菌液为模板进行菌落PCR，鉴定为阳性的菌液，取700μl加入300μl50%无菌甘油进行保菌，-80℃下保存。4.2.7蘸花法转化拟南芥1）取野生型的拟南芥种子放置于1.5ml离心管中，用无菌水浸泡，于4℃条件下春化4-6天；2）将营养土、草炭土、蛭石按照1：1：1混合，分装于花盆中，并用水浇透，将春化后的的拟南芥种子点播在花盆土表层，置于培养箱中培养，培养条件为：16小时光照，温度22°C，湿度50%，光强250μmol•m−2•s−1，前4-6天需罩上保鲜膜；3）大约培养4周左右，拟南芥开始开花，剪去已开的初生花序，留下未开放的次生花序，等待侵染；4）挑取含有重组载体的农杆菌单克隆，置于含50mg/LKan、50mg/LSpe和25mg/LChl20mg/L的5mlYEP液体培养基中，28℃250rpm振荡培养至OD600值为0.6-0.8；5）取上一步的5ml菌液倒入500mlYEP液体中（内含50mg/LKan、50mg/LSpe和25mg/LChl20mg/L），28℃250rpm振荡培养至OD600值为0.8-1.0；42 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析6）收集菌液置于离心管中，5000rpm离心5min并收集菌体，用MS液体培养基悬浮收集的菌体，使悬浮后菌液的OD600值约为0.6，最后加入SilwetL-77；7）将拟南芥的花朵浸入农杆菌菌液中1min，取出后用保鲜膜罩住保持湿度，暗培养24h后再正常培养，一周内再重复侵染一次；10）果荚成熟后，按单株收获种子保留，得到T0代种子。4.2.8Trizol法提取植物总RNA实验方法同2.2.24.2.9cDNA的合成实验方法同2.2.34.2.10PCR反应验证基因表达1）PCR反应体系如下：试剂成分20l反应体系10×ExTaqBuffer2μlExTaq0.1μlPrimer1(10μM)1μlPrimer2(10μM)1μldNTP(2.5mM)1.6μlcDNA4μlddH2O10.3μl2）设定PCR程序为：StepTemperatureDurationCyclesEnzymeactivation95℃5minholdDenature95℃30secAnnel55℃30sec33cyclesExtend72℃50secExtend72℃10minhold3）PCR的扩增产物回收纯化后进行琼脂糖凝胶电泳。43 吉林大学博士学位论文4.2.11拟南芥的处理及培养1）拟南芥种植于花盆中（营养土、草炭土、蛭石按照1：1：1混合）置于培养箱中培养，培养条件为：16小时光照，温度22°C，湿度50%，光强250μmol•m−2•s−1。2）拟南芥种子经10%次氯酸钠溶液消毒，再用无菌水冲洗3-5次，播种于含有20%蔗糖的1/2MS培养基中，于16h光照,，温度24°C，湿度60%，光强250μmol·m−2·s−1的条件下竖培养。4.2.12数据的测量与分析1）植株的株高，果荚长度都用卷尺测量（最小刻度mm）；2）叶片表型鉴定实验中，叶片在叶柄基本切下，平铺在培养基表面；根表型的鉴定实验中，幼苗的根在培养及表面铺开，互不遮挡。3）所有幼苗在EpsonperfectionV700photo扫描仪下进行扫描，用WinRHIZOProv.2009c软件进行测量。叶片表型鉴定实验测量了萌发13天的幼苗叶片的叶柄长度、叶面积、叶宽度、叶长度；根表型的鉴定实验中，测量了萌发10天的幼苗的总根长；所有数据都来自三次独立重复实验，每组测量了30-50株幼苗，并进行了差异显著性分析。4.3结果4.3.1转基因拟南芥的获得与鉴定4.3.1.1重组载体的构建中间载体pTF101.1-GFP按照如下方法制备：将GFP表达盒（图4.1）插入载体pTF101.1（本实验室保存）的HindIII和EcoRI酶切位点间得到载体pTF101.1-GFP。44 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析NotI(1621)BamHI(1632)XmaI(1637)AscI(896)SmaI(1639)NdeI(886)KpnI(1645)PstI(18)SpeI(879)NdeI(1132)SacI(1651)HindIII(2)35SXbaI(867)GFPNOSEcoRI(1918)图4.1GFP表达盒及其酶切位点Fig.4.1GFPgeneexpressioncassetteandrestrictionenzymecuttingsite以已构建的GmBRI1与pMD18-T连接后的载体pMD18-T-GmBRI1为模板，用含有XbalI和KpnI酶切位点的引物GmBRI1-X和GmBRI1-K进行扩增。得到3649bp的PCR产物（图4.2）。将3649bp的PCR产物用XbalI和KpnI双酶切，回收3642bp的酶切产物，将该酶切产物与经过同样双酶切的pTF101.1-GFP的10271bp的片段连接（图4.3），将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50mg/L壮观霉素的LB培养基上筛选出阳性克隆。以阳性克隆的菌液作为模板，以GmBRI1-S和GmBRI1-A为引物进行菌落PCR鉴定，得到3649bp的PCR产物的为阳性质粒（图4.4），该阳性质粒为得到的重组载体，命名为pTF101.1-GmBRI1。应用同样的方法构建重组载体pTF101.1-GmCPD1、pTF101.1-GmCPD2、pTF101.1-GmCPD3和pTF101.1-GmCPD4。酶切位点选用XbalI和SacI。45 吉林大学博士学位论文图4.2GmBRI1加酶切位点电泳图谱M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1,2,3：GmBRI1加酶切位点的PCR产物Fig.4.2PCRproductsofGmBRI1addingrestrictionenzymecuttingsiteM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1,2,3:PCRproductsofGmBRI1addingrestrictionenzymecuttingsite图4.3GmBRI1与pTF101.1-GFP双酶切电泳图谱46 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析M：1kbPlusDNAladder；1：GmBRI1基因双酶切；2：pTF101.1-GFP载体双酶切Fig.4.3RestrictionenzymedigestionresultsofGmBRI1andpTF101.1-GFPM：1kbPlusDNAladder;1:restrictionenzymedigestionresultofGmBRI1;2:restrictionenzymedigestionresultsofpTF101.1-GFP图4.4pTF101.1-GmBRI1菌落PCR结果M：1kbPlusDNAladder1-6：pTF101.1-GmBRI1菌落鉴定结果-：阴性对照（模板为水）+：阳性对照（模板为pTF101.1-GmBRI1质粒）Fig.4.4ColonyPCRproductsofpTF101.1-GmBRI1M:1kbPlusDNAladder;1-6:PCRproductsofpTF101.1-GmBRI1;-:negativecontrol;+:positivecontrol4.3.1.2转基因拟南芥的获得与筛选将重组载体pTF101.1-GmBRI1转化根癌农杆菌Gv3101感受态细胞，28℃条件下于LB培养基（含壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L，氯霉素25mg/L，利福平20mg/L）上培养两天。挑选阳性克隆，以GmBRI1-S和GmBRI1-A为引物做菌液PCR鉴定，结果扩增出大小约为3649bp的目标条带的为阳性重组菌，命名为GV3101/pTF101.1-GmBRI1。47 吉林大学博士学位论文采用沾花浸染法用GV3101/pTF101.1-GmBRI1菌液转化拟南芥油菜素内酯不敏感突变体bri1-5收获T1代转GmBRI1的bri1-5（bri1-535S::GmBRI1）拟南芥的种子。T1代种子播种于培养土中，待幼苗长出2片真叶后开始喷施10mg/L的Basta进行筛选，一周后再重复喷施一次。此后仍能成活的T1代幼苗既为筛选得到的T1代bri1-535S::GmBRI1转基因植株（图4.5）。继续培养植株到结实，单株收获种子（T2代）。然后经相同的筛选过程得到纯合的T3代bri1-535S::GmBRI1拟南芥种子。最后将T3代bri1-535S::GmBRI1拟南芥种子播种到培养土中，长出T3代bri1-535S::GmBRI1拟南芥植株。图4.5T1代转基因拟南芥筛选图Fig.4.1ScreeningofT1bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis用上述同样的方法将GV3101/pTF101.1-GmCPD1、GV3101/pTF101.1-GmCPD2、GV3101/pTF101.1-GmCPD3和GV3101/pTF101.1-GmCPD4菌液分别转化拟南芥油菜素内酯合成缺陷突变体cpd-91，最终获得了T3代转基因植株：cpd-9135S::GmCPD1、cpd-9135S::GmCPD2、cpd-9135S::GmCPD3和cpd-9135S::GmCPD4。4.3.1.3T3代转基因拟南芥的分子鉴定以T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥植株的DNA为模板，以GmBRI1-35S和GmBRI1-NOS为引物，进行PCR反应，以野生型拟南芥WS2和突变体拟南芥bri1-5为对照。上述PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果（图4.6）表明，在T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥植株中有大小约为48 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析500bp的目的基因条带，而野生型WS2和突变体bri1-5中均未出现条带。证明T3代拟南芥植株的基因组中成功插入了外源基因35S::GmBRI1。图4.6T3代转基因拟南芥的DNA鉴定结果M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1：野生型拟南芥WS2；2：拟南芥突变体bri1-5；3-5：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥植株；6：阴性对照（模板为水）Fig.4.6DNAidentificationofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsisM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1:Wide-typeArabidopsisWS2;2:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;3-5:T3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;6:Negativecontrol提取T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系Line1、Line6和Line9，以及野生型拟南芥WS2和突变体bri1-5的总RNA，经反转录后得到cDNA，以此cDNA为模板，以qGmBRI1-S和qGmBRI1-A为引物，以拟南芥的AtACTIN2基因为内标基因，引物为AtACTIN2-S和AtACTIN2-S，检测GmBRI1在拟南芥中的表达。检测结果（图4.7）表明，GmBRI1在野生型拟南芥和bri1-5中不表达，而在T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥中强表达。且T3代转基因拟南芥的三个株系表达量存在差异。49 吉林大学博士学位论文图4.7T3代转基因拟南芥植株中目的基因表达的RT-PCR结果WT：WS2野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系Fig.4.7RT-PCRdetectionresultsofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsisWT:Wide-typeArabidopsisWS2;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis提取T3代转基因植株以及野生型（Col-0）和突变体（cpd-91）的总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，以qGmCPD1-S和qGmCPD1-A、qGmCPD2-S和qGmCPD2-A、qGmCPD3-S和qGmCPD3-A、qGmCPD4-S和qGmCPD4-A为引物进行RT-PCR扩增，检测结果如图4.8：在野生型拟南芥col-0和突变体cpd-91中没有检测到条带。引物qGmCPD1-S和qGmCPD1-A仅能在cpd-9135S::GmCPD1转基因植株中检测到目的条带；qGmCPD2-S和qGmCPD2-A仅能在cpd-9135S::GmCPD2转基因植株中检测到目的条带；qGmCPD3-S和qGmCPD3-A仅能在cpd-9135S::GmCPD3转基因植株中检测到目的条带；qGmCPD4-S和qGmCPD4-A仅能在cpd-9135S::GmCPD4转基因植株中检测到目的条带。通过以上检测结果可以确定T3代转基因植株中确实转入了GmCPD基因，且高效表达量；各转化组都转入了对应的GmCPD同源基因，未出现混杂。50 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析图4.8T3代转基因拟南芥植株中目的基因表达的RT-PCR结果Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；Fig.4.8RT-PCRdetectionresultsofT3cpd-9135S::GmCPDtransgenicArabidopsisCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis4.3.2GmBRI1基因的表达恢复了拟南芥突变体bri1-5的表型bri1-5是以WS2拟南芥品种为背景的油菜素内酯不敏感的矮化突变体。bri1-5植株表现为极端矮小，叶片短而圆，花序节间短的形态。相比而言，bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的表型与WS2野生型植株的形态更加接近（图4.9）。结合图4.7的GmBRI1基因在拟南芥植株中的表达结果，说明，GmBRI1在bri1-551 吉林大学博士学位论文突变体背景下的表达，引起了植株形态向野生型表型的恢复。为进一步确认bri1-535S::GmBRI1转基因植株，bri1-5突变体和WS2野生型植株之间的表型差异，我们对三者的叶片形态、根长、株高、果荚大小进行了深入比较。以下将分别详细讨论：图4.9GmBRI1的表达恢复了拟南芥突变体bri1-5的表型WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标尺表示40mm；Fig.4.9GmBRI1complementationofbri1-5inthephenotypeWS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Bar=40mm4.3.2.1叶片表型的比较与WS2的长形叶片不同，突变体的叶片圆而皱缩，叶柄较短，且叶片颜色深绿。转基因植株的叶片跟野生型叶片形态更相近：叶片呈长圆形，叶柄较长，叶片较薄，颜色也较浅。对叶柄长度，叶面积，叶片长宽比这三项指标进行了量化分析，并通过t检验对差异进行了显著性分析（图4.10）。在叶柄长度的分析中，突变体的叶柄长度最小，且与转基因植株和野生型的差别非常明显。转基因植株和野生型之间差别不大。t检验结果表明，转基因植株与突变体之间在叶柄长度方面存在极显著差异(p<0.01)。叶面积的测量结果表明，突变体的叶面积较52 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析其他二者都要小，转基因植株和野生型的叶面积相近。T检验结果表明，转基因植株与突变体之间在叶面积方面也存在极显著差异(p<0.01)。