《虫草素生物合成相关基因RNR的克隆及功能验证研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
（药学院）二○一八届硕士研究生学位论文虫草素生物合成相关基因RNR的克隆及功能验证研究CloningandFunctionalVerificationofRNRGeneRelatedtoCordycepinBiosynthesis研究生姓名：王玉贤指导教师：国锦琳教授学科专业：生药学二○一八年五月 成都中医药大学（药学院）二0一八届硕士研究生学位论文虫草素生物合成相关基因RNR的克隆及功能验证研究CloningandFunctionalVerificationofGenesRelatedtoCordycepinBiosynthesis研究生姓名：王玉贤指导教师：国锦琳教授学科专业：生药学二○一八年五月 学位论文虫草素生物合成相关基因的克隆与功能验证研究CloningandFunctionalVerificationofGeneRelatedtoCordycepinBiosynthesis王玉贤指导教师姓名：国锦琳教授申请学位级别：硕士专业名称：生药学论文提交时间：2018.5论文答辩时间：2018.5.25二○一八年五月 本研究在国家自然科学基金（No.81373920）、四川省中医管理局川产道地药材大品种项目、成都市科技计划项目(2015-HM01-00205-SF)资助下完成。 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文摘要虫草是虫草属（Cordyceps（Fr.）Link）真菌寄生于昆虫、蜘蛛和大团囊菌属（ElaphomycesNees&Fr.）的某些地下种类上，在一定的条件下形成子实体而呈现的虫菌复合体，冬虫夏草和蛹虫草是虫草的典型代表。冬虫夏草（Cordycepssinensis）是我国传统名贵中药，蛹虫草（Cordycepsmilitaris（Fr.）Link）具有与其相似的药用价值，虫草素为两者有效成分之一，也是第一个从真菌里发现的核苷类抗菌素，具有很强的抗菌、抗肿瘤、免疫调节及抗炎等作用，有良好的临床应用前景。一直以来，虫草素的药理作用是研究的热点，但由于其含量低、提取效率不高，难以大规模生产和应用。揭示虫草素生物合机制，采用合成生物学等方法高效获得虫草素是当下的研究热点和出路。本研究以课题组前期对冬虫夏草子实体转录组分析预测的虫草素合成途径及挖掘到的关键酶核糖核苷酸还原酶—RNR为研究对象，对冬虫夏草RNR大小亚基进行cDNA克隆，通过根癌农杆菌介导法转化蛹虫草菌探究其与虫草素合成的关系。由于冬虫夏草生长周期长，生长条件特殊，尚无成功构建遗传转化体系的报道，而蛹虫草菌遗传转化体系构建研究相对成熟，且冬虫夏草RNR大小亚基与蛹虫草菌RNRL（GI：573978269）和RNRM（GI：573986094）氨基酸序列相似率分别为99%和97%，冬虫夏草和蛹虫草RNR大小亚基序列高度保守，故本实验选用蛹虫草菌构建遗传转化体系，对虫草素合成的关键酶RNR进行功能验证。利用PCR技术克隆冬虫夏草子实体RNR的大小亚基基因cDNA全长。RNRL和RNRM基因末端分别加入FLAG标签，并在基因两端设计添加相应的酶切位点，利用分子生物学方法，成功构建了三个重组质粒，分别为：pCAMBIA1300-35S-RNRM、pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL。采用根癌农杆菌介导的方法成功将3个重组质粒的T-DNA片段分别整合到蛹虫草菌基因组中，筛选、鉴定，获得3组重组蛹虫草菌株分别为：CM-M、CM-L及CM-M-L，即分别整合了RNRM、RNRL及同时整合了RNRM与RNRL基因的蛹虫草菌。利用荧光定量PCR及WesternBlot法对目的基因进行mRNA和蛋白表达水平的检测，结果显示目的基因均在转化菌株里成功表达。I 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文利用HPLC法检测3组重组菌株及对照组的虫草素含量，结果发现：CM-M较对照组，虫草素含量明显升高，在第10天时，其表达量为对照组的1.8倍，CM-L较对照组无明显变化，CM-M-L较对照组虫草素含量低，推测RNRM基因可能对虫草素合成发挥重要作用，而RNRM与RNRL同时存在时形成RNR全酶，更倾向于还原腺苷，形成2'-脱氧腺苷，与虫草素合成途径形成竞争。因此，本研究认为腺苷为虫草素和2'-脱氧腺苷的共同前体物质，RNR小亚基在虫草素合成途径中起着重要作用，虫草素合成途径可能与腺苷代谢途径存在竞争关系，但RNRM在虫草素合成过程中的作用机制有待进一步深入探究。关键词：冬虫夏草；蛹虫草；核糖核苷酸还原酶RNR；遗传转化；虫草素生物合成II 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文ABSTRACTCordycepsisacomplexofcordycepsfungus,whichisparasiticonthesclerotiaofinsects,spidersandElaphomycesNees,andproducesfruitingbodiesundercertainconditions.Amongthem,CordycepssinensisandCordycepsmilitarisarethemostwidelystudied.CordycepssinensisisavaluableandtraditionalChinesemedicineinChina.CordycepsmilitarishassimilarmedicinalvaluetoCordycepssinensisandcanbeusedasasubstituteforCordycepssinensis.CordycepinisoneofthecommonactivecomponentsofCordycepssinensisandCordycepsmilitaris.Becauseofitsgoodantitumoreffect,CordycepinhasalwaysbeenthefocusofresearchontheactivecomponentsofCordycepssinensis,butthemechanismofCordycepinsynthesisinCordycepssinensisisnotclear.Itaffectsitslarge-scalepopularizationandapplication.Inthisstudy,thegeneofthekeyenzymeofcordycepinsynthesis,ribonucleotidereductase(RNR),whichwasdeducedfromthetranscriptomeanalysisofthefruitingbodyofCordycepssinensis,wasusedasthetargetgene,anditsgenefunctionwasinvestigatedbygenetictransformation.DuetothelonggrowthcycleandharshgrowthconditionsofCordycepssinensis,therearefewreportsonitsgenetictransformation,whilethemethodsofAgrobacteriumtumefaciensmediatedgenetictransformationofCordycepsmilitarissporeshavebeenwidelyreported,andtheRNRsubunitsequencesofCordycepssinensisandCordycepsmilitariswerehighlyconserved.Therefore,Cordycepsmilitariswasselectedastheresearchobject.FunctionalanalysisofthekeygeneRNRforCordycepinSynthesisVerificationandverification.ThewholelengthofRNRgeneofCordycepssinensisfruitingbodywasobtainedbycDNAcloningtechnique.ThreerecombinantplasmidsweresuccessfullyconstructedbydesigningprimerswithFLAGexpressiontagsandcorrespondingrestrictionsites,andbymeansofgeneticengineering,throughenzymedigestion,ligation,transformationandsequencing.Threerecombinantplasmids,pCAMBIA1300-35S-RNRMN,pCAMBIA1300-35S-RNRL,pCAMBIA1300-35S-III 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文RNRM-35S-RNRL.TheT-DNAfragmentofthethreerecombinantplasmidswereinsertedintothechromosomalgenomeofCordycepsmilitaris,andthreerecombinantstrainsweresuccessfullyobtainedbyscreeningandPCRidentification.TherecombinantstrainswereidentifiedbyfluorescencequantitativePCRandWesternBlot.Theresultsshowedthattherecombinantstrainswereexpressedatgeneandproteinlevels.HPLCwasusedtodetectthedifferenceofCordycepinexpressionbetweenthethreerecombinantbacteriaandtheuntreatedoriginalstrain(negativecontrol).TheresultsshowedthatthecontentofCordycepininCM-Mwassignificantlyhigherthanthatofthecontrolgroup,andtherewasnosignificantchangeinCM-Lcomparedwiththecontrolgroup,andthecontentofCordycepininCM-MLwaslowerthanthatinthecontrolgroup.ItisspeculatedthatRNRMgeneplaysanimportantroleinthesynthesisofCordycepssinensis,andRNRMbindswithRNRLtoformribonucleotidereductaseRNR.TheRNRenzymeisthekeyenzymeinthemetaboliccatabolismofadenosinetoform2'-deoxyadenosine,andthecontentofadenosineismoredecomposedtoform2'-deoxyadenosine.BecauseadenosineisalsoaprecursorofCordyceps.ThecontentofCordycepinwasreduced.Keywords:Cordycepssinensis;Cordycepsmilitaris;ribonucleotidereductase;genetictransformation;CordycepinIV 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文目录摘要.................................................................................................................................IABSTRACT.................................................................................................................III*缩略词......................................................................................................................1前言..............................................................................................................................2第一章虫草素合成关键酶基因RNR克隆与重组质粒的构建................................71.