大豆开花基因gmgal1之克隆及表达研究及水稻干旱表达基因启动子之克隆和研究

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　　大豆开花基因GmGAL1之克隆及表达研究及水稻干旱表达基因启动子之克隆和研究第一章大豆开花基因GmGALl的克隆和表达分析1.前言开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的一个重要的生理过程，正确的开花时间是生殖发育的重要前提保障。正因为如此，植物已经进化出复杂的、精心调控的机制来保证植物在最佳时间开花。经过对拟南芥几十年的研究，已发现植物开花控制途径共有四条：环境因子作用的光周期途径（PhotoperiodicpathouspathpsonandDean,2002;SungandAmasino,2004)。这四条途径交叉互作，形成复杂的分子网络。1.1.1光周期途径拟南芥在长日条件下的幵花时间要比短日条件下早的多。这种现象表明拟南芥中有一些基因参与了光信号的识别。拟南芥中的光受体主要有五种光敏色素(PflYAtoPHYE)和两种隐花色素CRY2)组成(ThomasandVince-Pme，1997)。研究表明P//Ky能够识别红光和远红光(Briggsetal,2001;Quailetal,1994)；和识别蓝光和UV-A(AhmadandCashmore,1993;Briggsetal,2001;Linetal,1998)。只有p//yA、和C7?r2开始接受光信号，光周期途径信号才能进入昼夜节律循环过程。当夜长达到一个决定性的长度，下游基因才能被激活(LevyandDean,1998)。位于光受体下游的基因，GI(GIGANTEA)和09(CONSTANS)是研究相对详尽的两个基因。如果这两个基因发生突变，那么在长日条件下会出现晚花，而在短日条件下对幵花的影响甚小。CO可能是尸//K?和的最重要的靴基因(Putterilletal，1995)，在光周期过程中被精确调控。研究表明COmRNA的昼夜节律对通过光周期途径调节的开花过程至关重要(Valverdeetal,2004)，然而通过CO的幵花激活过程确实是一个剂量依赖的过程(Putterilletal，1995)。另一方面，G/编码含有六个跨膜结构域的定位于膜上的蛋白，其表达同样受昼夜节律调节。也就是G7对维持接夜节律具有重要作用。另外两个生物钟基因ZJ/r和CCAi在g冲表达量很低(Foasino,1999)。通过组织特异性启动子启动fXC的表达证实如果完全抑制幵花，需要FLC在叶和莲顶端分生组织中都表达(Searleetal,2006)春花作用能够使FLCmRNA的丰度降低，然而由于其它一些FLC不依赖的春化途径能够调节AGL24和AGZJ9，所以FLC基因不是春化反应的必要条件(Michaelsetal,2003;Schonrock etal,2006)。FRI是FZr基因的正调控因子，其螺旋-螺旋结构域可能就是起调节作用的组成部分。的突变对于显性的F等位基因起上位作用，FZC在FRI缺失突变体中过表达表现出晚花表型(Michaelsetal.,1999)1.1.3自主途径植物经过外界环境因素和内部自身发育机制的调节，自会幵花，称为自主途径。LD,FVE，FY和FCA基因的突变会使植物在长日和短日条件下均晚花，因而它们是位于自主途径的基因。LD基因编码953个氨基酸，其中含有两个双向的核定位基序，其蛋白含有谷氨酸富集结构域，与其它物种中的特定转录因子是直向同源序列。基因也可能参与了光质的识别，因其突变体对光中高频红光和远红光不敏感(Leeetal，1994)。FCA蛋白包括两个RNA识别基序和一个acknightetal，1997)。通过选择性剪切来调节自身表达，能够产生a，|3，丫和S四种变体，但是只有yhiRNA编码有功能的FCA蛋白，且只有组成型表达的丫mRNA才能导致转基因植物早花，这也能说明ymRNA的重要性(Macknightetal,2002)。FVE是一个推测retinoblastoma相关蛋白，是组蛋白去乙酰化蛋白复合体中的一部分，能抑制FLC的表达。此外/T，FPA也能抑制FLC基因，通过这些来保证植物从营养生长向幵花转变(Schomburgetal,2001;Yushibumi,2004)。2.材料2.1植物材料及取材GmGALl基因的克隆，是根据同源克隆思维，参考拟南芥光周期主要基因的mRNA序列，利用GENBANK、TAIR等网上资源，通过EST查询得到大豆中这些基因的一段序列，以此段序列为基础通过3',5'RACE方法扩出其余序列部分，方法见Invitrogen和TAKARA的3',5'RACE试剂盒（许娇丼博士完成）。考虑一些基因受光周期和生物钟调控，以上周期性光照条件分为短日（8h光照A6h黑暗）和长日（16h光照/8h黑暗），并以多个时间点取材：（1)短日。采集时间为：8:30、10:30、12:30、14:30、16:30、18:30、20:30、22:30、00:30、2:30、4:30、6:30(8:00?16:00为光照时段）；（2)长日。采集时间为：8:30、10:30、12:30、14:30、16:30、18:30、20:30、22:30、00:30、2:30、4:30、6:30(8:00-0:00 为光照时段）。短日和长日均取样三天。组织器官的取材是在短日条件下，在相应时期分别取样，包括根、单叶、复叶、莲尖、花、荚等。拟南芥材料种植于温室中，恒温22°C，长日光周期为16h光照/8h黑暗，短日为81i光照/16h黑暗。2.材料......................19-212.1植物材料及取材......................192.2RNA提取......................192.3RT-PCR和Q-PCR......................19-202.4载体构建和植物转化......................202.5原生质体转化和亚细胞定位......................202.6进化树分析......................20-213.大豆开花基因克隆结果与序列分析......................21-273.1大豆GmGAL1基因的蛋白质结构......................21-223.2GmGAL1基因的多序列分析......................22-233.3大豆中GmGAL1基因的表达规律......................23-243.4GmGAL1基因的昼夜节律......................24-253.5GmGAL1基因过表达载体构建......................25-263.6GmGAL1基因在细胞中的定位......................26-274.讨论......................27-29结论1、GmGALl基因随着大豆的生长发育表达量迅速升高，在开花期前的叶片中表达量最高；开花时的花中基本无表达，但在荚中仍检测到表达。GmGALl呈现明显的昼夜节律现象，且在连续光照下峰值出现的时间提前。2、过表达GmGALl的拟南芥在长日条件下提早开花，socl突变体中过表达GmGALl能在一定程度上恢复晚花表型。GmGALl定位细胞质中。考文献1AhmadMCashmoreAR.1993.HY4geneofA,thalianaencodesajygclingofdevelopmentaltransitionsinplants.Cell125:655-6644BlazquezMA,GreenR,NillsonO,SussmanMR,A,elzerS.2000.AMADSdomaingeneinvolvedinthetransitiontoflooting,andresetting.ThePlantCell16;S18~S318BoudsocqM,LauriereC.2005.Osmoticsignalinginplants:multiplepathediatedbyemergingkinasefamilies.PlantPhysiol138:1185-11949Briggs,HughesJ.2001.Thephototropinfamilyofphotoreceptors.PlantCell13:993-997ChandlerJ，utantsshowinganalteredresponseto vernalization.PlantJ10:637-644(责任编辑：gufeng)