在长宽比的分析中，比值大于1表明叶片长大于款，形状为长圆形；而比值小于1表明叶片形状为扁圆形；比值越接近1表明叶片越圆。这三类植株的长宽比，只有突变体的比值小于1.且在0.8左右，表明突变体的叶片形状为接近圆形的扁圆形；而转基因植株和野生型的叶片长宽比都大于1，为长圆形叶片。在长宽比的t检验中，转基因植株与突变体的极其显著(p<0.01)。图4.10转基因拟南芥，突变体和野生型的叶片表型比较（a）叶片形态比较。WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标尺表示1mm；（b）叶片特征指标，叶柄长度、叶片面积、长宽比，的测量与统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.10Leafphenotypecomparisonamongthewide-type,bri1-5mutantandthreetransgeniclines(a)Leafphenotypesfrom13-day-oldplants.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Bar=1mm;(b)Statisticalanalysisofleafmeasurements:thepetiolelength,leafareaandlength-widthratioof53 吉林大学博士学位论文thefirsttrueleaves.Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test)4.3.2.2总根长的比较植株出苗10天后，对转基因植株，突变体和野生型的根长表型进行了比较，并进行了总根长的测量和数据的统计分析（图4.11）。突变体的根长较短，野生型和转基因植株的根长较长，且后二者之间差别不大。对测量得到的总根长数据进行统计分析，发现转基因植株的总根长数值明显大于突变体的，且t检验分析二者之间差异极其显著(p<0.01)。图4.11转基因拟南芥，突变体和野生型的根长比较（a）根形态比较。WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；（b）总根长的统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.11Rootphenotypecomparisonamongthewide-type,bri1-5mutantandthreetransgeniclines(a)Rootphenotypesfrom13-day-oldplants.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;(b)Statisticalanalysisofthetotalrootlenghth.Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.54 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test)4.3.2.3株高的比较在图4.9中就可以看出，转基因植株与突变体植株最明显的差异表型是株高。极端矮化的油菜素内酯不敏感突变体bri1-5中表达了大豆来源的GmBRI1基因后，株高增大，矮化表型被完全恢复。对株高的统计结果（图4.12）也印证了这一结论，突变体的株高数值明显的低于转基因植株和野生型的。转基因植株与突变体的株高差异极其显著(p<0.01)。图4.12转基因拟南芥，突变体和野生型的株高统计分析WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.12Plantheightstatistics.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test)55 吉林大学博士学位论文4.3.2.4果荚大小的比较对果荚大小的比较可以看出（图4.13），突变体的果荚短小瘦弱，转基因植株的果荚却更长更结实一些，与野生型的果荚形态相似。图4.13转基因拟南芥，突变体和野生型的果荚形态比较WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标尺表示10mmFig.4.13Siliquemorphologycomparisonamongthewide-type,bri1-5mutantandthreetransgeniclinesWS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Bar=40mm4.3.3GmBRI1基因的表达修复了拟南芥突变体bri1-5的BR信号通路为了进一步确认GmBRI1基因的表达对突变体bri1-5表型的恢复是由于GmBRI1基因发挥了油菜素内酯受体的功能从而修复了BR信号途径的通路，而不是由于环境等其他因素引起的表型变化。我们又做了三个验证BR信号途径的实验：光暗条件下下胚轴的伸长，外源BR处理对根长的影响和BR标签基因CPD、DWF的表达。详细结果如下：4.3.3.1光暗条件下胚轴的伸长报道显示，BR通过其信号途径，参与植物的光形态建成和暗形态发生[124]。将T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥、突变体bri1-5和野生型WS2植株种植在1/2MS培养基上，一部分在16小时光照条件下，一部分在黑暗条件下培养。56 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析6天后，分别观察表型并测量下胚轴长度。实验结果如图4.14所示。黑暗条件下，转基因和野生型拟南芥幼苗的下胚轴显著增长，子叶闭合并呈弯钩状，这是黑暗条件下萌发的典型形态；而突变体幼苗的下胚轴却非常短，子叶张开，表现出明显不同的表型。在光照条件下，突变体幼苗的下胚轴也比转基因和野生型幼苗的短。从下胚轴长度的统计数据（图4.14）中也可以看出，不论是在光下还是暗处，突变体下胚轴的长度都小于转基因植株和野生型。并且，转基因植株的下胚轴长度与突变体的存在极显著差异p<0.01。下胚轴的伸长是BR通过BR信号途径调控的一主要生理过程，GmBRI1基因表达对突变体bri1-5下胚轴伸长的恢复是GmBRI1基因修复BR信号通路的表现，证明了GmBRI1基因的功能性。图4.14光暗条件下下胚轴伸长实验结果（a）光暗条件下的下胚轴表型。WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标尺表示1mm（b）光暗条件下下胚轴长度的统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.14GmBRI1restoreshypocotylelongationofbri1-5(a)Morphologiesofthesix-day-oldseedlingsgrowninlightanddarkness.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Bar=1mm;(b)Averagehypocotyllengthofseedlingsgrownforsixdaysinlightanddarkness.Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test).57 吉林大学博士学位论文4.3.3.2外源施加BR对根长的影响BR信号能够调控根的生长发育[10]。因此我们设计了根生长抑制实验，验证GmBRI1基因是否修复了突变体bri1-5的BR信号途径。转基因植株、突变体和野生型的种子被播种于加入1%蔗糖的1/2MS培养中，我们设置了三个梯度：培养基中不添加2,4-epibrassinolide(24-epiBL)的对照培养基，添加了100nM24-epiBL的培养基和添加了500nM24-epiBL的培养基。10天后，对每个处理组的总根长进行测量并统计分析。之前的报道显示，根的生长发育需要适量的BR激素[125]，虽然多数情况下BR是促进生长的，但在根的发育中，低浓度的BR可以促进根伸长，但是当浓度高于0.04nM时，会抑制根的生长[126,125,127,128]。图4.15所示的实验结果也印证了之前的研究结论：不论是100nM还是500nM的24-epiBL处理，野生型WS2的根长与对照相比都明显缩短了；相反，突变体bri1-5的根长却随着24-epiBL浓度的增高而增长。在100nM24-epiBL处理条件下，突变体的根长比对照增长了约41%，在500nM24-epiBL处理下又增加了34%。转基因植株的根生长状态跟野生型是相一致的，高浓度的BR抑制了其根的生长，BR处理后的根长与突变体植株的存在极显著（p<0.01）差异。因此，此结果进一步证明了在bri1-5突变体背景下表达GmBRI1能够修复BR信号途径通路。58 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析图4.15根生长抑制实验结果（a）不同浓度BR处理条件下的根长表型。WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标尺表示10mm（b）不同浓度BR处理条件下的总根长数据的统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.15Rootinhibitionassaysshowingdifferentbrassinosteroid(BR)responsesinthewide-type,bri1-5mutantandtransgeniclines.(a)Phenotypesofthewide-type,bri1-5mutantandthreetransgeniclinesweregrown59 吉林大学博士学位论文inhalf-strengthMSmediumsupplementedwith1%sucrose(Mock),100and500nM2,4-epibrassinolide(24-epiBL)for10days.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;Bar=10mm;(b)Measurementsofthetotalrootlengthoftheseedlingsshownin(a).Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test).4.3.3.3BR标签基因的表达在BR信号通路完整的情况下，BR合成相关基因的表达会被反馈抑制[129,112]，因此可以通过BR合成基因的表达情况验证BR信号通路的完整性。两个主要的合成基因DWF4和CPD就成为了BR标签基因。对生长13天的突变体、野生型和转基因植株中两个基因的表达情况进行了检测。结果（图4.16）发现，突变体植株中DWF4和CPD基因的表达水平明显下调，并与野生型和转基因植株中的表达情况产生极显著(p<0.01)的差异。此结果表明，bri1-5突变体中的BR信号通路被破坏，而外源转入的GmBRI1基因确实修复了这一信号路径，证明了GmBRI1所具有的BR受体功能性。图4.16BR标签基因的表达结果内参基因为AtACTIN2；WS2：野生型拟南芥；bri1-5：油菜素内酯不敏感突变体；Line1，Line6，Line9：T3代bri1-535S::GmBRI1转基因拟南芥的三个株系；标60 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析尺表示1mm；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对bri1-5突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.16qRT-PCRanalysisoftheBR-relatedmarkergenes,DWF4andCPD,inthewide-type,bri1-5mutantandthreetransgeniclines.WS2:Wide-typeArabidopsis;bri1-5:ArabidopsisBRinsensitivemutantbri1-5;Line1，Line6，Line9:ThreetransgeniclinesofT3bri1-535S::GmBRI1transgenicArabidopsis;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoAtACTIN2(GenBankaccessionNo.AT3G18780).Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test).4.3.4GmCPD基因的表达恢复了拟南芥突变体cpd-91的表型cpd-91是以Col-0拟南芥品种为背景的油菜素内酯合成缺陷突变体。其表型为极端矮化，叶片皱缩暗绿，花期延长，育性降低。与突变体相比，4种cpd-9135S::GmCPD转基因拟南芥的表型都更加接近野生型（图4.17）。结合图4.8中4个GmCPD基因在拟南芥植株中的表达结果，我们发现，GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4基因分别在cpd-91突变体背景下表达，都能引起植株形态向野生型表型的恢复。为进一步确认4种cpd-9135S::GmCPD转基因植株，cpd-91突变体和Col-0野生型植株之间的表型差异，我们对三者的叶片形态、根长、株高、果荚大小进行了细致探讨。分别详述如下：图4.17四个GmCPD基因的表达恢复了拟南芥突变体cpd-91的表型61 吉林大学博士学位论文Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；标尺表示10mmFig.4.17FourGmCPDcomplementthephenotypeofcpd-91respectivelyCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm4.3.4.1叶片表型的比较与Col-0的长形叶片不同，cpd-91突变体的叶片圆而皱缩，叶柄较短，且叶片颜色深绿。4种cpd-9135S::GmCPD转基因植株的叶片跟野生型叶片形态更相近（图4.18）：叶片呈长圆形，叶柄较长，叶片较薄，颜色也较浅。图4.18转基因拟南芥，突变体和野生型的叶片表型A：Col-0野生型拟南芥；B：油菜素内酯合成缺陷突变体cpd-91；C：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；D：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；Eo：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；F：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基62 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析因拟南芥；标尺表示10mmFig.4.18Leafphenotypecomparisonamongthewide-type,cpd-91mutantandthetransgenicplantsA:Wide-typeArabidopsisCol-0;B:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutantcpd-91;C:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;D:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;E:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;F:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm对叶柄长度，叶面积，叶片长宽比这三项指标进行了量化分析，并通过t检验对差异进行了显著性分析。在叶柄长度的分析中（图4.19），突变体的叶柄长度最小，且与4组转基因植株和野生型的差别非常明显。各组转基因植株和野生型之间差别不大。t检验结果表明，4组转基因植株与突变体之间在叶柄长度方面都存在极显著差异(p<0.01)。图4.19转基因拟南芥，突变体和野生型叶柄长度的量化比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.19Statisticalanalysisofthepetiolelengthofthefirsttrueleaves.63 吉林大学博士学位论文Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)叶面积的测量结果表明（图4.20），突变体的叶面积最小，4组转基因植株都和野生型的叶面积相近。