材料....................................................................................................................71.1实验材料...................................................................................................71.2实验试剂...................................................................................................81.3试剂及培养基配置...................................................................................81.4实验设备...................................................................................................92.实验方法............................................................................................................92.1载体构建...................................................................................................92.2冬虫夏草子实体总RNA的提取与cDNA反转录..............................112.2.1冬虫夏草子实体总RNA的提取.................................................112.2.2反转录cDNA................................................................................122.3冬虫夏草子实体RNRL、RNRM基因与35S启动子基因的克隆....122.3.1目的片段扩增...............................................................................122.3.2目的片段回收...............................................................................132.4RNRL、35S1基因与载体的酶切与连接..............................................132.4.1RNRL、35S1基因与载体双酶切................................................132.4.2RNRL、35S1基因与载体连接....................................................142.5大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化.......................................152.5.1大肠杆菌（DH5α）感受态细胞的制备......................................152.5.2大肠杆菌转化...............................................................................152.6阳性转化子鉴定与测序.........................................................................162.7pCAMBIA1300-35S1-RNRL、pCAMBIA1300-35S1-RNRM载体的构建....................................................................................................................162.7.1pCAMBIA1300-35S1、pCAMBIA1300-RNRL质粒提取.........162.7.2RNRM、35S1与相应载体双酶切与连接...................................16 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文2.7.3大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化.........................................172.7.4pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM载体的鉴定.........................................................................................................172.8pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL载体的构建.......................183结果与分析.......................................................................................................183.1冬虫夏草总RNA提取...........................................................................183.2RNRL、RNRM、35S1、35S2基因的克隆..........................................193.3各重组质粒菌落PCR鉴定结果...........................................................194.讨论..................................................................................................................21第二章蛹虫草菌遗传转化体系构建........................................................................231.材料..................................................................................................................231.1实验材料.................................................................................................231.2实验试剂.................................................................................................231.3试剂配置.................................................................................................241.4实验设备.................................................................................................262.方法..................................................................................................................262.1根癌农杆菌感受态细胞转化.................................................................262.1.1根癌农杆菌（EHA105）感受态制备.........................................272.1.2根癌农杆菌感受态细胞转化.......................................................272.2根癌农杆菌介导蛹虫草转化.................................................................272.2.1蛹虫草孢子的获取.......................................................................272.2.2蛹虫草、根癌农杆菌的抗生素敏感性实验...............................282.2.3根癌农杆菌介导蛹虫草转化.......................................................282.3转化子鉴定.............................................................................................282.3.1转化子总DNA的提取................................................................282.3.2重组蛹虫草菌的PCR鉴定.........................................................292.4重组蛹虫草菌RNRL、RNRM基因荧光定量PCR检测...................292.5重组蛹虫草菌RNRL、RNRM蛋白WesternBlot检测......................303.