大豆抗病相关基因的克隆研究

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1、东北农业大学博士学位论文大豆抗病相关基因的克隆研究姓名：杨秀红申请学位级别：博士专业：作物遗传育种指导教师：杨庆凯2003.5.1摘要植物抗病基因的克隆研究对于抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。大豆抗病基因的克隆研究一直很滞后，目前尚未有功能性大豆抗病基因被克隆。已克隆的植物抗病基因在氨基酸水平上表现了一定程度的同源性。本论文根据已克隆的植物抗病基因的保守结构域设计简并引物，采用同源性克隆技术对大豆抗病相关基因的克隆进税了研究，为功能性大豆抗病基因的克隆和利用转基因技术提高大豆抗病性奠定了基础}住要研究结果如下

2、：＼1．根据拟南芥RPS2基因、烟草Ⅳ基因和亚麻L6基因的保守结构域设计引物，从大豆抗疫霉根腐病品种绥农lO号的RNA中扩增获得了约100个克隆，从中鉴定了两个通读的且与抗病基因NBS结构域同源的序列RNEAU-1和RNEAU-2，这两个序列长度均为513bp，编码171个氨基酸，编码产物在结构上均具有NBS结构域的P．环，Kinase-2a和Kinase-3a区及保守的疏水结构域HD。序列与结构上的同源性表明RNEAU-1和RNEdu2为大豆抗病基因同源序列。这两个序列己在GenBank中注册，登录号分别为AYl

3、82243和AYl82244。2．在分离大豆抗病基因同源序列的基础上。采用RACE技术获得了全长3574bp的大豆抗病相关基因SRl。该基因包括341lbp的开放读码框，72bp的5q}翻译区(non-translatedregion，NTR)，68bp的3’非翻译区和20bp的多聚腺苷酸尾。在73bp处有ATG起始密码子，在3484bp处有TAA终止密码子，编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列，基因编码产物具有11R、NBS、LRR、HD(conserveddomainI)和conserveddomain2等一系

4、列抗病基因的保守结构。Southern杂交结果表明，SRl基因在大豆中具有2-4个拷贝。RT-PCR技术对该基因的转录表达情况研究表明，SRl基因在大豆中为低丰度组成型表达，其表达不受病原菌接种和水杨酸的诱导，并无组织特异性。初步认为大豆SRl基因为TIR-NBS．LRR类抗病相关基因，在分类上属于第1类植物抗病基因。SR]基因的编码产物为抗病相关蛋白。在结构上与烟草Ⅳ基因具有较高的相似性。目前SRl基因已在GenBank上注册，登录号为AYl93892。3．在SRl基因两端设计引物，对绥农10号基因组进行了扩增，

5、经测序获得3972bp的DNA序列SR2。序列比对显示SR2基因含5个外显子和4个内含子，其外显子与内含子连接区与经典剪接序列GT／AG基本吻合。5个外显子长度分别为478bp、1106bp、290bp、793bp和779bp，4个内含子长度分别长195bp、156bp、87bp和88bp。与SRlcDNA序列相比对，该序列多出了4个内含子，除此之外与SRl序列相同。4．在SRI基因两端设计引物，对另外5个抗病大豆品种东农163、东农9674、东农43、东农93046和绥农8号及一个感病品种合丰25的基因组进行了扩

6、增，抗病品种中除东农93046外均获得两个扩增产物。其中一介大小约3．9kb。另一个约3．5kb。感病品种合丰25中获得了大约3．5kb的扩增产物。、y关键词大豆；抗病相关基因：克隆：cDNA雉亟亟；墓i遵＼J、———d-U-CloningandCharacterizationofSoybeanResistance—relatedgeneAbstractIsolationofplantresistanceganeisgreatlyhelpfultocropresistancebreedingandtheinsigh

7、tofresistancemechanism．Nofunctionalresistancegenehasbeenseparatedfromsoybeanatpresent．Sequencesofclonedresistancegenesfromawiderangeofplantrevealsignificantsimilaritiesinaminoacidsequence．Inthisstudy,weclonedaresistance-relatedgenefromsoybeanwithhomology-based

8、candidategenemethodusedthedegenerateoligonucleotideprimerswhichweredesignedwiththeconserveds眦tIlresofclonedresistancegenes．Ourstudybecamethebasisofthesoybeanfunctionalresistancegen