t检验结果表明，4组转基因植株与突变体之间在叶面积方面都存在极显著差异(p<0.01)。图4.20转基因拟南芥，突变体和野生型叶面积的量化比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.20Statisticalanalysisoftheleafareaofthefirsttrueleaves.Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T364 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)我们又对叶片的长宽比进行了分析（图4.21），比值大于1表明叶片长大于款，形状为长圆形；而比值小于1表明叶片形状为扁圆形；比值越接近1表明叶片越圆。这6种植株的长宽比，只有突变体的比值小于1且在0.8左右，表明突变体的叶片形状为接近圆形的扁圆形；而4种转基因植株和野生型的叶片长宽比都大于1，为长圆形叶片。在长宽比的t检验中，4组转基因植株与突变体的差异都极其显著(p<0.01)。图4.21转基因拟南芥，突变体和野生型的叶片长宽比Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.21Statisticalanalysisofthelength-widthratioofthefirsttrueleaves.Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T365 吉林大学博士学位论文cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)4.3.4.2根表型比较图4.22显示了植株出苗10天时4种转基因植株，突变体和野生型的根长表型。可以发现，野生型和4种转基因植株的根系都较发达，根长较长，侧根比较多；而突变体植株的根较短，侧根不发达。图4.22转基因拟南芥，突变体和野生型的根表型比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；标尺表示10mm；Fig.4.22Rootphenotypecomparisonamongthewide-type,cpd-91mutantandthetransgenicplantsCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm66 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析植株出苗5天时侧根较少，这时对主根的长度进行了测量并统计分析（图4.23）。4种转基因植株的根长数据都与野生型的相近，而突变体的根普遍较短。对根长数据进行统计分析的结果显示，4组转基因植株的总根长数值都明显大于突变体，且t检验分析结果显示的两两之间的差异都极其显著(p<0.01)。图4.23转基因拟南芥，突变体和野生型的根长比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.23Statisticalanalysisofthetotalrootlength.Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)67 吉林大学博士学位论文4.3.4.3株高的比较在图4.17中就可以看出，转基因植株与突变体植株最明显的差异表型是株高。极端矮化的BR合成缺陷突变体cpd-91中分别表达大豆来源的4个GmCPD同源基因就可以提升植株高度，从矮化表型完全恢复为野生型的形态。对株高的统计结果（图4.24）也印证了这一结论，突变体的株高数值明显低于4组转基因植株和野生型。4组转基因植株与突变体的株高差异都极其显著(p<0.01)。图4.24转基因拟南芥，突变体和野生型的株高比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.24PlantheightstatisticsanalysisCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)68 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析4.3.4.4果荚大小的比较从果荚的表型（图4.25）可以看出，cpd-91突变体的果荚极端短小瘦弱，而4组转基因植株的果荚长度明显大于突变体，且更加粗壮，与野生型的果荚形态相似。图4.25转基因拟南芥，突变体和野生型的果荚表型比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；标尺表示10mmFig.4.25Siliquemorphologycomparisonamongthewide-type,cpd-91mutantandthetransgenicplantsCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm对果荚的长度进行了测量并统计分析（图4.26）。结果显示，4组转基因植株的果荚长度都在0.8-1cm左右，与野生型果荚长度类似。而突变体的果荚长度在0.2左右。4组转基因植株的果荚长度都与突变体的差异极其显著（p<0.01）。69 吉林大学博士学位论文图4.26转基因拟南芥，突变体和野生型的果荚大小比较Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；35S::GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；35S::GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；35S::GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；35S::GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.26Statisticalanalysisofthesiliquelength.Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;35S::GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;35S::GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;35S::GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;35S::GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test)4.3.5GmCPD基因在cpd-91中的表达修复了BR合成途径4.3.5.1光暗条件下胚轴的伸长报道显示，cpd突变体在黑暗条件下出现去黄化现象，并失去对光诱导基因的压制，在光下表现出伸长和光形态建成缺陷[41]。为检测转入的GmCPD基因是否恢复了cpd-91突变体在光形态建成和暗形态发生过程中的缺陷，我们将470 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析种T3代cpd-9135S::GmCPD转基因拟南芥、突变体cpd-91和野生型Col-0植株种植在1/21MS培养基上，一部分在16小时光照条件下，一部分在黑暗条件下培养。5天后，分别观察表型并测量下胚轴长度。黑暗条件下（图4.27），4种转基因植株和野生型拟南芥幼苗的下胚轴都显著增长，子叶闭合呈弯钩状，这是黑暗条件下萌发的典型形态；而突变体幼苗的下胚轴却非常短，子叶张开，表现出明显不同的表型。在光照条件下（图4.27），突变体幼苗的下胚轴也比转基因和野生型幼苗的短。从下胚轴长度的统计数据（图4.27）中也可以看出，不论是在光下还是暗处，突变体下胚轴的长度都小于转基因植株和野生型。并且，4组转基因植株的下胚轴长度与突变体都存在极显著差异p<0.01。图4.27光暗条件下胚轴伸长实验结果（A）黑暗条件下的下胚轴表型。（B）光照条件下的下胚轴表型。Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转基因拟南芥；GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；标尺表示10mm。（C）黑暗条件下的下胚轴长度分析；（D）光照条件下的下胚轴长度分析；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.7.1GmCPDrestoreshypocotylelongationofcpd-91inbothlightanddarkness71 吉林大学博士学位论文(A)Morphologiesofthesix-day-oldseedlingsgrownindarkness.(B)Morphologiesofthesix-day-oldseedlingsgrowninlight.Col-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm;(C)Averagehypocotyllengthofseedlingsgrownforsixdaysindarkness.(D)Averagehypocotyllengthofseedlingsgrownforsixdaysinlight.Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothebri1-5mutant(**,p<0.01bythet-test).4.3.5.2对外源BR处理的响应为了进一步验证外源GmCPDs的转入是否修复了BR的合成，外源添加BR对4种转基因植株、突变体和野生型进行了处理。各组植株的种子分别播种于不添加（Mock）和添加100nM24-epiBL的1/2MS培养基中，并对其下胚轴、叶柄和根的形态变化进行了监测（图4.28）。萌发6天后对各组下胚轴的长度进行了测量；10天后，测量总根长并统计分析；13天后测量`叶柄长度并比较分析。详细结果与分析如下：Mock100nM图4.28BR处理条件下转基因拟南芥，突变体和野生型的表型Col-0：野生型拟南芥；cpd-91：油菜素内酯合成缺陷突变体；GmCPD1：T3代cpd-9135S::GmCPD1转基因拟南芥；GmCPD2：T3代cpd-9135S::GmCPD2转72 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析基因拟南芥；GmCPD3：T3代cpd-9135S::GmCPD3转基因拟南芥；GmCPD4：T3代cpd-9135S::GmCPD4转基因拟南芥；标尺表示10mm；Fig.4.28Phenotypesofthewide-type,cpd-91mutantandtransgenicplantsinhalf-strengthMSmediumsupplementedwithorwithout100nM24-epiBLCol-0:Wide-typeArabidopsis;cpd-91:ArabidopsisBRbiosythesisdefectivemutant;GmCPD1:T3cpd-9135S::GmCPD1transgenicArabidopsis;GmCPD2:T3cpd-9135S::GmCPD2transgenicArabidopsis;GmCPD3:T3cpd-9135S::GmCPD3transgenicArabidopsis;GmCPD4:T3cpd-9135S::GmCPD4transgenicArabidopsis;Bar=10mm4.3.5.2.1下胚轴长度的变化未经BR处理的油菜素内酯合成缺失突变体cpd-91的下胚轴长度明显小于野生型和GmCPD转基因拟南芥（图4.29）。外源添加100nM24-epiBL后，野生型、cpd-91和转基因拟南芥的下胚轴都明显伸长，但突变体的下胚轴长度仍小于其他各组（图4.29）。对各组下胚轴伸长量进行统计分析，结果（图4.29）显示，油菜素内酯合成缺失突变体cpd-91的下胚轴伸长量均小于其他各组，且差异极其显著（p<0.01）。AB图4.29BR处理对下胚轴长度的影响（A）BR处理后下胚轴长度的统计分析。（B）BR处理后下胚轴伸长量的统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.0173 吉林大学博士学位论文Fig.4.29Thevariationinthelengthofhypocotylshowingdifferentbrassinosteroid(BR)responses.(A)Hypocotyllengthof6-day-oldseedlinginmediumwithorwithout24-epiBL;(B)TheelongationofhypocotylafterBRtreatment;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,P<0.01bythet-test).4.3.5.2.2根长的变化经100nM24-epiBL处理后，各组根长均明显缩短。对各组的总根长进行测量和分析，结果（图4.30）显示，未经24-epiBL处理（Mock）的情况下，突变体植株的根长明显（p<0.01）小于野生型和4种转基因植株，而野生型和4种转基因植株之间差别不显著；而100nM24-epiBL处理条件下，各组植株的根长相差不大。对各组根长经24-epiBL处理后的缩短量进行了比较分析，结果（图4.30）表明，突变体植株经BR处理后的根长缩短量仅为野生型植株根长缩短量的24%，只占cpd-9135S::GmCPD1转基因植株根长缩短量的17%，是cpd-9135S::GmCPD2转基因植株根长缩短量的34%，是35S::GmCPD3转基因植株根长缩短量的46%，只是cpd-9135S::GmCPD4转基因植株根长缩短量的33%。AB图4.30BR处理条件下转基因拟南芥，突变体和野生型的根长比较（A）BR处理后总根长的统计分析。（B）BR处理后根长缩短量的统计分析。数74 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.30Thevariationinthelengthofrootshowingdifferentbrassinosteroid(BR)responses.(A)Measurementsofthetotalrootlengthoftheseedlingsintherootinhibitionassay;(B)RootlengthshorteningafterBRtreatment;hedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,P<0.01bythet-test).4.3.5.2.3叶柄长度的变化外源BR处理后，野生型，突变体和转基因拟南芥的叶柄长度均缩短。无论BR处理与否，油菜素内酯合成缺失突变体cpd-91的叶柄长度都明显小于野生型和GmCPD转基因植株。对叶柄的缩短量进行统计分析发现，突变体的叶柄长度缩短量明显小于其他各组，且差异极其显著（p<0.01）。AB图4.31BR处理对叶柄长度的影响（A）BR处理后叶柄长度的统计分析。（B）BR处理后叶柄缩短量的统计分析。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；星号表示对cpd-91突变体组做的方差分析；**：p<0.01Fig.4.31Thevariationinthelengthofpetioleshowingdifferentbrassinosteroid(BR)responsesinthewildtype(Col-0),CPD-deficientmutant(cpd-91)andtransgenicArabidopsisplants.(A)Petiolelengthof13-day-oldseedlingwithorwithoutBRtreatment;(B)Petiole75 吉林大学博士学位论文lengthshorteningafterBRtreatment.Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.Theasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtothecpd-91mutant(**,p<0.01bythet-test).