结果与分析......................................................................................................313.1根癌农杆菌转化子鉴定.........................................................................313.2蛹虫草孢子显微图.................................................................................32 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文3.3根癌农杆菌、蛹虫草孢子抗生素敏感性结果.....................................333.4蛹虫草阳性转化子PCR鉴定...............................................................343.5实时荧光定量PCR................................................................................343.6WesternBlot检测分析............................................................................384.讨论..................................................................................................................38第三章蛹虫草转化子虫草素含量检测....................................................................401材料...................................................................................................................401.1实验材料.................................................................................................401.2实验试剂.................................................................................................401.3实验仪器.................................................................................................402方法...................................................................................................................412.1样品制备.................................................................................................412.1.1对照品溶液的制备.......................................................................412.1.2供试品溶液的制备.......................................................................412.2色谱条件.................................................................................................412.3虫草素标准曲线的制备.........................................................................422.4方法学考察.............................................................................................422.4.1精密度试验...................................................................................422.4.2稳定性试验...................................................................................422.4.3加样回收试验...............................................................................422.5虫草素含量测定.....................................................................................423结果与分析.......................................................................................................423.1虫草素标准曲线.....................................................................................423.2精密度试验.............................................................................................433.3稳定性试验.............................................................................................433.4加样回收试验.........................................................................................443.5虫草素含量测定结果与分析..................................................................444.讨论..................................................................................................................47结论..............................................................................................................................49文献综述......................................................................................................................50中药有效成分生物合成的研究进展..........................................................................50 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文1中药基因组学...................................................................................................501.1中药转录组学研究.................................................................................501.2结构基因组学研究.................................................................................501.3中药基因组标记研究.............................................................................511.4中药功能基因组学研究.........................................................................512中药有效成分生物合成...................................................................................522.1中药生物合成研究简介.........................................................................522.2遗传转化体系构建的研究............................................................................532.2.1根癌农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化研究..................................532.2.2根癌农杆菌介导转化的机理..............................................................532.2.3根癌农杆菌介导真菌遗传转化步骤..................................................542.3中药生物合成研究的应用.....................................................................542.3.1青蒿素前体生物合成的研究.......................................................542.3.2人参皂苷生物合成的研究...........................................................552.3.3丹参酮生物合成的研究...............................................................55参考文献......................................................................................................................56 