以上结果说明外源BR对cpd-91突变体根长生长的抑制效应较弱，这可能是由于cpd-91突变体中BR激素合成水平低的缘故，需要大剂量的BR才能产生抑制效应。而4组转基因植株虽根长被抑的程度不同，但与突变体在24-epiBL处理后根长缩短量上均差异十分显著（p<0.01）。说明外源GmCPD基因转入cpd-91突变体植株修复了后者的内源BR合成途径。4.4讨论bri1-5突变体是一种对油菜素内酯不敏感的弱突变体[130]。其AtBRI1基因并未被敲除，也能够正常表达，但AtBRI1蛋白的定位出现障碍，蛋白滞留在内质网中不能被定位到质膜上，其受体功能丧失而导致突变[131]。bri1-5突变体的功能性缺失致使细胞伸长和分裂过程受阻，因此突变体表现出极端矮化、花序节间缩短、叶柄缩短等形态，叶片也因此皱缩，变为扁圆形。然而，在GmBRI1基因转入bri1-5突变体并强烈表达后，突变体的表型恢复到野生型的状态。表明GmBRI1基因在功能上对AtBRI1基因进行了互补。从而证明GmBRI1基因是有功能性的，且具有与拟南芥AtBRI1基因相似的功能。GmBRI1基因对突变体的表型恢复中，最有意义的是对株高和果荚大小的恢复。因为这两项性状在作物生产上是十分重要的。育种家希望获得株型较矮且产量不受影响的品种，可以在密植条件下获得高产，也可以抗倒伏防止减产。之前水稻和大麦中就报道了通过遗传学手段调控BRI基因构建产量不受影响的半矮化植株的可能性。在本实验中，GmBRI1基因在拟南芥突变体中的表达可以恢复果荚的大小，但在恢复株高表型方面，由于GmBRI1基因在各转基因株系的表达量不同，株高也各异，存在一系列介于突变体和野生型株高之间的植株。由此给我们提供了一个通过在油菜素内酯突变体背景下表达GmBRI1基因构建产量不受影响的半矮化植株的可能性。植物的生长状态在收到内部基因调控的同时也会受到外界环境的影响，因此转基因植株与突变体表型差异的产生不能排除环境因素的干预。因此我们需要设76 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析计实验验证转基因植株中的BR信号通路是否完整。从BR信号途径参与的植物生长发育过程入手，我们关注了BR信号参与的光暗条件下下胚轴伸长和BR处理条件下根生长这两个生理过程，以及BR信号反馈抑制BR合成基因表达的特性。正常情况下的植株（野生型）在黑暗条件下萌发会出现增长的下胚轴和闭合的子叶，只有在光下子叶才打开；而高浓度的外源BR能够抑制植株根的生长；CPD，DWF等BR标签基因也受反馈抑制而降低表达量。而早前就报道了BR突变体在下胚轴伸长和根生长中的缺陷[126]。光照和黑暗条件下下胚轴的伸长都受抑制，黑暗条件下萌发时子叶张开；外源BR处理时，根生长不受抑制反而被促进；BR合成基因也因不受反馈调节而表达上调。这些表现都与野生型明显不同，表现出BR信号通路的受损。而GmBRI1基因转化拟南芥突变体bri1-5得到的转基因植株却表现出于突变体迥异而与野生型近似的生理反应。由此说明转基因植株中的BR信号通路是完整的，这是GmBRI1基因表达的结果。说明GmBRI1具有和AtBRI1相似的BR受体的功能。cpd-91突变体中AtCPD基因缺失，因此在BR合成途径中催化22-OH-CR转化成22-OH-4-en-3-one的步骤受阻，BR合成不足，造成突变体呈现极端矮化、叶片皱缩，育性下降，根发育受阻的形态。然而，将4个GmCPD基因的任意一个转入cpd-91突变体都能使其恢复到野生型的状态。表明4个GmCPD基因都可以独立发挥作用，且能够与AtCPD基因的功能进行互补。从而证明我们克隆得到的4个GmCPD基因都是有功能性的，且具有与拟南芥AtCPD基因相似的功能。在GmCPD基因对拟南芥突变体的表型恢复中，显示出CPD基因在植物形态建成、根发育、叶片形态和果荚大小等生长发育过程中的重要调控功能。为我们优化作物生长发育结构，提高产量提供了一条新路径。为了验证GmCPD基因的表达对CPD缺失突变体的恢复是BR合成途径被修复，使内源BR含量回复到正常水平的结果，而不是外界环境的影响，我们设计了在光暗条件和外源BR处理下的生理反应实验。幼苗在光下和暗处萌发时，BR通过调控多种生长素响应基因尤其是生长素转运相关基因的表达调控下胚轴的伸长[74]。cpd-91突变体由于内源BR不足，在光暗条件下的下胚轴都较短。BR有促进细胞伸长的功能，因此外源施加BR能够促进根和下胚轴的伸长，但是高浓度的BR却能够抑制根的生长。在未添加外源BR的情况下我们比较了野生型，77 吉林大学博士学位论文突变体和转基因植株的根长和下胚轴长度，发现突变体的根长不论在萌发后5天还是13天都较短。当外源施加了高浓度的BR后，所有植株的根长都缩短到近似的长度，但突变体的缩短量最小。而各组的下胚轴都伸长，突变体处理后的下胚轴长度以及伸长量都小于其他各组。因此这可能是由于突变体内源BR激素水平较低导致需要更多外源施加的BR才能达到与野生型相同的效应。而每个GmCPD基因转化拟南芥油菜素内酯合成缺失突变体得到的转基因植株却表现出于突变体迥异而与野生型近似的生理反应。由此说明转基因植株中的BR合成恢复了正常，这是GmCPD基因表达的结果。说明GmCPD和AtCPD一样有催化BR合成的功能。4.5小结构建重组载体pTF101.1-GmBRI1和pTF101.1-GmCPD，分别转化拟南芥突变体bri1-5和cpd-91，在T3代bri1-535S::GmBRI1和4种cpd-9135S::GmCPD转基因拟南芥中进行了分子鉴定和表性分析。实验结果表明，GmBRI1基因在突变体bri1-5中的表达和GmCPD基因在突变体cpd-91中的表达都恢复了后者的表型。主要表现在：（1）转基因植株不同于突变体小而圆的叶片形态，而是长圆形的类似野生型的叶片形状。量化分析了叶柄长度、叶面积、叶长宽比三项指标，都显示了转基因植株与突变体的差异极其显著。（2）突变体的根长较转基因植株和野生型的短，且差异显著。（3）突变体的极端矮化表型在转基因植株中并没有发现，转基因植株的株高显著高于突变体，而与野生型相近。（4）果荚大小方面，突变体的果荚小而细，而转基因植株的果荚明显大于突变体。通过以上对于表型的细节分析，我们可得出以下结论：GmBRI1基因在突变体bri1-5中的表达能够恢复后者的表型，证明GmBRI1基因是有功能性的，且与AtBRI1基因功能相似。为验证转基因植株、突变体和野生型中BR信号途径的通路完整性，进行了光暗条件下下胚轴伸长实验、BR处理根长抑制实验和BR标签基因表达的检测。转基因植株在三项实验中都表现出与野生型类似的BR信号通路完整状态下的生理反应，与突变体的生理反应差异显著。实验结果表明，转基因植株中的BR信号通路是完整的。转基因植株与突变体表型的差异是因为GmBRI1发挥了BR受体的功能而修复了突变体中破损的BR信号通路。进一步确认我我们的结论：在78 第4章GmBRI1和4个GmCPD同源基因的功能分析大豆中克隆得到的GmBRI1基因是编码BR受体的有功能的BRI1同源基因，且GmBRI1的功能可以与AtBRI1互补。为验证转基因植株、突变体和野生型中BR合成途径的完整性，进行了光暗条件下下胚轴伸长实验、BR处理下根长、下胚轴长度和叶柄长度的响应实验。个转基因植株在以上生理实验中都表现出与野生型类似的内源BR在正常水平下的生理表现，与突变体的生理反应差异显著。实验结果表明，4种转基因植株中的BR合成途径都是完整的。转基因植株与突变体表型的差异是因为GmCPD发挥了BR合成酶的功能而修复了突变体中中断的的BR合成途径。以上实验结果进一步确认了我们的结论：在大豆中克隆得到的4个GmCPD基因是编码P450单加氧化酶的有功能的CPD同源基因，且GmCPD基因的功能可以与AtCPD基因互补。同时也表明GmCPD基因在植物下胚轴伸长、根的发育和开花时间调控方面发挥重要作用。79 吉林大学博士学位论文第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系5.1材料5.1.1植物材料大豆品种自贡冬豆，大豆品种黑河27，各大豆品种均由本实验室保存和扩繁野生型拟南芥Col-0、拟南芥突变体cpd-91、T3代转基因拟南芥cpd-9135S::GmCPD1、cpd-9135S::GmCPD2、cpd-9135S::GmCPD3、cpd-9135S::GmCPD45.1.2试剂TRNzol总RNA提取试剂购自天根生化科技有限公司；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自全式金生物技术有限公司；5.1.3引物引物名称用途5'到3'序列ACTCTCCCGCTATGTATGTCGCAtACTIN2-SqRT-PCRAGAAACCCTCGTAGATTGGCACAtACTIN2-AqRT-PCRAtFT-SqRT-PCRCTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCACAtFT-AqRT-PCRGCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGAAtCPD-SqRT-PCRCCTTGGAGATGGCAGCAAAtCPD-AqRT-PCRGTAACCGGGACATAGCCTTGGmG6PDH-SqRT-PCRGTCTGTTATCCGCCTACAGCCTGmG6PDH-AqRT-PCRACTCCTTGATACCGTTGTCCATGmFT2a-FqRT-PCRGCTGACATCTCTGTTATTGTAGGTAGmFT2a-RqRT-PCRTAATTCATAACAAAGCAAACGAGTAqGmBRI1-SqRT-PCRTCTCCGTCTGTTCTGCATCTTCTTqGmBRI1-AqRT-PCRGAGGTCTATGGAAGTGAGGTGCTG80 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系qCPD1-SqRT-PCRGCATCTTTCATCATCATACCACTCCqCPD1-AqRT-PCRCAACAAAGGGGAGTCCGAGCqCPD2-SqRT-PCRATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGqCPD2-AqRT-PCRCGAAGGGGAGCCCGAGTGTACqCPD3-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCqCPD3-AqRT-PCRCGGCGGAGGAAGAGGAGGAGqCPD4-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTqCPD4-AqRT-PCRGAACACGCGGCGGAGGTATAAG5.1.4主要仪器设备PCR扩增仪；-80℃超低温冰箱；高速台式离心机；冷冻离心机；ABI7900；光照培养箱；光温控制植物栽培室5.2方法5.2.1Trizol法提取植物总RNA实验方法同2.2.25.2.2cDNA的合成实验方法同2.2.35.2.3荧光实时定量PCR实验方法同3.2.45.3结果5.3.1对拟南芥开花的影响油菜素内酯与开花关系的研究起始于拟南芥油菜素内酯突变体晚花表型的发现。多种油菜素内酯突变体尤其是合成缺失突变体，比如det2[132]、dwf4[40]、cpd[80,11]等，都表现出不同程度的开花延迟现象。在我们的研究中也得出了与81 吉林大学博士学位论文以往报道想吻合的结果：cpd-91突变体比野生型开花晚了大约10天（图5.1）。然而，将GmCPDs转入cpd-91突变体后，转基因植株的开花时间与野生型Col-0的开花时间一致，明显早于cpd-91突变体（图5.1）。因此，4个GmCPD同源基因都能恢复拟南芥CPD缺失突变体的晚花表型，说明GmCPD在开花调控过程中担任一定的角色。图5.1转基因拟南芥，突变体和野生型的开花时间比较(A)从萌发到开花天数的比较。(B)开花时的莲座叶片数的比较。数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；Fig.5.1Floweringtimeanalysisamongwildtype(Col-0),CPD-deficientmutant(cpd-91)andtransgenicArabidopsisplants.(A)Comparisonofthedaystofloweringand;(B)Comparisonoftherosetteleafnumberatanthesis;Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.GmCPD基因与开花的关联是否由于其与开花关键基因的互作？因此，我们选取了开花途径的一个关键基因FT(FloweringLocusT)。FT是四条开花途径的整合点，其表达产物能够从叶片长距离运输到茎尖分生组织启动开花，对FT基因的调控能够直接控制开花的时间。为此，对野生型、cpd-91突变体和转基因植株中AtFT基因在营养生长阶段和开花时期的表达情况进行了检测。发现（图5.2），各组都表现出相似的AtFT基因表达模式，在营养生长阶段AtFT基因的表达量较低，而开花后明显升高。各组间没有明显的表达差异。说明，CPD基因82 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系与FT基因没有明显的直接互作关系。图5.2转基因拟南芥，突变体和野生型中AtFT基因的表达vegetativestage：营养生长阶段；floweringperiod：生殖生长阶段；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SDFig.5.2TheexpressionpatternofArabidaopsisFT(FloweringLocusT)invegetativestageandfloweringperiodThedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.那么，CPD基因在开花过程中都扮演了一个什么角色？通过从营养生长阶段到开花阶段CPD的表达情况进行一下探讨。选取了拟南芥Col-0生长发育的三个代表性的时期：出苗后两周（营养生长阶段）、花序刚刚出现（开花起始）和开花后一周（开花旺盛时期）。各时期的叶片进行取样，检测AtCPD基因的表达情况。结果（图5.3）表明，AtCPD基因在营养生长阶段的表达量最高，开花起始后开始下调，开花旺盛期表达量最低。呈现与AtFT基因相反的表达模式。而开花前期是AtCPD基因表达最活跃的时期。因此，推测CPD基因是在开花前发挥重要作用。83 吉林大学博士学位论文图5.3开花过程中AtCPD基因的表达1：营养生长阶段（萌发后两周）；2：开花起始（花序刚刚出现）；3：开花期（开花后一周）；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SDFig.5.3TheexpressionpatternofAtCPDduringflowering.1,2and3representthreedevelopmentalstages.1:vegetativestage,twoweeksafteremergence;2:floweringinitiation,thetimethatinflorescence-budjustemerged;3:floweringperiod,oneweekafterflowering.；Thedatarepresentsthemean±SDofthreeindependentexperiments.5.3.2在大豆开花逆转系统中的表达大豆是典型的短日植物，开花时间受光照长度的调控。大豆品种自贡冬豆是对光周期非常敏感的品种，不仅只在短日诱导条件下开花，当从短日移到长日条件下还会发生开花逆转：已经开始生殖生长的植株，原始花荚大量脱落，转而产生叶片，回复到旺盛的营养生长状态[133]。根据逆转程度的不同开花逆转分为整株逆转、花序逆转和花逆转三种类型[134]。在对自贡冬豆品种开花逆转现象的研究发现，自贡冬豆在短日条件下至少处理13天再移到长日条件下就可以发生开花逆转[133]。开花逆转系统是大豆光周期反应研究中的重要系统，我们在此系统中检测油菜素内酯相关基因的表达变化，探讨油菜素内酯途径与光周期开花途径的可能关联。5.3.2.1大豆开花逆转系统的建立自贡冬豆植株分别置于16小时长日照、12小时短日照下培养。12小时短日84 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系照处理组的一部分在处理13天后移至长日照条件下。自出苗后开始，第5天，第9天，第13天，第19天，第25天分别取叶片样品，提取总RNA并反转录为cDNA，以此为模板进行荧光实时定量PCR检测。5.3.2.2GmBRI1和4个GmCPD同源基因在叶片中的表达首先，在开花逆转系统中检测开花关键基因GmFT2a的表达情况。短日和长日处理条件下，随着天数的增加，GmFT2a基因的表达量都逐渐上升。但长日条件下的表达量明显低于短日条件。短日处理时，GmFT2a基因表达量在13天达到峰值，而后略有降低。短日处理13天后移到长日条件下，GmFT2a基因的表达量降低到与连续长日处理相近的水平（图5.4）。图5.4开花逆转系统中GmFT2a基因的表达LD：长日处理；SD：短日处理：13SD-LD：13天短日处理后转长日处理；x轴表示处理天数；y轴表示以GmG6PHD基因为内参的相对表达量mean±SD；数据为三次独立重复实验所得。Fig.5.4TheexpressionpatternofGmFT2ageneinthefloweringreversionsystermofsoybeanLD:longdaytreatment;SD:shortdaytreatment;13SD-LD:transfertolongdayconditionsafter13daysshortdaytreatment;x-axisrepresentsthedaysoftreatment;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.85 吉林大学博士学位论文无论长日处理还是短日处理，GmBRI1基因的表达量都较低，只在短日处理13天时出现显著的表达高峰，表达量是其他情况下的10倍左右（图5.5）。短日处理13天移至长日条件后，GmBRI1基因的表达量达到连续长日处理的水平，比短日处理情况下表达量略高（图5.5）。图5.5开花逆转系统中GmBRI1基因的表达LD：长日处理；SD：短日处理：13SD-LD：13天短日处理后转长日处理；x轴表示处理天数；y轴表示以GmG6PHD基因为内参的相对表达量mean±SD；数据为三次独立重复实验所得。Fig.5.5TheexpressionpatternofGmBRI1geneinthefloweringreversionsystermofsoybeanLD:longdaytreatment;SD:shortdaytreatment;13SD-LD:transfertolongdayconditionsafter13daysshortdaytreatment;x-axisrepresentsthedaysoftreatment;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.GmCPD1基因在短日条件下的表达量明显高于长日条件下。5d到13d的表达量最高，在13d达到峰值，然后表达显著下调。长日条件下GmCPD1基因的表达水平一直趋于平稳且显著低于短日处理植株。短日处理13天移到长日条件下的植株，GmCPD1基因的表达量略高于连续短日处理（图5.6）。GmCPD2基因在开花逆转系统中的表达模式与GmCPD1基因相同，但GmCPD2基因表达量更高，短日处理与长日处理下的表达量差异更大。最值得关注的是短日处理13d时GmCPD2基因表达量达到峰值，而后迅速下降到长日处理的表达水平（图5.6）。GmCPD3基因的表达量仅次于GmCPD2基因，也在短日处理5d、9d和13d表86 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系达量较高，尤其是13d时达到最高表达量，25d时下降到最低（图5.6）。长日处理的表达量一直较低。短日处理13天后移到长日下，GmCPD3基因表达量19d时降到与连续长日处理相同的水平，25d时表达量与19d相比没有下调，而明显高于长日处理条件下（图5.6）。GmCPD4基因的总体表达量与GmCPD1基因类似，趋势也相同。也是在短日处理13d时表达量显著增高，达到峰值，而后迅速下调（图5.6）。短日处理13天后长日条件下的表达高于连续长日处理（图5.6）。图5.6开花逆转系统中4个GmCPD同源基因的表达LD：长日处理；SD：短日处理：13SD-LD：13天短日处理后转长日处理；x轴表示处理天数；y轴表示以GmG6PHD基因为内参的相对表达量mean±SD；数据为三次独立重复实验所得。Fig.5.6TheexpressionpatternoffourGmCPDgenesinthefloweringreversionsystermofsoybeanLD:longdaytreatment;SD:shortdaytreatment;13SD-LD:transfertolongday87 吉林大学博士学位论文conditionsafter13daysshortdaytreatment;x-axisrepresentsthedaysoftreatment;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.综合以上表达结果可以看出，GmBRI1和4个GmCPD基因在开花逆转系统中都表现出相同的表达模式：连续长日处理条件下的表达量一直趋于平稳且明显低于短日处理；而在短日处理时，表达量逐渐上调，并在13天时出现显著地高表达峰，之后又明显下降。这说明GmBRI1和4个GmCPD基因的表达在大豆中都受到光周期的调控，可被开花诱导光长（短日）诱导上调。在短日处理13天时出现了如此高的表达峰预示油菜素内酯相关基因在这一时期发挥了重要功能。前期的研究中发现，短日处理13天，是自贡冬豆花序原基首次出现的时间，油菜素内酯相关基因，GmBRI1和GmCPDs，有可能参与了茎尖分生组织的花原基分化和开花起始，从而与开花产生了密切联系。5.3.3在不同光周期敏感性大豆品种中的表达大豆各品种的光周期反应敏感性差别很大，这一特性造成大豆品种开花期和生育期的多样性，直接影响了品种的产量和适应性。到目前为止，造成大豆各品种间光周期反应敏感性差异的分子机制尚不清楚。基于以上实验中显示出的GmBRI1和4个GmCPD基因与大豆开花的关系，本实验通过在不同光周期敏感性大豆品种中GmBRI1和4个GmCPD基因的表达模式探讨油菜素内酯相关基因与大豆开花的关系。我们选取了两个典型的大豆品种：自贡冬豆，光周期敏感的晚熟品种，仅在短日条件下诱导开花，长日条件下将一直保持营养生长；黑河27，光周期不敏感的早熟品种，不论长日非诱导光长或短日诱导光长条件下，均在出苗后25-27天开花。如图5.7中所示为长日条件下出苗后36天自贡冬豆和黑河27的开花表型。此时黑河27已经出现了2cm左右的幼嫩果荚，而自贡冬豆仍然保持营养生长。88 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系图5.7大豆品种黑河27与自贡冬豆的开花表型Heihe27：光周期不敏感的大豆早熟品种；Zigongdongdou：光周期敏感的大豆晚熟品种；两种大豆品种同时播种，长日条件下培养，此图片拍摄于大豆出苗后36天，此时黑河27已经出现了2cm的幼嫩果荚，而自贡冬豆仍保持营养生长状态；Bar=10cmFig.5.7Thephenotypeofearlyandlatefloweringsoybeanplants.Heihe27ontheleftisaphotoperiod-insensitiveearly-maturityvariety;Zigongdongdouontherightisaphotoperiod-sensitivelate-maturityvariety.Thephotowastakenatthe36thdayafteremergenceunderlongdaycondition.Heihe27hadalreadyproducedonepodwithlengthmorethan2cmandsomeyoungerpods(labeledbyredarrows),whileZigongdongdouremainedvegetativegrowth.Bar=10cm;5.3.3.1在大豆叶片中的表达对长日下培养的自贡冬豆和黑河27品种的叶片进行隔天取样，检测大豆叶片中4个GmCPD基因的表达情况。结果(图5.8)显示，长日处理5天、7天和9天，4个GmCPD基因在自贡冬豆中的表达都很低，而在黑河27中却有显著的高表达。11天之后，GmCPD基因的表达量在自贡冬豆叶片中明显上调，但在黑河27中却有所下降。GmCPD1,GmCPD2和GmCPD4的表达模式是基本相似89 吉林大学博士学位论文的：第5天到第11天，黑河27中这3个GmCPD同源基因的表达量明显高于自贡冬豆；第13天到第19天，自贡冬豆中的表达量升高并高于黑河27；在第25天，黑河27中的表达量高于自贡冬豆。但是，GmCPD3基因的表达情况有所不同。除了第15天，其他阶段黑河27中GmCPD3基因的表达量都高于自贡冬豆。尤其是在第19天，黑河27中达到表达峰值。图5.8GmCPD基因在大豆不同光周期敏感性品种叶片中的表达(A)GmCPD1基因的表达情况。(B),GmCPD2基因的表达情况。(C),GmCPD3基因的表达情况。(D)GmCPD4基因的表达情况。X轴表示出苗到取样的时间，单位为天（d）；表达量为以GmG6PDH为内参基因的相对表达量；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SDFig.5.8ExpressionpatternsofGmCPDsinsoybeanvarietiesofdifferentphotoperiodsensitivities(ZigongdongdouandHeihe27)duringLDtreatment.Leafsamplesfromlongdaygrownsoybeanplantsweretakenatthe5th,7th,9th,11th,13th,15th,19thand25thdayaftercotyledonopeningandlabeledas5d,7d,9d,11d,13d,15d,19dand25d;qRT-PCRwascarriedouttodeterminetherelativeexpressionlevelsofGmCPD1(A),GmCPD2(B),GmCPD3(C)andGmCPD4(D)ineachsample;RelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631);thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.90 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系5.3.3.2在大豆子叶中的表达叶片和子叶是GmBRI1和4个GmCPD基因在大豆中的主要表达部位，因此，对自贡冬豆和黑河27的子叶在长日处理后第3天、第6天和第9天进行取样，检测GmBRI1和4个GmCPD基因的表达情况。长日处理第3天（3d），GmBRI1基因在自贡冬豆和黑河27子叶中的表达量基本相同（图5.9）。但在6d和9d时，自贡冬豆子叶中GmBRI1基因的表达量明显下调，虽然黑河27中GmBRI1基因的表达6d时增加，9d时降低，但表达量明显高于自贡冬豆子叶，且差异极显著（p<0.01）（图5.9）。图5.9GmBRI1基因在大豆不同光周期敏感性品种子叶中的表达Zigongdongdou：大豆品种自贡冬豆；Heihe27：大豆品种黑河27；3d：长日处理后3天；6d：长日处理后6天；9d：长日处理后9天；表达量为以GmG6PDH为内参基因的相对表达量；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；**：p<0.01Fig.5.9ComparisonofGmBRI1expressioninthecotyledonsofZigongdongdouandHeihe27,twosoybeanvarietieswithdistinctphotoperiodsensitivities.Zigongdongdou：Soybeancv.Zigongdongdou;Heihe27:Soybeancv.Heihe27;3d:3daysafterLDtreatment;6d:6daysafterLDtreatment;9d:9daysafterLDtreatment;RelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments,andasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtotheZigongdongdouplants(**,P<0.01bythet-test).91 吉林大学博士学位论文GmCPD1,GmCPD2和GmCPD4在大豆子叶中的表达模式基本相同（图5.10）：随着天数的增加，黑河27子叶中GmCPD1基因的表达量呈上升趋势，而自贡冬豆子叶中GmCPD1基因表达量逐渐下降。在长日处理第3天，虽然自贡冬豆中基因表达量高于黑河27，但在第6和第9天，自贡冬豆中的基因表达量都低于和黑河27。自贡冬豆和黑河27中的基因表达量都存在极其显著（p<0.01）的差异。而GmCPD3基因的表达模式也其他三者不同。随着天数的增加，GmCPD在自贡冬豆和黑河27中的表达量逐天下降，且黑河27子叶中的表达量始终高于自贡冬豆，且差异显著（p<0.01）（图5.10）。图5.10GmCPD基因在大豆不同光周期敏感性品种子叶中的表达(A)GmCPD1基因的表达情况。(B),GmCPD2基因的表达情况。(C),GmCPD3基因的表达情况。(D)GmCPD4基因的表达情况。Zigongdongdou：大豆品种自贡冬豆；Heihe27：大豆品种黑河27；3d：长日处理后3天；6d：长日处理后6天；9d：长日处理后9天；表达量为以GmG6PDH为内参基因的相对表达量；数据为三次独立实验所得；Y轴数据为mean±SD；**：p<0.01Fig.5.10ComparisonofGmCPDsexpressioninthecotyledonsofZigongdongdou92 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系andHeihe27,twosoybeanvarietieswithdistinctphotoperiodsensitivities.RelativeexpressionlevelsofGmCPD1(A),GmCPD2(B),GmCPD3(C)andGmCPD4(D)wereanalyzedbyqRT-PCRonthe3rdday(3d),6thday(6d)and9thday(9d)aftercotyledonopeningundertheLDcondition.RelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments,andasterisksindicatesignificantdifferencescomparedtotheZigongdongdouplants(**,P<0.01bythet-test).综合上述大豆不同光周期敏感性品种中GmBRI1和4个GmCPD基因的表达情况，可以看出，不论在叶片还是子叶中，GmBRI1和4个GmCPD基因在黑河27中的表达都比自贡冬豆中的活跃，尤其是在长日处理的初期阶段表现出较高的表达量。与严格受到光周期调控的自贡冬豆相比，黑河27更加易于开花，这不仅取决于开花机制的调控，更应该由品种自身因素决定。黑河27这种易于被诱导开花的品种可能存在某种易于被诱导的状态，也可以说他为开花做的准备更充分且限制因素较少，可以轻易冲破光周期的限制。油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPDs在黑河27品种中中较高的表达可能就是黑河27具备这种易开花状态的因素之一。5.4讨论本实验得到了与之前研究中相符的结果，就是cpd突变体表现出营养生长期延长开花推迟的表型[80,135]。这一晚花表型可被GmCPD基因的表达所恢复（图5.1）。由此可以证明GmCPDs与植物开花密切相关。CPD被报道与FT上游的生物钟基因有互作关系[114,83]，但对野生型、cpd-91突变体和GmCPDs转基因拟南芥中AtFT基因的表达进行分析发现，CPD缺失或过表达的情况下AtFT基因都没有太显著表达变化（图5.2）。而在Col-0野生型拟南芥中，AtCPD的表达水平在营养生长阶段较高，随着开花的进行而逐渐下降（图5.3）。因此，GmCPDs很有可能参与开花诱导过程。但以往的报道显示外源施加BR不能诱导植株提前开花。因此GmCPDs基因可能不是一个开花启动的决策者而是开花93 吉林大学博士学位论文过程必不可少的参与者。这一推测在GmCPDs基因在大豆开花逆转系统的表达模式中也得到了印证（图5.5、图5.6）。GmBRI1和GmCPDs的表达受到光周期的调控，并在短日处理13天出现了一个十分突出的表达高峰。大豆光周期敏感品种自贡冬豆的短日处理13天是一个非常特别的时期。在本实验室早期的研究中，李晓梅等研究了大豆开花逆转系统中自贡冬豆的解剖学特征，短日处理13天正是自贡冬豆茎尖分生组织出现花原基的时期，而之前茎尖分生组织一直保持营养生长状态[136,137]。同样的结果在本实验室孙洪波等的研究中也有显示[138]。自贡冬豆在开花逆转系统中的茎尖石蜡切片结果表明，直到短日诱导13天时才在茎尖出现花原基的分化[138]。