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文*缩略词缩写英文全称中文全称bpbasepair碱基对AMPAdenosinemonophosphate一磷酸腺苷ADPAdenosinediphosphate二磷酸腺苷ADKAdenosinekinase腺苷激酶ADEKAdenylatekinase腺苷酸激酶5’-NT5'-nucleotidase5'-核苷酸酶HPLChighperformanceliquid高效液相色谱chromatographyKDakilodalton千道尔顿PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PEGpolyethyleneglycol聚乙二醇ASAcetosyringone乙酰丁香酮KanKanamycin卡那霉素RifRifampin利福平GentGentamicin庆大霉素rpmrotationsperminute转/分SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠TAETris‐acetate‐EDTAbufferTris‐乙酸‐EDTA缓冲液DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜cDNAcomplementaryDNA互补DNALBLuria-BertanimediumLB培养基APAmmoniumpersulfate过硫酸铵TBSTTrisBufferedSalineTween洗膜缓冲液PDAPotatoDextroseAgar马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Medium）1 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文前言冬虫夏草（Cordycepssinensis）是麦角菌科真菌冬虫夏草菌（Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.）寄生于蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1]，具有补肾益肺、止血化痰的功效[2]。现代研究表明冬虫夏草具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化及保护心血管系统等功效[3]。冬虫夏草活性成分含量丰富，主要有：虫草多糖、虫草素、虫草酸、蛋白多肽类等，其中虫草素具有很强的抗菌、抗肿瘤、免疫调节及抗炎等作用[4]，具有良好的临床应用前景[5]。冬虫夏草蛋白含量达29.1%-33%，课题组前期研究发现，冬虫夏草蛋白提取物可通过上调Bax，活化Casepase3/9，诱导肺癌细胞A549凋亡，从而发挥抗肿瘤效应，同时还可通过促进巨噬细胞分泌因子TNF-α、IL-1、IL-12的分泌，激发免疫应答，发挥抗肿瘤活性[6]。可见冬虫夏草可通过诱导凋亡以及激活免疫应答同时发挥抗肿瘤效应。但由于其自身生长条件的苛刻以及人为对环境的破坏，冬虫夏草资源日益匮乏，而随着人们生活水平的提高以及养生保健意识的不断加深，对冬虫夏草的市场需求量不断增多，供不应求，使得冬虫夏草价格一路飙升。蛹虫草为蛹虫草菌(Cordycepsmilitaris)寄生于鳞翅目昆虫的蛹上，形成的复合体，又名北冬虫夏草或北虫草，具有与冬虫夏草相似的药用价值[7-9]，有效成分虫草素含量更为丰富。由于其生长条件较为普通，生长周期较短，容易实现大规模人工培养[11]，是冬虫夏草常用的替代品。虫草素，即3’-脱氧腺苷,属嘌呤类生物碱，是脱氧腺苷（2’-脱氧腺苷）的结构类似物（如图1，图2），1951年由Cunningham等[10]首次从蛹虫草中分离得到，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草素分子式为C10H13N5O3，分子量为251D，针状或片状结晶[11]。大量研究证明，虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、调节机体免疫功能，同时对心脏及肝脏也具有保护功能[12]。陈竺院士2015年在《cellcycle》杂志上报道了虫草素可通过诱导DNA损伤，上调p53，诱导白血病细胞NB-4和U937发生细胞周期阻滞和凋亡，使得虫草素成为研究热点[13]。目前，临床上使用虫草素辅助治疗恶性肿瘤[14]，临床实践证明，虫草素配合治疗药物的使用能够缓解放、化疗的副作用。因其显著的临床效应，虫草素的市场应用前景极其广阔。2 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图1.虫草素分子结构式Fig.1.Molecularstructureofcordycepin图2.2'-脱氧腺苷结构式Fig.2.Molecularstructureof2'-deoxyadenosine目前，虫草素主要通过蛹虫草菌丝液体深层发酵获得，但培养基成分及培养条件的不同、蛹虫草菌种的差异等对虫草素含量有很大的影响。有关提高虫草素产量方面的研究，主要集中在培养条件的优化、诱导筛选高产量突变菌种等方面。然而，培养条件的优化还受到大规模生产的成本、生产周期等问题的影响，诱导筛选突变菌种，突变方向难以把控，较为盲目，提高虫草素含量水平有限，这些随机、间接的方式方法不能从根本上改变虫草菌素的合成代谢通量。因此，虫草素生物合成途径及关键酶的深入研究越来越受到关注。但目前虫草素生物合成机理尚不明确，有待进一步的探索。1976年，Lennon等根据实验结果推测蛹虫草细胞中存在一种类似于生成2'-脱氧核苷的还原机制[15]。Zheng等[16]发现蛹虫草菌含有大量与腺嘌呤和腺苷代谢相关的基因，但是缺乏将ATP转化为dATP的核苷三磷酸还原酶和将脱氧腺苷转化为dAMP的脱氧腺苷激酶。核糖核酸还原酶（ribonucleotidereductase，RNR）是DNA合成和修复的关键酶[17]，也是唯一的核糖核酸还原酶[18]，因此RNR极有可能与虫草素合成密切相关。RNRs由一个大亚基和一个小亚基组成。Xiang等[17]通过转录组测序分析冬虫夏草虫草素合成途径，根据虫草素合成类似于腺苷还原机制，推测虫草素的生物合成途径如图3所示。3 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图3.冬虫夏草中的虫草素的推定生物合成途径Fig.3.AputativebiosynthesispathwayforcordycepininO.Sinensis.本课题组基于前期对冬虫夏草子实体及菌丝体的转录组测序分析，结合相关研究成果。推测虫草素合成途径，以ADP为前体还原3'-OH，再去磷酸，继而生成虫草素。虫草素合成相关的基因及关键酶的预测如表1所示，同时对关键基因进行表达水平差异分析，结果表明多数基因在菌丝体阶段表达量高于子实体阶段[19]，该结果与蛹虫草一致。基于转录组数据，挖掘到RNR大小亚基编码序列各1条，并进行cDNA克隆测序，经NCBIBlast2软件与转录组挖掘的序列进行同源比对，结果完全一致，确定为RNRL及RNRM基因，GenBank注册编号分别为KY435930和KY435931。分别与NCBI数据库公布的O.sinensisCO18的RNRL（GI：531864625）和RNRM（GI：531859135）氨基酸序列进行比对，相似率分别为99%和97%。与蛹虫草菌RNRL（GI：573978269）和RNRM（GI：573986094）氨基酸序列比对，相似率分别为99%和97%。可见，冬虫夏草和蛹虫草RNR亚基序列高度保守，同为Ia类RNR，亚基结构为α2β2。4 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文表1.虫草素合成基因预测Table1.TheputativeenzymesinvolvedinCordycepinbio-synthesisGenenameTranscriptIDFB-T03FB-T04CM-T05CM-T06TR4857|c2_g2_i463.913.212.051.82TR4857|c2_g2_i453.823.532.002.26TR4227|c1_g1_i81.190.433.132.26AdenosinekinaseTR4227|c1_g1_i131.551.532.472.47TR1320|c5_g1_i124.8420.8526.5325.33TR1320|c5_g1_i226.5023.1728.0626.98TR4227|c1_g1_i131.551.532.472.47TR1320|c5_g1_i226.5023.1728.0626.98TR2498|c16_g2_i41.451.107.766.66AdenylatekinaseTR2498|c16_g2_i31.930.987.717.13TR2498|c16_g2_i21.951.478.988.07TR2498|c16_g2_i12.201.509.317.93TR9945|c0_g2_i116.699.057.629.245'-nucleotidaseTR9945|c0_g1_i117.399.377.5410.78TR14073|c0_g2_i133.9617.9748.1557.41TR217|c1_g1_i335.1227.5921.5919.03Ferritin/ribonucleotideTR217|c1_g1_i229.2225.2324.9520.17reductase-likeproteinTR7378|c0_g1_i23.903.943.894.38TR7378|c0_g1_i14.284.515.174.91RibonucleotideTR6235|c1_g1_i158.2234.8162.3385.12reductasesMsubunitRibonucleotideTR4942|c3_g1_i33.461.952.482.64reductasesLsubunit为深入探究RNR基因的功能，研究基因的表达与调控机制，建立一个高效稳定的遗传转化体系尤为重要。目前，常见的真菌转化方法有:原生质体转化法、醋酸锂转化法、电穿孔转化法和根癌农杆菌介导转化法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT)等[20]。根癌农杆菌介导的转化法克服了PEG介导的原生质体转化以及限制酶介导的插入突变等方法需要制备原生质体、转化效率低等缺点，为真菌的遗传转化和基因功能的研究提供了可靠的工具，具有操作方法简单、转化受体多样、单拷贝、转化效率较高、遗传稳定等优点。现已被广泛运用于真菌的遗传转化中，是一种最为简单有效的转化方法。在虫草相关真菌中利用ATMT法成功建立转化体系的已报道的有：蛹虫草菌、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌等[21]。蛹虫草菌遗传转化方法相对成熟，且虫草素含量5 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文较高，易于人工培养，而冬虫夏草菌因其生长周期较长，生长条件较为特殊，人工培养技术不成熟，且冬虫夏草和蛹虫草RNR亚基序列高度保守。故本实验以转录组挖掘的冬虫夏草RNR基因为切入点，建立蛹虫草菌遗传转化体系，探究RNR基因对虫草素合成的影响，进一步对虫草素生物合成机制展开研究。主要研究内容：（1）克隆冬虫夏草子实体RNRL（RNR大亚基）和RNRM（RNR小亚基）的基因全长，构建三个重组质粒（pCAMBIA1300-35S-RNRM、pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL）。（2）根癌农杆菌介导法将3个重组质粒的T-DNA区域整合到蛹虫草菌分生孢子染色体基因组中，RCR技术鉴定阳性转化子，并对重组菌进行基因及蛋白表达分析。（3）运用高效液相色谱法（HPLC）检测RNR大亚基、小亚基共转前后蛹虫草菌中虫草素含量的变化，以揭示虫草素合成与RNR的关系。技术路线：6 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文第一章虫草素合成关键酶基因RNR克隆与重组质粒的构建根据目前虫草素生物合成研究进展，以及前期转录组数据，预测虫草素生物合成途径及关键酶基因，本研究以核糖核酸还原酶RNR为切入点展开虫草素生物合成研究。本章分别克隆了冬虫夏草子实体RNR大小亚基的cDNA全长，选择含有卡那霉素及潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒进行载体构建，以pCAMBIA2300为模板，扩增35S启动子片段，并在片段两端设计添加相应的酶切位点。以冬虫夏草cDNA为模板扩增RNRL及RNRM基因片段，RNRL片段5'端添加XbaI，3'端添加HandIII两个酶切位点，RNRM片段5'端添加KpnI，3'端添加SmalI-XbaI两个酶切位点，其中SmalI在XbaI内部，即添加一个SmalI酶切位点，以便插入35S启动子片段。RNRL和RNRM基因末端加入FLAG标签（序列5'-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3'），以方便后期基因表达检测。利用分子生物学方法，构建重组载体，RNR由大小两个亚基构成，每个亚基可单独发挥生物活性，因此，本实验构建了三个重组质粒，即只含有RNRL基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S-RNRL），只含有RNRM基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S-RNRM），以及同时含有RNRL与RNRM基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL），为进一步转化蛹虫草菌，验证基因功能打下基础。1.材料1.1实验材料新鲜冬虫夏草样品于2016年5月采集于四川省康定县，经国锦琳教授鉴定，样品备份于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室，液氮冻存。pCAMBIA1300空载体及大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α感受态细胞由中国科学院成都生物研究所汪松虎实验室提供，pCAMBIA1300载体图谱如图1-1所示，该载体含有由CaMV35S启动的潮霉素抗性基因，T-DNA外部含有卡那霉素抗性基因。载体可以通过冻融法导入到根癌农杆菌EHA105细胞中，其T-DNA区域结构见图1-1，LB-TDNA至RB-TDNA之间。7 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图1-1：pCAMBIA1300载体图谱Fig.1-1ThemapofpCMBIA1300plasmid1.2实验试剂TrizolReagent（Ambion，美国），RTreagentKitwithgDNAEraser（Takara，日本），TransStartFastPruFlyDNAPolymerase高保真聚合酶（北京全式金生物技术有限公司），2×TaqMasterMix(Dye)（康为世纪生物科技有限公司），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪生物科技有限公司），限制性内切酶EcoRI、XbaI、HindIII、KpnI、SmaI（Thermo，美国），T4DNALigase（Thermo，美国），高纯度质粒小提试剂盒（康为世纪生物科技有限公司），Trans2KDNAMarker（北京全式金生物技术有限公司），Trans2KPlusDNAMarker（北京全式金生物技术有限公司），引物合成和DNA测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。1.3试剂及培养基配置(1)Kan储存液（100mg/mL）：卡那霉素1g，蒸馏水10mL溶解，超净工作台中用0.22µm滤膜过滤。于-20℃冰箱保存备用。(2)LB液体培养基：Yeastextract5g，NaCl10g，Tryptone10g，蒸馏水10008 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文mL。121℃高压灭菌20min。(3)LB固体培养基（Kan抗性）：液体LB1000mL，琼脂粉10g。121℃高压灭菌20min。当培养基温度降到50℃左右时，加入1mLKan储存液，混匀后倒平板，凝固后封口，置于4℃冰箱备用。(4)50×TAEBuffer（pH8.5）：Tris242g，Na2EDTA•2H2O37.2g，蒸馏水800mL，溶解，醋酸57.1mL，混匀，定容至1L。(5)1×TAEBuffer：取50×TAEBuffer20mL，加入蒸馏水定容至1L，混匀，室温保存。(6)1%琼脂糖鉴定凝胶：0.5g琼脂糖，加入50mL1×TAEBuffer混匀，微波炉加热至完全融化，加入5µLGoldview溶液，混匀，倒入胶槽，插入梳子，待其凝固。(7)1%琼脂糖回收凝胶：0.5g琼脂糖，加入50mL1×TAEBuffer混匀，微波炉加热至完全融化，加入5µLGel-Red溶液，混匀，倒入胶槽，插入梳子，待其凝固。1.4实验设备仪器名称型号仪器来源高速冷冻离心机ST16RThermoFisherScientific立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-75SII上海博讯实业有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9240MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂高速离心机LegendMicro17ThermoFisherScientific干式恒温器DTH-100杭州米欧仪器有限公司旋涡混合器XW-80A上海青浦沪西仪器厂T100TMThermalCyclerBIO-RAD超低温冰箱905ThermoFisherScientific优普系列超纯水器UPH-II-10T成都超纯科技有限公司HH数显三用恒温水箱江苏金坛市金城园胜实验仪器厂恒温培养振荡器ZWY-100H上海智城紫外分析仪JY02S北京君意东方电泳设备有限公司凝胶成像系统BIO-RAD超净工作台SW-CJ-2D苏净安泰2.实验方法2.1载体构建实验选用pCAMBIA1300作为目的载体，原始载体T-DNA结构如图1-2。分9 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文别构建3个载体：只含有RNRM基因的重组载体，只含有RNRL基因的重组载体，同时含有RNRM和RNRL基因的重组载体，即：pCAMBIA1300-35S-RNRM、pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL载体构建方案如图1-3，1-4，1-5。以pCAMBIA2300为模板，扩增35S启动子片段，并在片段两端设计添加相应的酶切位点，其中5'端设计添加EcoRI，3'端设计添加KpnI两个酶切位点的35S片段记为35S1，5'端设计添加SmalI，3'端设计添加XbaI两个酶切位点的35S片段记为35S2。以冬虫夏草cDNA为模板扩增RNRL及RNRM相关片段，RNRL片段5'端设计添加XbaI，3'端设计添加HandIII两个酶切位点，RNRM片段5'端添加KpnI，3'端添加SmalI-XbaI两个酶切位点，其中SmalI在XbaI内部，即添加一个SmalI酶切位点，以便插入35S2片段。RNRL和RNRM基因末端加入FLAG标签（序列5'-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3'），以便于后期基因表达的检测。图1-2.改造前载体T-DNA示意图Fig.1-2Plasmidmapbeforemodification图1-3.pCAMBIA1300-35S-RNRM改造后载体图Fig.1-3.RecombinantplasmidofpCAMBIA1300-35S-RNRM10 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图1-4.pCAMBIA1300-35S-RNRL改造后载体图Fig.1-4.RecombinantplasmidofpCAMBIA1300-35S-RNRL图1-5.pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL改造后载体图Fig.1-5.RecombinantplasmidofpCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL2.2冬虫夏草子实体总RNA的提取与cDNA反转录2.2.1冬虫夏草子实体总RNA的提取[22](1)取新鲜冬虫夏草子实体在液氮中充分研磨，将粉末置于RNase-free的EP管中，加入TrizolReagent（约每100mg样品使用1mLTrizolReagent），迅速颠倒混匀，将匀浆样品室温放置5min。(2)每使用1mLTrizolReagent加200L氯仿，剧烈振荡15s后，室温放置3min。(3)4℃，12000rpm离心15min，将上层水相转移到1.5mLRNase-free的EP管中。11 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文(4)加入400L氯仿，混匀，4℃，12000rpm离心10min，重复两次。(5)取上清水相（约0.5mL）加入等体积-20℃预冷的异丙醇（约0.5mL），颠倒混匀，4℃放置约1h。(6)4℃，12000rpm离心10min，弃去上清。(7)加入1mL75%乙醇（用RNase-FreeddH2O配制）洗涤2次。(8)在4℃下，7500×g离心5min，弃去上清液体，剩余的少量液体短暂离心后用枪头吸出。(9)室温晾干（约3min），加入30LRNase-freeddH2O，55～60℃溶解10min。(10)用Nanodrop2000和1%琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测，RNA溶液-80℃保存。2.2.2反转录cDNA冬虫夏草子实体总RNA，经Nanodrop2000测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解，按RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒操作步骤进行实验，将RNA反转录合成cDNA，-20℃保存。