因此，可以推测GmBRI1和GmCPDs在茎尖分生组织的成花转换中发挥重要作用。那么，对cpd突变体的开花延迟现象可以有这样一种解释，由于CPD基因的缺失，茎尖分生组织花原基的分化受阻，营养生长向生殖生长的转化过程被延长，从而导致花期推迟。CPD如何参与茎尖分生组织的成花转化至今尚无报道，但是却有研究表明拟南芥的茎尖是BR的高含量部位，并有BR合成相关基因DWF4,BR6ox1和BR6ox2在此高表达[120]。在水稻中，BR对细胞伸长和细胞壁修饰的功能在茎尖分生组织发挥功能和花序建成过程中发挥至关重要的作用。因此，在开花过程中，GmBRI1和GmCPDs基因很有可能扮演了一个物资供应者的角色，在开花的物质准备和基础构造建设中必不可少，虽不能直接诱导开花，但却是开花诱导过程中不可或缺的。对于GmBRI1和GmCPDs基因与开花的关系，还有很多未知，需要进一步的探索。5.5小结CPD基因的缺失使cpd-91突变体出现晚花表型，而GmCPD基因的过表达能够使花期恢复到与野生型一致，说明CPD基因在开花过程中必不可少。在大豆开花诱导系统中探讨了油菜素内酯相关基因GmBRI1和4个GmCPD基因的表达模式。GmBRI1和4个GmCPD基因的表达受到光周期的调控，都在短日诱导处理13天时表现极高的表达量，而短日处理13天正是茎尖分生组织开始出现花原基的时期，显示了油菜素内酯相关基因与成花转化和花发育可能存在某种联系。在大豆不同光周期敏感性品种中，GmBRI1和4个GmCPD基因在光周期不敏感的早熟品种的叶片和子叶中的表达量都高于光周期敏感的晚熟品种，尤其是94 第5章GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花的关系在生长发育的早期阶段。因此油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPDs与植物开花密切相关。95 96 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析6.1材料6.1.1植物材料大豆品种William82，大豆品种自贡冬豆6.1.2菌种大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌EHA1016.1.3试剂酶XbalI、SacI购自NEB公司；ExTaq聚合酶和T4连接酶购自TaKaRa公司；TRNzol总RNA提取试剂、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix购自全式金生物技术有限公司；SYBRPremixExTaq购自KAPA生物公司；MES、spe、kan、chl、rif购自sigma公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞和DNA分子量标准购自康润生物；引物合成和基因序列测定由华大基因完成。6.1.4引物引物名称用途5'到3'序列GmFT2a-F添加His标签，RT-PCRAAACTAGTGTGCACACTATCCCATGGTGGTGATGGTGATGATGGTATAACCTGmFT2a-R-His添加His标签CCTTCCACCAGAACCGCTCTAGAAAACTAGTGTGCACACTATGmFT2a-X添加酶切位点CCCATGCGAGCTCGTGGTGATGGTGATGATGGTGmFT2a-S添加酶切位点ATAACGmFT2a-His-RRT-PCRGTGGTGATGGTGATGATGGTAT97 吉林大学博士学位论文GmFT2a-His-35S转基因植株DNA检测AGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCGmFT2a-His-NOS转基因植株DNA检测CTTCCACCAGAACCAGATTCCCTCGmG6PDH-SqRT-PCRGTCTGTTATCCGCCTACAGCCTGmG6PDH-AqRT-PCRACTCCTTGATACCGTTGTCCATGmFT2a-FqRT-PCRGCTGACATCTCTGTTATTGTAGGTAGmFT2a-RqRT-PCRTAATTCATAACAAAGCAAACGAGTAqGmFT2a-His-SqRT-PCRTTATTTCGTCAACTGGGTAGGGAGqGmFT2a-His-AqRT-PCRTTAGTGGTGATGGTGATGATGGTATGmG6PDH-SqRT-PCRGTCTGTTATCCGCCTACAGCCTGmG6PDH-AqRT-PCRACTCCTTGATACCGTTGTCCATqGmBRI1-SqRT-PCRTCTCCGTCTGTTCTGCATCTTCTTqGmBRI1-AqRT-PCRGAGGTCTATGGAAGTGAGGTGCTGqCPD1-SqRT-PCRGCATCTTTCATCATCATACCACTCCqCPD1-AqRT-PCRCAACAAAGGGGAGTCCGAGCqCPD2-SqRT-PCRATGGCATCTTTCATCTTCACACCTGqCPD2-AqRT-PCRCGAAGGGGAGCCCGAGTGTACqCPD3-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCqCPD3-AqRT-PCRCGGCGGAGGAAGAGGAGGAGqCPD4-SqRT-PCRATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCTqCPD4-AqRT-PCRGAACACGCGGCGGAGGTATAAG6.1.5主要仪器设备PCR扩增仪；电泳仪；紫外凝胶成像仪；恒温摇床；紫外分光光度计；电热恒温培养箱；-80℃超低温冰箱；超净工作台；pH计；万分之一天平；灭菌锅；电热恒温水浴锅；连接仪；电转仪；高速台式离心机；冷冻离心机；金属浴；ABI7900；光照培养箱。98 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析6.2方法6.2.1质粒的提取实验方法同4.2.16.2.2PCR反应用ExTaq聚合酶（TaKaRaDRR100A）进行扩增1）PCR反应体系如下：试剂成分20l反应体系10×ExTaqBuffer2μlExTaq0.1μlPrimer1(10μM)1μlPrimer2(10μM)1μldNTP(2.5mM)1.6μlDNA模板4μlddH2O10.3μl2）设定PCR程序为：StepTemperatureDurationCyclesEnzymeactivation95℃5minholdDenature95℃30secAnnel55℃30sec33cyclesExtend72℃50secExtend72℃10minhold3）PCR的扩增产物回收纯化后进行琼脂糖凝胶电泳。6.2.3XbalI和SacI双酶切实验方法同4.2.26.2.4用T4连接酶连接目的基因与载体实验方法同4.2.499 吉林大学博士学位论文6.2.5EHA101根癌农杆菌感受态细胞的制备实验方法同4.2.56.2.6电击法转化EHA101感受态细胞实验方法同4.2.66.2.7根癌农杆菌介导的的大豆子叶节转化法各组培相关培养基的配制见附录。6.2.7.1种子灭菌与发芽1）挑选无病害、无裂痕、饱满的大豆种子，平铺于玻璃培养皿中，开盖放置在干燥器中，同时在干燥器中放置一盛有100ml次氯酸钠的烧杯，向烧杯中加4ml浓盐酸，密封干燥器，氯气灭菌16h。2）取灭菌的种子接种于发芽培养基上，盖上培养皿盖子，但不封口，置于温度24℃光照16h的无菌培养间培养，发芽时间为4-6天。6.2.7.2菌液准备1）挑取含有重组载体的农杆菌单克隆，接种于含50mg/LKan、50mg/LSpe、25mg/LChl的5mlYEP液体培养基中，28℃250rpm振荡培养至OD600值为0.6-0.8；2）取上一步的5ml菌液倒入500mlYEP液体中（内含50mg/LKan、50mg/LSpe、25mg/LChl），28℃250rpm振荡培养至OD600值为0.8-1.0；3）收集菌液置于离心管中，5000rpm离心5min并收集菌体，加入少量重悬液，轻轻吹吸使菌体充分悬浮，最后菌液重悬至OD600=0.6-0.8，形成工程菌液，侵染大豆外植体。6.2.7.3侵染与共培养1）切取发芽良好的外植体，用镊子剥去种皮，保留3-5mm下胚轴；2）沿下胚轴竖直切开两片子叶，剥离胚芽，用手术刀沿子叶节处向下平行划伤8-10次，后置于菌液中侵泡30min；3）将子叶从侵染液中取出，内面向下平放在表面附有灭菌滤纸的共培养培养基中，Parafilm封口膜封口，24℃，16h光照，培养4-5天。6.2.7.4芽诱导100 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析1）用芽诱导液体培养基清洗共培养后的外植体3-4次，浸泡30min，用灭菌后的滤纸吸取表面多余液体，子叶内面向上倾斜45°角插入芽诱导培养基中，24℃，16h光照，培养15d；2）取出外植体，用刀片除去真芽，保留丛生芽；3）将外植体插入芽筛选培养基中，插入方式同上，24℃，16h光照，培养15天。6.2.7.5芽伸长1）选取生长状态良好的外植体，除去死芽和大芽；2）将外植体移入芽伸长培养基，24℃，16h光照培养，每15天继代一次，大约继代3次后开始出现伸长的再生苗。6.2.7.6生根1）当芽伸长时期中的再生苗伸长到3-5cm时，将伸长苗沿茎底端切下，插入生根培养基中，24℃，16h光照培养至生根。6.2.7.7炼苗与移栽1）待生根培养基中的再生苗长出足够的根时，将再生苗取出，洗掉根上残留的琼脂，栽入含有蛭石：营养土=1：1土壤的小盆中，用保鲜膜将再生苗包裹以保持湿度，在培养箱中24℃，16h光照培养，缓苗5-7天后，逐步脱去保鲜膜，待其生长良好时移栽到大盆，移到室外环境适宜处继续培养。6.2.8Trizol法提取植物总RNA实验方法同2.2.26.2.9cDNA的合成实验方法同2.2.36.2.10荧光实时定量PCR实验方法同3.2.46.3结果6.3.1GmFT2a转基因大豆植株的获得6.3.1.1重组载体pTF101.1-GmFT2a-His的构建本实验室已克隆得到大豆中的GmFT2a基因【文章，专利】并保存有101 吉林大学博士学位论文pMD18-T-GmFT2a载体。以pMD18-T-GmFT2a质粒为模板，用引物GmFT2a-F和GmFT2a-R-His进行PCR反应，GmFT2a-R-His引物的5’端加入“GTGGTGATGGTGATGATG”序列，此为加入的His标签（六个组氨酸），扩增得到长度为568bp的DNA片段（图6.1），此DNA片段回收纯化后与pMD18-Tsimple载体连接，挑取阳性克隆，测序得到序列与GmFT2a-His序列完全相同的阳性克隆，此克隆既为获得的带标签的GmFT2a基因，即GmFT2a-His基因。图6.1GmFT2a-His基因的PCR扩增产物电泳图谱M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1,2,3,4：GmFT2a-His基因的PCR扩增产物；-：阴性对照(模板为水)Fig.6.1PCRproductsofGmFT2a-HisM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1,2,3,4:PCRofGmFT2a-His;-：Nagetivecontrol以载体pMD18-T-GmFT2a-His为模板，用含有XbalI和SacI酶切位点的引物GmFT2a-X和GmFT2a-S进行扩增。得到583bp的PCR产物（图6.2）。将此PCR产物用XbalI和SacI双酶切（图6.3），回收酶切产物，与经过同样双酶切的pTF101.1-GFP的大片段连接（图6.4），将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50mg/L壮观霉素的LB培养基上筛选出阳性克隆。以阳性克隆的菌液作为模板，以GmFT2a-F和GmFT2a-His-R为引物进行菌落PCR鉴定，得到568bp的PCR产物的为阳性质粒（图6.5），该阳性质粒即为重组载体pTF101.1-GmFT2a-His，其图谱如图6.6所示。102 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析图6.2GmFT2a-His基因加酶切位点电泳图谱M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1,2：GmFT2a-His加酶切位点的PCR产物；-：阴性对照(模板为水)Fig.6.2PCRproductsofGmFT2a-HisgeneaddingrestrictionenzymecuttingsiteM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1,2:PCRproductsofGmFT2a-Hisaddingrestrictionenzymecuttingsite;-：Nagetivecontrol图6.3GmFT2a-His基因双酶切电泳图谱M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1,2：GmFT2a-His基因双酶切产物Fig.6.3RestrictionenzymedigestionresultsofGmFT2a-HisgeneM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1,2:restrictionenzymedigestionresultofGmFT2a-His103 吉林大学博士学位论文图6.4pTF101.1-GFP载体双酶切电泳图谱M：1kbPlusDNAladder；1,2：pTF101.1-GFP载体双酶切产物Fig.6.4RestrictionenzymedigestionresultsofpTF101.1-GFPM：1kbPlusDNAladder;1,2:restrictionenzymedigestionresultofpTF101.1-GFP图6.5pTF101.1-GmFT2a-His载体菌落PCR鉴定结果M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1-8：pTF101.1-GmFT2a-His菌落鉴定结果-：阴性对照（模板为水）Fig.6.5ColonyPCRproductsofpTF101.1-GmFT2a-HisM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);1-8:PCRproductsofpTF101.1-GmFT2a-His;-:negativecontrol将重组载体pTF101.1-GmFT2a-His转化根癌农杆菌EHA101感受态细胞，28℃条件下于LB培养基（含壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L，氯霉素25mg/L，利福平20mg/L）上培养两天。挑选阳性克隆，以GmFT2a-F和GmFT2a-His-R为引物做菌落PCR鉴定，结果扩增出大小约为568bp的目标条带的为阳性重组菌，命名为EHA101/pTF101.1-GmFT2a-His。6.3.1.2用pTF101.1-GmFT2a-His重组载体转化大豆植株通过根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系，用EHA101/pTF101.1-GmFT2a-His侵染大豆品种William82和自贡冬豆，共获得6株再生苗。将再生104 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析苗移栽入营养土中，待长势良好后，用160mg/L的草丁膦涂抹植株叶片，筛选转基因阳性植株。所有再生苗中，只有4个植株的叶片经草丁膦涂抹后未变为黄色（图6.6），对照与其他2株叶片涂抹后变黄，证明筛选得到了4株有除草剂抗性的阳性转基因植株，命名为T0-1、T0-2、T0-3和T0-4。T0-1、T0-2和T0-3为William82品种，T0-4为自贡冬豆品种。CKT0-1T0-2T0-4T0-3图6.6T0代转基因植株的草丁膦涂抹鉴定Fig.6.6IdentificationtheT0generationoftransgenicplantsbyglufosinateapplication6.3.1.3GmFT2a-His转基因大豆T0代的分子鉴定为进一步确认T0-1、T0-2、T0-3和T0-4转基因植株是否转入了外源基因，我们进行了一系列分子鉴定，鉴定结果如下：首先对T0代转基因植株在DNA水平进行鉴定，检测了Bar基因和35S:GmFT2a-His基因。