2.3冬虫夏草子实体RNRL、RNRM基因与35S启动子基因的克隆2.3.1目的片段扩增按照2.1项下载体设计方案，设计引物如表1-1所示，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。表1-135S、RNR各基因引物名称及序列Table1-1Namesandsequencesofprimersfor35S、RNR基因序列35S1-F5'-CGGAATTCAAGGATCCGTACCCCTACTCCA-3'35S1-R5'-CGGGGTACCGGATCTAGCTTGGGCTGTCCT-3'35S2-F5'-TCCCCCGGGAAGGATCCGTACCCCTACTCCA-3'35S2-R5'-TGCTCTAGAGATCTAGCTTGGGCTGTCCT-3'RNRL-F5'-TGCTCTAGAATGTTCGTCCGAAAGCGCG-3'RNRL-R5'-CCCAAGCTTCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCGCTGCACATGACGC-3'RNRM-F5'-CGGGGTACCATGGCCTCTCAAATCACCCCA-3'RNRM-R5'-TGCTCTAGATCCCCCGGGGGATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAAAGTCGTCATCAAAAGAGAAG-3'PCR反应条件：参照TransStartFastPruFlyDNAPolymerase高保真聚合酶12 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文试剂说明书进行操作，95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸（RNRL延伸2min，RNRM延伸1min，35S延伸30s），35个循环后，72℃后延伸15min。2.3.2目的片段回收2.3.1项下PCR扩增产物，经过1%的琼脂糖（回收）凝胶电泳分析，电压120V，约30min。条带大小鉴定正确后，切取目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，注意在紫外灯下切取条带时，应操作迅速，避免因紫外照射过久造成的DNA损伤，同时应尽量切除条带以外多余凝胶部分。回收的DNA溶液可置于-20℃保存，用于后续酶切实验。2.4RNRL、35S1基因与载体的酶切与连接2.4.1RNRL、35S1基因与载体双酶切将RNRL片段与pCAMBIA1300载体分别进行XbaI和HindⅢ双酶切，将35S1片段与pCAMBIA1300载体分别进行EcoRI和KpnI双酶切。酶切体系见表1-2、1-3、1-4、1-5。酶切反应条件：37℃，水浴2h。表1-2RNRL片段XbaI和HindⅢ双酶切体系Table1-2RNRLdigestedbyXbaIandHindIII成分体积RNRL胶回收片段15L限制性内切酶XbaI1L限制性内切酶HindⅢ1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L表1-3pCAMBIA1300载体XbaI和HindⅢ双酶切体系Table1-3PlasmidofpCAMBIA1300digestedbyXbaIandHindIII成分体积pCAMBIA1300载体15L限制性内切酶XbaI1L限制性内切酶HindⅢ1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L13 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文表1-435S1片段EcoRI和KpnI双酶切体系Table1-435S1digestedbyEcoRIandKpnI成分体积35S1胶回收片段15L限制性内切酶EcoRI1L限制性内切酶KpnI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L表1-5pCAMBIA1300载体EcoRI和KpnI双酶切体系Table1-5PlasmidofpCAMBIA1300digestedbyEcoRIandKpnI成分体积pCAMBIA1300载体15L限制性内切酶EcoRI1L限制性内切酶KpnI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L双酶切后的片段和载体经1%的琼脂糖（回收）凝胶电泳分析鉴定后，切取酶切后的电泳条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。2.4.2RNRL、35S1基因与载体连接将经过双酶切、胶回收的RNRL片段和pCAMBIA1300载体（经XbaI和HindⅢ酶切）片段，在T4DNALigase的作用下，4℃连接过夜（或22℃连接2h）。将经过双酶切、胶回收的35S1片段和pCAMBIA1300载体（经EcoRI和KpnI酶切）片段，在T4DNALigase的作用下，4℃连接过夜（或22℃连接2h），连接体系见表1-6、1-7。表1-6RNRL和pCAMBIA1300连接反应体系Table1-6RNRLandpCAMBIA1300ligationreactionsystem成分体积RNRL酶切片段15LpCAMBIA1300（XbaI和HindⅢ酶切）2L10×T4DNALigaseBuffer1LT4DNALigase2L总体积20L14 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文表1-735S1和pCAMBIA1300连接反应体系Table1-735S1andpCAMBIA1300ligationreactionsystem成分体积35S1酶切片段15LpCAMBIA1300（EcoRI和KpnI酶切）2L10×T4DNALigaseBuffer1LT4DNALigase2L总体积20L2.5大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化2.5.1大肠杆菌（DH5α）感受态细胞的制备(1)活化菌株：挑取大肠杆菌DH5α单个菌落，加入到10mLLB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。(2)用紫外分光光度计测定菌株OD600为0.4左右。(3)将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30min。4℃，3000rpm离心10min，沉淀菌体。(4)离心管内沉淀的菌体用20mL预冷的100mMCaCl2重悬，冰浴10min。4℃，3000rpm离心10min，收集菌体。(5)用2mL100mMCaCl2（含15%甘油）重悬沉淀，即得感受态细胞。(6)将感受态细胞分装至200L的EP管中（每支100L），将分装后的感受态细胞放入液氮中预冷后，置于-80℃冰箱备用。2.5.2大肠杆菌转化(1)从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴复苏约15～20min。(2)取2.4.2项下的连接产物，缓慢加入到50L感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，注意过程要轻，不要剧烈振荡，以免伤害感受态细胞。(3)将冰浴后的混合溶液置于42℃水浴锅中，热激45s，迅速将其转移到冰上，静置2min。(4)缓慢加入500L无抗性的LB液体培养基，轻轻混匀，37℃培养箱放置10min后，37℃摇床150r/min培养约45min。(5)将菌液均匀涂布于含有卡那霉素（50g/mL）的LB固体培养基上，至液体被吸收后，封口，置于37℃恒温培养箱，倒置培养过夜。15 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文2.6阳性转化子鉴定与测序取2.5.2项下培养过夜的抗性平板，挑取单个菌落于500L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇菌约3h。取1L菌液，进行PCR菌落鉴定，（引物分别选用RNRL和35S1基因的引物），PCR产物经1%琼脂糖（鉴定）凝胶电泳分析，挑选PCR阳性菌进行测序分析，测序结果无误的转化子，按1：1加入50%甘油，混匀，-80℃冻存备用。2.7pCAMBIA1300-35S1-RNRL、pCAMBIA1300-35S1-RNRM载体的构建2.7.1pCAMBIA1300-35S1、pCAMBIA1300-RNRL质粒提取取-80℃冻存的分别含有pCAMBIA1300-35S1和pCAMBIA1300-RNRL重组质粒的菌液，每支加入6mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，180rpm培养过夜，13000rpm，离心5min，收集菌体，按照质粒小提试剂盒方法，提取重组质粒。2.7.2RNRM、35S1与相应载体双酶切与连接RNRM、35S1与相应载体双酶切：将RNRM片段与pCAMBIA1300-35S1重组质粒分别进行KpnI和XbaI双酶切，35S1片段与pCAMBIA1300-RNRL重组质粒分别进行EcoRI和KpnI双酶切，酶切体系如下表，酶切条件：37℃，酶切2h。表1-8RNRM片段KpnI和XbaI双酶切体系Table1-8RNRMdigestedbyXbaIandKpnI成分体积RNRM胶回收片段15L限制性内切酶KpnI1L限制性内切酶XbaI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L16 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文表1-935S1片段EcoRI和KpnI双酶切体系Table1-935S1digestedbyEcoRIandKpnI成分体积35S1胶回收片段15L限制性内切酶EcoRI1L限制性内切酶KpnI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L表1-10pCAMBIA1300-35S1载体KpnI和XbaI双酶切体系Table1-10pCAMBIA1300-35S1digestedbyXbaIandKpnI成分体积pCAMBIA1300-35S115L限制性内切酶KpnI1L限制性内切酶XbaI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L表1-11pCAMBIA1300-RNRL载体EcoRI和KpnI双酶切体系Table1-11pCAMBIA1300-RNRLdigestedbyEcoRIandKpnI成分体积pCAMBIA1300-RNRL15L限制性内切酶EcoRI1L限制性内切酶KpnI1L10×FastDigestBuffer5LddH2O28L酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切取电泳条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。RNRM、35S1与相应酶切载体片段连接：将经过双酶切的RNRM片段与pCAMBIA1300-35S1重组质粒酶切片段置于同一连接体系，35S1与pCAMBIA1300-RNRL酶切片段置于同一连接体系，分别在T4DNALigase的作用下，4℃连接过夜，连接体系参考2.4.2。2.7.3大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化将2.7.2中两个连接产物，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作步骤参考2.5.2项。2.7.4pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM载体的鉴定分别挑取两个转化平板的单个菌落于500L含有50μg/mL卡那霉素的LB17 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文液体培养基中，37℃摇菌约3h。取1L菌液，进行菌落PCR鉴定，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM重组质粒的转化子引物选用：35S1-F/RNRM-R，含pCAMBIA1300-35S1-RNRL重组质粒的转化子引物选用：35S1-F/RNRF-R。挑选PCR阳性转化子，测序，测序正确的转化子，扩大培养，收集菌体，提取质粒，得到pCAMBIA1300-35S1-RNRM、pCAMBIA1300-35S1-RNRL重组质粒。2.8pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL载体的构建将pCAMBIA1300-35S1-RNRM重组载体，与35S2片段分别进行SmalI和XbaI双酶切，回收酶切片段与酶切载体，T4DNALigase作用下，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，鉴定阳性转化子，质粒小提试剂盒提取获得pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2重组质粒，于-20℃保存；再将pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2重组质粒，与RNRL基因进行XbaI和HandIII双酶切，同上，T4DNALigase作用下，4℃连接过夜，产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定阳性转化子，扩大培养，提取质粒，得到pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL重组载体。3结果与分析3.1冬虫夏草总RNA提取新鲜冬虫夏草子实体RNA提取后，Nanodrop2000测定总RNA的A260/A280为2.05，含量为1198.49ng/L。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28SrRNA和18SrRNA条带明亮清晰，含量丰富（图1-6）。表明，冬虫夏草子实体总RNA提取含量丰富，杂质较低，纯度较高，且未出现明显降解，质量较好，可用于反转录cDNA。18 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图1-6冬虫夏草子实体总RNA凝胶电泳图Fig.1-6TotalRNAAgarGelElectrophoresismapofO.sinensisfruitingbody3.2RNRL、RNRM、35S1、35S2基因的克隆利用TransStartFastPruFlyDNAPolymerase高保真聚合酶克隆RNRL、RNRM以及35S1与35S2片段，扩增结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1-7，1-8所示，RNRL基因全长2733bp，RNRM基因全长1257bp，2*35S基因全长781bp，由电泳图可知：基因均在相应位置有单一条带，且较为清晰明亮，与目的条带大小相符，说明基因克隆较为成功，可用于下一步切胶回收。图1-7冬虫夏草RNR基因大小亚基cDNA全长1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.1-7AgarGelElectrophoresismapofO.sinensisRNRsubunitscDNAM:Trans2KDNAMarker1,4:空白对照2,3:RNRLcDNA全长5,6:RNRMcDNA全长M:Trans2KDNAMarker;1,4:Control;2,3:RNRLcDNA;5,6:RNRMcDNA图1-835S1和35S2基因全长1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.1-8AgarGelElectrophoresismapof35S1and35S2M:Trans2KDNAMarker1:空白对照2:35S1全长3:35S2全长M:Trans2KDNAMarker;1:Control;2:35S1;3:35S23.3各重组质粒菌落PCR鉴定结果随机挑取抗性平板上的单个菌落进行菌落PCR，结果如图1-9，1-10，1-11，19 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文1-12所示。35S1+RNRM大小约为2037bp，35S1+RNRL大小约为3513bp，结果表明：各转化子菌落PCR产物电泳结果，条带单一，且条带大小与目的基因一致，说明RNRL、RNRM以及启动子35S均成功的插入到pCMBIA1300质粒中，取各PCR阳性菌送样测序分析，结果与目的基因完全一致，表明pCAMBIA1300-35S1-RNRM、pCAMBIA1300-35S1-RNRL、pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL三个载体构建成功。图1-9RNRL菌液PCR电泳图Fig.1-9thegelelectrophoresismapofRNRLbacterialiquidPCRM:Trans2KDNAMarker；1:空白对照；2～10：RNRL重组质粒菌液M:Trans2KDNAMarker;1：Control；2~10:bacterialiquidofRNRLrecombinantplasmid图1-10RNRM菌液PCR电泳图Fig.1-10ThegelelectrophoresismapofRNRMbacterialiquidPCRM:Trans2KDNAMarker；1:空白对照；2～10：RNRM重组质粒菌液M:Trans2KDNAMarker;1：Control；2~10:bacterialiquidofRNRMrecombinantplasmid20 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图1-1135S1+RNRM重组质粒菌液PCR电泳图Fig.1-11thegelelectrophoresismapof35S1+RNRLMbacterialiquidPCRM:Trans2KPlusDNAMarker；H20:空白对照；1-6：35S+RNRM重组质粒菌液M:Trans2KPlusDNAMarker;H20:Control；1~6:bacterialiquidof35S1+RNRMrecombinantplasmid图1-1235S1+RNRL重组质粒菌液PCR电泳图Fig.1-12thegelelectrophoresismapof35S1+RNRLbacterialiquidPCRM:Trans2KPlusDNAMarker；H20:空白对照；1-6：35S+RNRL重组质粒菌液M:Trans2KPlusDNAMarker;H20:Control；1~6:bacterialiquidof35S1+RNRLrecombinantplasmid4.讨论TrizolReagent法提取新鲜冬虫夏草子实体的RNA过程中，注意配戴手套口罩，尽量在超净工作台内进行，防止RNA降解或受到DNA气溶胶污染。通过使用高保真聚合酶，克隆得到冬虫夏草子实体RNRL和RNRM基因片段，测序结果与转录组数据一致。查询文献得知，潮霉素对蛹虫草菌生长表现出抑制作用，当浓度达到一定程度时，可完全抑制蛹虫草菌的生长，故实验选用含有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒进行载体构建，以方便后续的抗性筛选。为增强基因的表达效率，实验选用2×35S强启动子。同时为提高酶切效率，在引物设计21 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文时，在各酶切位点的5'端都加有3个保护碱基，在基因终止密码子前添加FLAG标签，与目的基因融合表达，以便能够通过WesternBlot检测相应蛋白的表达。通过4步重组、筛选，最终成功构建了三个重组质粒，即：只含有RNRL基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S1-RNRL），只含有RNRM基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S1-RNRM）以及同时含有RNRL与RNRM基因的重组质粒（pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL）。冬虫夏草RNR酶与人、拟南芥、酵母和曲酶等同属于Ia[23]型，Ia型RNR亚基之间序列保守性较高，亚基结构为α2β2。RNR酶有与4种NDP底物结合的位点，可与不同效应物结合改变酶的活性或底物特异性[24]，保守域与结构域分析发现主要催化活性区位于RNRL亚基，而RNRM含有铁调节蛋白保守位点。研究发现人类RNR由大亚基RNRMI与小亚基RNRMZ或RNRMZB组成，两种RNR及其三种亚基蛋白在肿瘤发病不同阶段中发挥不同生物活性[25]，可知RNR亚基不同组合可产生不同生物活性，甚至不同亚基蛋白单独也具有相应生物活性，故实验设计构建三个重组质粒，以探究RNRL与RNRM单独的作用，及其聚合的RNR酶的作用。22 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文第二章蛹虫草菌遗传转化体系构建根癌农杆菌介导丝状真菌的遗传转化既简单，又具有很好的可重复性[26]。目前通过ATMT法已经实现了60多种真菌的遗传转化，其介导的丝状真菌（孢子、菌丝体或子实体）的转化效率一般在300～9000个转化体/107个受体细胞，其转化效率比PEG介导的原生质体转化效率高约600倍。农杆菌介导遗传转化方法简单，不需要特殊设备，对于真菌孢子也无需破壁，大大提高了转化效率，已经得到广泛的应用。ZHENGZhuangli等[27]，2011年用根癌农杆菌介导法成功转化了蛹虫草（C.militarisJM4）孢子，转化率为30-600个转化子/105个孢子。郭维等[28]也通过根癌农杆菌介导的方法成功转化了深红虫草CO33，根癌农杆菌介导法转化虫草菌研究已取得了很大的进展。蛹虫草遗传转化方法相对成熟，生长周期较短，易于人工培养，而冬虫夏草因为生长周期过长，生存环境过于苛刻，目前尚未发现有关对于冬虫夏草遗传转化的报道。因此，本章以蛹虫草菌为研究对象，采用根癌农杆菌介导的方法转化蛹虫草菌孢子，通过抗性筛选及转化子潮霉素抗性基因的PCR鉴定，确定阳性转化菌株，并通过实时荧光定量PCR及WesternBlot技术分别在分子及蛋白水平检测到RNRM及RNRL基因在蛹虫草内表达的增强，说明转化较为成功，获得了含pCAMBIA1300-35S1-RNRM重组载体T-DNA区的重组菌株CM-M，含pCAMBIA1300-35S1-RNRL重组载体T-DNA区的重组菌株CM-L，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL重组载体T-DNA区的重组菌株CM-M-L，为进一步探究RNR基因的功能奠定了基础。