T0-1、T0-2、T0-3和T0-4转基因植株中都检测到了Bar基因；但T0-3中的条带较弱，不能确定Bar基因的存在；T0-1、T0-2和T0-4植株中可以确定存在Bar基因（图6.7）。105 吉林大学博士学位论文图6.7T0代转基因植株的Bar基因检测M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；T0-1、T0-2、T0-3和T0-4：四个转基因因T0代植株；WT:非转基因大豆植株；-：阴性对照（模板为水）Fig.6.7DetectionofBargeneintheT0generationoftransgenicplantsM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);T0-1,T0-2,T0-3andT0-4:T0generationoftransgenicplants;WT:non-transgenicsoybeancv.Williams82;-:NegativecontrolT0-1、T0-2、T0-3和T0-4转基因植株中都检测到了35S:GmFT2a-His基因；但T0-3中的条带较弱，T0-4中出现了非特异带，不能确定Bar基因的存在；T0-1和T0-2植株中可以确定35S:GmFT2a-His基因的存在（图6.8）。图6.8T0代转基因植株的35S:GmFT2a-His基因检测M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；T0-1、T0-2、T0-3和T0-4：四个转基因因T0代植株；WT:非转基因大豆植株；-：阴性对照（模板为水）Fig.6.8Detectionof35S:GmFT2a-HisgeneintheT0generationoftransgenicplantsM:Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus);T0-1,T0-2,T0-3andT0-4:T0generationoftransgenicplants;WT:non-transgenicsoybeancv.Williams82;-:Negativecontrol106 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析进一步的，对T0代转基因植株中GmFT2a-His和GmFT2a基因的表达进行了检测。在对GmFT2a-His基因表达的检测中发现，只有T0-1和T0-2转基因植株中能够检测到GmFT2a-His基因的表达，且表达量较高；T0-2转基因植株中GmFT2a-His基因的表达量最高；T0-3和T0-4转基因植株以及非转基因大豆植株中均未检测到GmFT2a-His基因的表达（图6.9）。相对表达量图6.9T0代转基因植株中GmFT2a-His基因的表达CK：非转基因植株；T0-1、T0-2、T0-3和T0-4：转基因T0代植株；基因的表达量是以GmG6PDH(GenBank注册号：XM_003547631)为内参基因的相对表达量，数据为三次独立实验结果的mean±SDFig.6.9ExpressionanalysisofGmFT2a-HisgeneintheT0generationoftransgenicplantsCK:non-transgenicplants;T0-1,T0-2,T0-3andT0-4:T0generationoftransgenicplants;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631).;Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments在对GmFT2a基因表达的检测中发现，GmFT2a基因在T0-1、T0-2、T0-3和T0-4转基因植株中都有表达，但表达量差异很大（图6.10）：T0-1表达量最高，其次是T0-2，二者的表达量都显著高于野生型；由于T0-4开花较晚，与T0-1、107 吉林大学博士学位论文T0-2和T0-3同期取样时T0-4还处于营养生长状态，此时T0-4中GmFT2a基因的表达量很低，甚至低于非转基因对照植株，T0-4开花状态下（T0-4f）的GmFT2a基因表达量比之前有所提高，但也略低于T0-2植株；T0-3转基因植株中的GmFT2a基因的表达量低于对照。相对表达量图6.10T0代转基因植株中GmFT2a基因的表达CK：非转基因植株；T0-1、T0-2、T0-3和T0-4f为开花时期取得的样品；T0-4为营养生长状态下取得的样品。表达量为以GmG6PDH(GenBank注册号：XM_003547631)作为内参基因的相对表达量，数据为三次独立实验结果的mean±SD.Fig.6.10ExpressionanalysisofGmFT2ageneintheT0generationoftransgenicplantsCK:non-transgenicplants;ThesamplesofT0-1,T0-2,T0-3andT0-4faretargetattheanthesis;ThesampleofT0-4aregetinthevegetativestage;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments108 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析6.3.1.4GmFT2a-His转基因大豆T0代的开花表型分析将初步确定的阳性转基因植株置于25°C，16小时光照的长日条件下培养，观察其开花表型。T0-1、T0-2和T0-3转基因植株开花较早，在只有2-3片展开的三出复叶时就出现花朵；T0-4植株则保持营养生长状态（图6.11）。栽培62天后（2013年3月23日），T0-1、T0-2和T0-3植株产生大量的花和荚，而T0-4植株仍保持营养生长状态（图6.9）。T0-2植株开花结荚最早，且花荚数量最多。T0-1T0-2T0-3T0-4图6.11T0代转基因大豆植株初花期表型图片拍摄时间为2013年1月21日Fig.6.11ThephenotypeoftheT0generationoftransgenicplantsatthebeginningoffloweringThephotosaretakeninJanuary21stin20136.3.1.5GmFT2a-His转基因大豆T1代的检测T0-4转基因植株由于开花期延迟，未能进行T1代的繁殖。T0-1、T0-2和109 吉林大学博士学位论文T0-3转基因植株的种子在室外盆栽播种，对T代植株叶片进行160mg/L的草丁膦涂抹鉴定后发现，T0-1和T0-3的后代植株全部鉴定为阴性、只有T0-2的大部分后代植株鉴定为阳性（图6.12）。T0-1和T0-3转基因植株没有将转入的外源基因遗传给后代。我们只获得了传自T0-2植株的T1代转基因植株T1-2。T1-2-1CK图6.12T1-2-1的草丁膦涂抹鉴定Fig.6.12IdentificationtheT1generationoftransgenicplantsbyglufosinateapplication对T1-2各植株进行DNA验证，检测了GmFT2a-His基因。PCR结果（图6.13）显示，在检测的20株T1-2植株中，65%的植株显示明亮的目的条带，另有4株条带较弱。表明大部分T1-2植株获中存在GmFT2a-His基因，为T1代阳性转基因植株。图6.13T1-2转基因植株的DNA验证M：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1:T1-2-1；2:T1-2-2；3:T1-2-3；4:T1-2-4；5:T1-2-5；6:T1-2-6；7:T1-2-78:T1-2-8；9:T1-2-9；10:T1-2-10；11:T1-2-11；12:T1-2-12；13:T1-2-1314:T1-2-14；15:T1-2-15；16:T1-2-16；17:T1-2-17；18:T1-2-18；19:T1-2-1920:T1-2-20；CK1:T1-1-20；CK2:T1-3-20；WT：非转基因植株；-：阴性对照（模板为水）Fig.6.13DetectionofGmFT2a-HisgeneintheDNAofT1generationoftransgenicplantsM：Direct-load™StarMarkerPlus(D2000Plus)；1:T1-2-1；2:T1-2-2；3:T1-2-3；110 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析4:T1-2-4；5:T1-2-5；6:T1-2-6；7:T1-2-78:T1-2-8；9:T1-2-9；10:T1-2-10；11:T1-2-11；12:T1-2-12；13:T1-2-1314:T1-2-14；15:T1-2-15；16:T1-2-16；17:T1-2-17；18:T1-2-18；19:T1-2-1920:T1-2-20；CK1:T1-1-20；CK2:T1-3-20；WT:non-transgenicsoybeancv.Williams82;-:Negativecontrol另外，对T1-2各植株中GmFT2a-His基因的表达情况进行了检测。所选取的T1-2植株中都检测到了GmFT2a-His基因的表达，而非转基因对照和阴性转基因植株中却没有；T1-2各植株的GmFT2a-His基因表达量存在差异（图6.14）。(GmFT2a-His/G6DPH2相对表达，Mean量±SE)图6.14T1-2转基因植株中GmFT2a-His基因的表达WT：非转基因植株；表达量为以GmG6PDH(GenBank注册号：XM_003547631)作为内参基因的相对表达量，数据为三次独立实验结果的mean±SDFig.6.14ScreeningoftheexpressionofGmFT2a-HisgeneintheT1generationoftransgenicplantsWT:non-transgenicsoybeancv.Williams82;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments.111 吉林大学博士学位论文6.3.1.6GmFT2a-His转基因大豆T1代的开花表型我们关注了T1-2转基因植株的开花表型，发现其并没有表现出明显的早花表型。进一步的，我们对T1-2从出苗到出现第一朵花的时间进行了统计，与非转基因William82品种进行比较（图6.15），发现T1-2转基因植株的开花时间与非转基因植株相差不大，没有出现早花表型。虽然以上的分子检测证明了T1-2为GmFT2a-His转基因植株，且GmFT2a-His基因的表达量也很高，但T1-2并未与T0-2一样，出现早花表型。图6.15T1-2转基因植株的开花时间统计WT：非转基因William82；T1-2：GmFT2a-His转基因大豆T1代植株Fig.6.15analysisofthetimeofT1-2transgenicplantsfromgerminationtoflowerWT:non-transgenicsoybeancv.Williams82;T1-2:T1generationofGmFT2a-Histransgenicsoybeancv.Williams826.3.2GmBRI1和4个GmCPD同源基因在转基因植株中的表达研究显示，bri和cpd突变体植株都出现了不同程度的开花延迟现象。并且，BRI1基因对开花时间的调控是通过控制与FLC基因的表达实现的[80]，CPD基因调控开花时间与生物钟基因有关[83]，这两种开花途径关键基因都是FT基因的上游。FT作为开花途径信号分子整合的关键基因，发挥了连接光周期途径、赤霉素途径和春化途径并起始成花转换的作用。因此，我们希望通过在大豆中探讨GmFT2a基因过表达或抑制其表达是否会改变油菜素内酯相关途径基因的表112 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析达模式，以探索油菜素内酯途径与开花途径的可能关联。因此，在构建并鉴定确认的GmFT2a-His转基因植株T0-2及其T1代转基因植株T1-2-20中验证油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPDs的表达情况，探索GmBRI1和4个GmCPD同源基因与开花关键基因GmFT2a的关系。6.3.2.1T0-2转基因植株中的表达以上的表型鉴定和分子鉴定结果表明，T0-2是一株GmFT2a-His基因过表达的具有早花表型的转基因植株，其GmFT2a-His基因和GmFT2a基因的的表达量都很高（图6.8、图6.9、图6.10）。我们检测了T0-2植株中GmBRI1和四个GmCPD同源基因的表达（图6.16），发现这5个油菜素内酯途径相关基因在T0-2植株中都表达上调。但GmBRI1基因在非转基因对照植株和T0-2植株中的表达量都很低；GmCPD2基因在T0-2中的表达量最高，与对照植株的表达量差异也最显著；GmCPD1和GmCPD4基因也在T0-2植株中有较高水平的表达，与非转基因植株的表达量有明显差异；GmCPD3基因在T0-2中的表达量是4个GmCPD同源基因中最低的。113 吉林大学博士学位论文((GmFT2aGmFT2a--His/G6DPH2His/G6DPH2相相对对表表达达，Mean量，Mean量±±SESE))((GmGmFT2aFT2a--His/G6DPH2His/G6DPH2相相对对表表达达，Mean量，Mean量±±SESE))((GmFT2aGmFT2a--His/G6DPH2His/G6DPH2相相对对表表达达，Mean量，Mean量±±SESE))图6.16T0-2转基因植株中的GmFT2a、GmBRI1和GmCPD基因表达的qPCR结果CK：非转基因植株；表达量为以GmG6PDH(GenBank注册号：XM_003547631)作为内参基因的相对表达量，数据为三次独立实验结果的mean±SDFig.6.16qRT-PCRanalysisofGmFT2a,GmBRIandGmCPDmRNAintheT0-2transgenicplantCK:non-transgenicplant;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments114 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析对比以上基因表达结果可以发现，GmBRI1和GmCPD基因的表达模式与GmFT2a的基本相同，与GmFT2a的表达呈正相关。虽然5个基因之间的表达量差别很大，但在GmFT2a过表达且早花的背景下都出现表达上调的情况。6.3.2.2T1-2-20转基因植株中的表达在我们获得的T1代转基因植株中，T1-2-20是其中GmFT2a-His表达量都较高的（图6.14），但T1-2系所有的植株都没有出现早花表型，开花时间与非转基因William82品种相差不大（图6.15）。T1-2-20植株是一株GmFT2a基因表达量很高但花期不变的转基因T1代植株。我们以此为研究对象，探讨在开花期不受影响，单纯提高GmFT2a基因表达量的背景下GmBRI1和四个GmCPD同源基因的表达情况。我们发现了与在T0-2植株中相似的表达趋势（6.17），5个油菜素内酯途径相关基因在T1-2-20植株中都表达上调；非转基因对照植株和T1-2-20植株中GmBRI1基因的表达量都很低；4个GmCPD同源基因中，GmCPD2基因在T1-2-20中的表达量最高，GmCPD3基因的表达量最低，GmCPD1和GmCPD4基因也在T1-2-20植株中有较高水平的表达。115 吉林大学博士学位论文((GmFT2aGmFT2a--His/G6DPH2His/G6DPH2相相对对表表达达，Mean量，Mean量±±SESE))((GmFT2aGmFT2a--His/G6DPH2His/G6相相对对表DPH2表达达，Mean量，Mean量±±SESE))((GmFT2aGmFT2a--His/G6DPH2His/G6DPH2相相对对表表达达，Mean量，Mean量±±SESE))图6.17T1-2-20转基因植株中的GmFT2a、GmBRI1和GmCPD基因表达的qPCR结果CK：非转基因植株；表达量为以GmG6PDH(GenBank注册号：XM_003547631)作为内参基因的相对表达量，数据为三次独立实验结果的mean±SDFig.6.17qRT-PCRanalysisofGmFT2a,GmBRIandGmCPDmRNAintheT1-2-20transgenicplantCK:non-transgenicplant;TherelativeexpressionlevelsarenormalizedtoGmG6PDH(GenBankaccessionNo.XM_003547631);Thedatarepresentthemean±SDofthreeindependentexperiments116 第6章GmBRI1和4个GmCPD同源基因在GmFT2a转基因大豆中的表达分析虽然GmBRI1和四个GmCPD同源基因在T1-2-10中的表达趋势与T0-2中相同，但在T1-2-20中的表达量普遍低于T0-2，且T1-2-20和非转基因植株之间的表达量差异不如T0-2与对照之间的显著。另外，与T0-2情况相同的，T1-2-20中GmBRI1和GmCPD基因的表达趋势与GmFT2a的基本相同。因为此实验中的叶片样品都是在转基因植株的营养生长阶段取得，所以在诱导开花阶段GmBRI1和GmCPD基因与GmFT2a基因表现出的基因表达正相关性可能预示前者参与开花诱导并与GmFT2a相关联。6.4讨论在我们获得的4株转GmFT2a-His基因T0代阳性植株T0-1、T0-2、T0-3和T0-4中，T0-1和T0-3植株没能将转入的外源基因遗传给后代，可能因为基因在遗传过程中丢失或T0代植株本身为嵌合体。T0-2植株将外源基因进行了有效的遗传，获得大量T1-2阳性转基因植株。但T1-2植株并未出现与T0-2相同的早花表型。William82品种在短日处理下大约35天出现7-8个三出复叶的情况下能够开花，而T0-2在仅有两个复叶的情况下就已经开花，T1-2植株却与非转基因植株的开花时间相同。产生这种状况的原因可能是在遗传过程中转基因片段的拷贝有所丢失，GmFT2a基因的表达量不足以促进生育期较早的William82品种出现明显的早花表型，或者GmFT2a蛋白的功能受抑。T0-4植株虽然跟其他三个T0代植株一样转入了GmFT2a-His基因，但却未表现开花表型且只能检测到GmFT2a-His基因的插入但未能检测到其表达，这可能是转入基因被沉默导致的。GmFT2a基因是各开花途径的整合点，又是连接环境信号感应阶段和成花启动阶段的纽带，在大豆中过表达GmFT2a基因能够强烈促进大豆植株早花[138]。因此探讨油菜素内酯相关基因与GmFT2a基因的关系具有非常重大的意义。在GmFT2a过表达的转基因植株中，GmBRI1和4个GmCPD基因都与GmFT2a基因的表达呈正相关，表明GmBRI1和4个GmCPD基因的表达与GmFT2a基因相关。目前的研究显示BR对开花时间的调控是因为BRI1基因可以通过控制FLC基因的表达调控开花时间[80]，CPD基因与生物钟基因CCA1等的相互作用能够对开花时间产生影响[83]。FLC与生物钟基因都是GmFT2a基因的上游调控因子，117 吉林大学博士学位论文此实验结果表明油菜素内酯途径与开花途径的相关性不只局限于GmFT2a上游。6.5小结本实验构建了pTF101.1-GmFT2a-His重组载体，通过根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系获得了转基因再生植株。经草丁膦涂抹实验筛选出4株T0代转基因阳性植株：T0-1、T0-2、T0-3和T0-4。对4株转基因植株的开花表型进行了鉴定，发现T0-1、T0-2和T0-3在长日条件下开花提早，而T0-4开花延迟。分子鉴定结果显示，在4株阳性植株中都能够检测到Bar基因和GmFT2a-His基因；但T0-3中两基因的检测条带较弱；T0-4中GmFT2a-His基因检测到非特异性条带；只有T0-1、T0-2中能够检测到GmFT2a-His基因的表达，T0-3、T0-4中未能检测到GmFT2a-His基因的表达。通过以上一系列的检测，可以确认T0-1、T0-2为T0代GmFT2a-His转基因植株；T0-3不能被确定为T0代GmFT2a-His转基因植株；T0-4能够确定外源载体片段插入到了基因组，但目的基因的表达被沉默。T0-2转基因植株能够将转入的外源基因遗传给后代，因此获得了T1代转基因植株系T1-2。对T1-2的分子鉴定表明各株系都插入了外源的GmFT2a-His基因并能够稳定表达。但是T1-2的开花期没有改变。我们在GmFT2a-His转基因植株中对油菜素内酯相关基因GmBRI1、GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4的表达情况进行了检测。在GmFT2a过表达而开花提前的T0-2转基因植株和GmFT2a过表达而花期不改变的T1-2-20植株中，GmBRI1和4个GmCPD基因的表达都与GmFT2a基因的表达呈正相关，说明GmBRI1和4个GmCPD基因的表达变化与GmFT2a基因的表达存在密切联系。118 结论结论1.在大豆中克隆得到油菜素内酯受体蛋白基因GmBRI1并进行了生物信息学分析，发现与AtBRI1在序列和结构域上都有很强的保守性。将GmBRI1基因转入油菜素内酯不敏感突变体bri1-5中可以恢复突变体的表型。且这种恢复是由于GmBRI1基因修复了bri1-5突变体的BR信号转导通路。从而确认我们克隆得到了有功能的GmBRI1基因，且与AtBRI1基因功能相似。2.在大豆中克隆得到了4个油菜素内酯P450单加氧合成酶基因GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4并进行了生物信息学分析。4个GmCPD与AtCPD在序列和结构域上都有较高的同源性。将4个GmCPD基因分别转入油菜素内酯合成突变体cpd-91中都能恢复后者的表型。且这种恢复是由于4个GmCPD基因修复了突变体BR合成路径，恢复了内源BR的水平。证明我们克隆得到了4个有功能的GmCPD基因，且其在植株形态建成，根发育和果荚大小的调控中发挥重要作用。3.组织特异性表达结果显示，GmBRI1基因主要在下胚轴和子叶这些细胞生长和分裂旺盛的部位表达；GmCPD1、GmCPD2和GmCPD4基因主要在大豆子叶和叶片中表达，这与拟南芥研究中的报道相符；GmCPD3基因各组织表达量较低，主要在幼嫩果荚中表达，可能参与果荚的发育与成熟。4.在有外源BR存在的情况下，GmBRI1和4个GmCPD基因都有快速而强烈的响应，GmBRI1基因表达上调而4个GmCPD基因都表达下调。5.在拟南芥和大豆中探讨了油菜素内酯相关基因GmBRI1和GmCPD与开花的关系：GmCPD基因在CPD缺失突变体中表达能够恢复后者的晚花表型，表明CPD基因在植物的开花过程中起到重要作用。在大豆开花逆转系统中，大豆自贡冬豆品种短日诱导13天移到长日条件下就可发生开花逆转。而GmBRI1和4个GmCPD基因都在短日诱导第13天出现表达高峰，此时正是茎尖分生组织花原基分化的起始。在光周期敏感性不同的大豆品种中，GmBRI1和4个GmCPD基因在光周期不敏感的早熟品种黑河27的叶片和子叶中的表达量明显高于光周期敏感的晚熟品种自贡冬豆，尤其是在生长发育的早期阶段。以上实验119 吉林大学博士学位论文结果表明GmBRI1和4个GmCPD基因与成花转换存在密切关系。6.获得了GmFT2a转基因植株并进行了分子鉴定。在GmFT2a转基因植株中对GmBRI1和4个GmCPD基因表达的分析结果表明，GmBRI1和4个GmCPD基因在T0-2和T1-2植株中的表达趋势都与GmFT2a基因呈正相关。说明此5个油菜素内酯相关基因与GmFT2a基因有所关联。120 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附录附录1.LB培养基配方酵母提取物5g/L蛋白胨5g/LNaCl10g/L2.YEP培养基配方酵母提取物5g/L蛋白胨5g/LNaCl5g/L3.Murashige&Skoog（MS）培养基配方大量元素微量元素NH4NO31,650mg/LH3BO36.2mg/LCaCl2▪H2O440mg/LCoCl2▪6H2O0.025mg/LMgSO4▪7H2O370mg/LCuSO4▪5H2O0.025mg/LKH2PO4170mg/LFeSO4▪7H2O27.8mg/LKNO31,900mg/LMnSO4▪4H2O22.3mg/LKI0.83mg/LNa2MoO4▪2H2O0.25mg/LZnSO4▪7H2O8.6mg/LNa2EDTA▪2H2O37.2mg/L4.GamborgB5（B5）培养基配方大量元素微量元素(NH4)2SO4134mg/LH3BO33.0mg/LCaCl2▪H2O150mg/LCoCl2▪6H2O0.025mg/LMgSO4▪7H2O246mg/LCuSO4▪5H2O0.025mg/LKNO32,528mg/LFeSO4▪7H2O27.8mg/LMnSO4▪H2O10mg/LKI0.75mg/LNa2MoO4▪2H2O0.25mg/LNaH2PO4▪H2O150mg/LZnSO4▪7H2O2.0mg/LNa2EDTA▪2H2O37.2mg/L133 吉林大学博士学位论文5.大豆组培相关培养基配方基础成分有机添加剂发芽培养基B53.21g/LSucrose20g/LAgar7g/LMES0.6g/LpH5.8共培养培养基1/10B50.321g/LBAP1.6mg/LSucrose30g/LGA30.25mg/LAgar8.3g/LDTT150mg/LMES0.6g/LAS0.04mg/LpH5.4Cys400mg/L农杆菌重悬液1/10B50.321g/LBAP1.6mg/LSucrose30g/LGA30.25mg/LMES0.6g/LAS0.04mg/LpH5.4芽诱导培养基B53.21g/LBAP1.6mg/LSucrose30g/LCefotaxime200mg/LAgar8.3g/LTimentin50mg/LMES0.6g/LpH5.7芽筛选培养基B53.21g/LBAP1.6mg/LSucrose30g/LCefotaxime200mg/LAgar8.3g/LTimentin50mg/LMES0.6g/LBasta6mg/LpH5.7伸长培养基MS4.33g/LCefotaxime200mg/LSucrose30g/LTimentin50mg/LAgar8.3g/LGA30.5mg/LMES0.6g/LGlu30mg/LpH5.7Asp30mg/LIAA0.3mg/LZeatin-R1mg/LBasta3mg/L生根培养基MS4.33g/LIBA0.5mg/LSucrose30g/LGlu30mg/LAgar8.3g/LAsp30mg/LMES0.6g/LPH5.7134 附录6.Hoagland营养液配方，大量元素Ca(NO3)2·4H2O1.18g/LKNO30.51g/LMgSO4·7H2O0.49g/LKH2PO40.14g/L微量元素H3BO32.86mg/LMnCl2·4H2O1.81mg/LZnSO4·7H2O0.22mg/LCuSO4·5H2O0.08mg/LH2MoO4·H2O/Na2MoO4·2H2O0.02/0.03mg/L微铁盐溶液FeSO4·7H2O5.56mg/LEDTA-Na27.46g/L135 吉林大学博士学位论文作者简介及科研成果王妙，女，1987年7月生，汉族，山东省德州市人。2005年考入山东农业大学生物科学专业，2009年获理学学士学位。2009-2014年为吉林大学硕博连读研究生，攻读植物学博士学位，师从王庆钰教授，研究方向为植物种质资源与利用。攻读博士学位期间，一直在中国农业科学院作物科学研究所进行植物分子生物学方向的研究，师从韩天富研究员。研究生阶段，公开发表学术论文5篇，其中2篇被SCI收录；同时申请国家发明专利5项。攻读博士学位期间取得的研究成果论文：1.MiaoWang,ShiSun,CunxiangWu,TianfuHan,andQingyuWang.IsolationandCharacterizationoftheBrassinosteroidReceptorGene(GmBRI1)fromGlycinemax.InternationalJournalofMolecularSciences.2014,15,3871-3888;doi:10.3390/ijms150338712.MiaoWang,XinXu,XinxinZhang,ShiSun,CunxiangWu,WenshengHou,QingyuWangandTianfuHan.FunctionalAnalysisofGmCPDsandInvestigationofTheirRolesinFlowering.PLOSONE.2015,10(3):e0118476.DOI:10.13713.贾贞，吴存祥，王妙，孙洪波，侯文胜，蒋炳军，韩天富.大豆嫁接体系中砧木或接穗保留叶片数对接穗生长发育的影响.作物学报.2011(4):650-660.4.李继存，黄新阳，王妙，孙石.大豆杂交中伪杂种产生的原因分析.大豆科学.2012(3):492-494.5.王妙，杨作仁，杨贵莉，许国超，叶宝兴.高产小麦旗叶细胞结构与产量关系的研究.生物技术通报.2009(S1):139-142.专利：1.王妙，韩天富，王庆钰，孙石，吴存祥，蒋炳军，侯文胜.GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用.专利申请号：201410005260.82.王妙，韩天富，蒋炳军，许鑫，侯文胜，孙石，吴存祥.生长相关蛋白GRP1在调控植物生长中的应用3.王妙，韩天富，吴存祥，张鑫鑫，蒋炳军，侯文胜，孙石.生长相关蛋白GRP2在调控植物生长中的应用4.王妙，韩天富，孙石，武婷婷，吴存祥，蒋炳军，侯文胜.生长相关蛋白GRP3在调控植物生长中的应用5.王妙，韩天富，侯文胜，陈莉，孙石，吴存祥，蒋炳军.生长相关蛋白GRP4在调控植物生长中的应用136 致谢致谢二零零九年春天，当时的我还是一个大四学生，机缘巧合之下，来到中国农业科学院作物科学研究所进行毕业实习，开启了我的科研追梦之路。在这里，结识了我一生的良师益友，韩天富研究员。在韩老师的推荐下，我认识了我的又一位恩师——王庆钰教授，并有幸进入吉林大学进行深造，攻读博士学位。在吉林大学美丽的校园里，留下了我一生中最快乐的学习时光。王庆钰老师如同母亲般亲切和蔼的教诲和对我生活上无微不至的关怀，让我在离家千里之外依然体会着母爱的温暖。导师渊博的知识、严谨的治学态度、谦虚的品德、宽广的胸怀和对科研事业的执著，是我永远学习的楷模，是我一生取之不竭用之不尽的精神财富。感谢王老师多年来对我的教导以及始终不移的对我科研能力的信任。如果说吉林大学给了我丰富的知识储备，那么中国农业科学院给予我的正是施展知识的平台。本研究是在中国农业科学院作物科学研究所农业部北京大豆生物学重点实验室完成，得到国家大豆产业技术体系建设专项（CARS-04）和中国农业科学院科技创新工程的资助。韩天富老师手把手的带我走进了科学研究的神秘殿堂。他宽容、真诚的待人方式，执着、投入的工作精神，严谨、朴实的治学态度，令我感动至深。永远铭记和韩老师无数次关于我研究课题及发表文章的讨论，每一次和他的亲切交谈都会让我从实验和论文的沮丧心情中重拾信心。本研究自始至终是在两位导师的悉心指导下完成的，从课题的选题、设计、实施到论文的撰写和修改，整个过程都倾注了两位导师的大量心血。在论文完成之际，向我两位尊敬的导师，王庆钰教授和韩天富研究员，致以崇高的敬意和衷心的感谢！今后不论身处何方，导师的恩情，我将永记心间，成为我前进的源泉和动力。怀着一颗感恩的心，去努力学习和工作，作为对恩师的报答。寒窗五六载，难以忘怀，昔日的苦读及在实验室度过的每一通宵达旦的夜晚都历历在目。在此，感谢吴存祥研究员、侯文胜研究员、孙石副研究员及蒋炳军副研究员为我论文顺利完成提供的大量指导和技术支持，你们无私的奉献和启发性的交谈让我获益匪浅，在此我表示衷心的感谢！137 吉林大学博士学位论文衷心感谢吉林大学潘洪玉教授、张世宏教授、袁亚萍教授、杨振明教授对我的悉心教导；感谢王英老师、许矛老师、苏胜忠老师给予我生活及研究上的指导和无私帮助。感谢我在吉大的兄弟姐妹们，闫帆、陈虹地、刘蓓蓓、高洁、姬长媛、刘德泉、柳青、郎宸用、李晓薇、翟莹、赵建茹、李艳杰、张桂珍、张海军、张庆林，没有你们的关怀和帮助，我不可能顺利完成学业。感谢您们让我在吉林大学度过了最快乐最温暖的时光。感谢中国农业科学院大豆分子育种课题组与我一起探讨实验，一起熬夜，一起拼搏的各位战友们：贾贞博士、简波博士、纳小凡博士、岳岩磊博士、张丹凤博士、刘薇博士、宋雯雯博士、杨光明博士、于洋博士、曹晓宁博士、毛婷婷博士、孙洪波博士后、陈莉博士后、武婷婷博士后、王义鹏硕士、王伟旗硕士、韩祥东硕士、刘旭娇硕士、赵振芳硕士、曲梦楠硕士、韩庆梅硕士、高友菲硕士、马立明硕士、周扬硕士、张鑫鑫硕士、许鑫硕士、陈普硕士、张守伟硕士、蔡宇鹏硕士、刘建巍硕士、江红硕士、洪冰洁硕士以及姚伟伟、陶金璐、吴宝美、周雁峰、曾海燕、李果、刘玲娜、田世燕、刘路平。我永远不会忘记和你们一起工作，一起嬉戏打闹的美好时光，你们使我的博士学习生活变得丰富多彩！每当困顿和迷茫时，都有你们在我身后给予关怀和帮助，你们是我勇往直前的强大动力。最后，我的谢意留给这些年来一直默默支持帮助我工作、生活的男朋友杨作仁。虽然我们两地相隔，但你总能给予我第一时间的帮助和支持，使我心里温暖常在。没有你对我精神上的支持和实验上的帮助就不会有这篇论文的顺利完成。谨以此文献给含辛茹苦养育我成人的父母！对你们的感激无法用简单的文字表达，希望论文的顺利完成能让你们感到欣慰！王妙2015年5月28日138
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