1.材料1.1实验材料实验所需新鲜蛹虫草（Cordycepsmilitaris）由四川久远生物技术有限公司提供，根癌农杆菌（AgrobacteriumTumefaciens）EHA105感受态细胞由中国科学院成都生物研究所汪松虎课题组实验室保存。1.2实验试剂TrizolReagent（Ambion，美国），RTreagentKitwithgDNAEraser（Takara，日本），TransStartFastPruFlyDNAPolymerase高保真聚合酶（北京全式金生23 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文物技术有限公司），2×TaqMasterMix(Dye)（康为世纪生物科技有限公司），PierceTMECLWesternBlottingSubstrate（Thermo,美国），QuatiproBCAassayKit（Sigma,USA），SsoFASTTMEvaGreenSupermix（BIO-RAD,USA）,乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）（Sigma,USA)，DMSO（Sigma,USA)，Trans2KDNAMarker（北京全式金生物技术有限公司），引物合成和DNA测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。常用化学试剂均为分析纯。1.3试剂配置(1)Rif储液（25mg/mL）：利福平0.5g，DMSO20mL，超净工作台内用0.22µm滤膜过滤除菌。于-20℃冰箱保存备用。(2)Gent储液（50mg/mL）：庆大霉素1g，蒸馏水20mL，超净工作台内用0.22µm滤膜过滤除菌。于-20℃冰箱保存备用。(3)HygB储液（100mg/mL）：潮霉素1g，蒸馏水10mL，超净工作台内用0.22µm滤膜过滤除菌。于-20℃冰箱保存备用。(4)头孢菌素储液（50mg/mL）：头孢菌素1g，蒸馏水20mL，超净工作台内用0.22µm滤膜过滤除菌。于-20℃冰箱保存备用。(5)LB液体培养基：Yeastextract5g，NaCl10g，Tryptone10g，蒸馏水1000mL。121℃高压灭菌20min，根据实验需要，加入合适的抗生素。(6)改良PDA液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.8g，蒸馏水1L，121℃高压灭菌20min，待晾至不烫手时，按需求加入合适的抗生素，混匀，4℃备用。(7)改良PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.8g，琼脂15g，蒸馏水1L，121℃高压灭菌20min，待晾至不烫手时，按需求加入合适的抗生素，在超净工作台内倒平板，待平板晾干后，封口，置于4℃备用。(8)乙酰丁香酮储液（AS）（100mM）：乙酰丁香酮196.2mg，DMSO10mL，充分溶解，超净工作台内用0.22µm滤膜过滤除菌。于-20℃冰箱保存备用。(9)诱导培养基（IM）：0.8mLK-Buffer（1.25MK2HPO4和KH2PO4，pH4.8）20mLMN-Buffer（30g/LMgSO4•7H2O，15g/LNaCl）24 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文1mL1%（w/v）CaCl2•2H2O10mL0.01%（w/v）FeSO4（0.22µm滤膜过滤）5mL微量元素（ZnSO4•7H2O、CuSO4•5H2O、MnSO4•H2O、Na2MoO4•2H2O、H3BO3各100mg/mL，用0.22µm滤膜过滤除菌）2.5mL20%NH4NO310mL50%甘油40mL1MMES（195.24g/L，NaOH调节pH至5.5，0.22µm滤膜过滤除菌，-20℃冻存）10mL20%葡萄糖(w/v)（0.22µm滤膜过滤）补加蒸馏水至1L,121℃高压蒸汽灭菌20min。冷却后，加入100mM的乙酰丁香酮，使其终浓度为200µM，摇匀，4℃存放备用，用于根癌农杆菌EHA105细胞的诱导培养。(10)CO-IM（共培养）培养基：以诱导培养基（IM）为基础，另加入1.5%的琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，加入100mM的乙酰丁香酮，使其终浓度为200µM，摇匀，在超净工作台内倒平板，待平板凝固后，封口，置于4℃备用。(11)1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g，pH值6.8，去离子水定容至100mL，4℃存放。(12)2×SDS-PAGE上样Buffer：1MTris-HCl（pH6.8）1.25mL，β-巯基乙醇0.5mL，10%SDS3mL，溴酚蓝1mg，100%甘油1mL混匀。(13)1.5MTri-HCl(pH8.8)：Tris18.17g，pH值8.8，去离子水定容至100mL，4℃存放。(14)30%聚丙稀酰胺：丙稀酰胺29g，N,N-亚甲基双丙稀酰胺1g，去离子水定容至100mL，0.22m滤膜过滤，4℃保存备用。(15)10%过硫酸铵（10%AP）：过硫酸铵0.1g，去离子水1mL，溶解混匀，现用现配。(16)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris15.1g，Glycine94g，SDS5g，去离子水定容至1L。(17)1×SDS-PAGE电泳缓冲液：取5×SDS-PAGE电泳缓冲液200mL，去离25 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文子水定容至1L，现用现配。(18)染色液：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250mL，充分溶解，加入冰醋酸100mL，去离子水650mL，混合均匀。(19)脱色液：冰醋酸100mL，乙醇50mL，去离子水850mL，充分混匀。(20)膜转移缓冲液：Glycine14.4g，Tris3g，甲醇溶液200mL，去离子水定容至1000mL。(21)TBSTBuffer：NaCl8.8g，1MTris-HCl（pH8.0）20mL，Tween20溶液0.5mL，去离子水定容至1000mL。(22)封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）：脱脂奶粉1.5g，TBSTBuffer30mL，充分溶解。（现配现用）1.4实验设备仪器名称型号仪器来源立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-75SII上海博讯实业有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9240MB上海博讯实业有限公司医疗设备E厂高速离心机LegendMicroThermoFisherScientific17旋涡混合器XW-80A上海青浦沪西仪器厂T100TMThermalCyclerBIO-RADCFXConnectTMOpticsBIO-RADModule高速冷冻离心机ST16RThermoFisherScientific超低温冰箱905ThermoFisherScientific优普系列超纯水器UPH-II-10T成都超纯科技有限公司HH数显三用恒温水箱江苏金坛市金城园胜实验仪器厂恒温培养振荡器ZWY-100H上海智城紫外分析仪JY02S北京君意东方电泳设备有限公司超净工作台SW-CJ-2D苏净安泰超高灵敏度化学发光成像ChemiDocBIO-RAD系统XRS+高级多功能酶标仪VarioskaThermoFisherScientific紫外分光光度计NanoDropThermoFisherScientific20002.方法2.1根癌农杆菌感受态细胞转化26 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文2.1.1根癌农杆菌（EHA105）感受态制备(1)挑取根癌农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL含有50mg/L庆大霉素及25mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃，200rpm，培养约24h，至对数生长期；(2)取2mL菌液加入50mLLB液体培养基中，继续培养至OD600为0.5左右；(3)将上述菌液冰浴30min，后于4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，收集菌体；(4)用l0mL0.l5mol/L预冷的NaCl悬浮菌体；再次于4℃，5000rpm，离心5min，弃去上清，收集菌体；(5)用1mL20mmo1/L预冷的CaCl2悬浮菌体，加入终浓度为15％的甘油，将菌悬液分装于1.5mLEP管中，每支100μL，置液氮中速冻后于-80℃冻存备用。2.1.2根癌农杆菌感受态细胞转化冻融法转化根癌农杆菌：于-80℃冰箱，取3支根癌农杆菌感受态EHA105细胞，置于冰上约30min，待其完全融化。取第一章构建的三个重组质粒：pCAMBIA1300-35S1-RNRM、pCAMBIA1300-35S1-RNRL和pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL各2-6μL分别加入到3支含有100μL根癌农杆菌感受态EHA105细胞的EP管中，轻轻混匀，冰浴40min；液氮中速冻1min；迅速转入37℃水浴中，热激5min；在超净工作台内，贴管壁加入500μL空白的LB液体培养基，轻轻混匀，于28℃，静置10min后，150rpm振荡培养2-4h；将上述三个菌液分别均匀涂布于三个含有50μg/mLKan，25μg/mLRif，50μg/mLGent的LB固体平板，超净台内放置约30min，待水分挥干后，封口，28℃倒置培养约2d至长出菌落；挑取转化平板上的单菌落于500μL含有50μg/mLKan，25μg/mLRif，50μg/mLGent的LB液体培养基中，28℃，200rpm，培养3-4h。取1μl菌液进行PCR鉴定，以RNRM与RNRL片段为检测基因，筛选阳性转化子。挑取阳性转化子，继续培养，-80℃保菌（根癌农杆菌：50%甘油=1：1）。2.2根癌农杆菌介导蛹虫草转化2.2.1蛹虫草孢子的获取取新鲜蛹虫草子实体（四川久远生物技术有限公司提供），在超净工作台内27 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文用无菌水冲洗子实体表面，得到分生孢子悬液，血球计数板计数。调整孢子数约为106个/mL。2.2.2蛹虫草、根癌农杆菌的抗生素敏感性实验取上述蛹虫草孢子悬液，均匀涂布于含有不同浓度潮霉素B（HygromycinB）的改良PDA平板（0，200，400，600，800，1200μg/mL），每板涂100μL，于23℃，避光培养5d，重复3次，确定潮霉素B对蛹虫草菌最低抑制浓度。同时取根癌农杆菌EHA105，均匀涂布于含有不同头孢菌素C380的LB平板（0，50，100μg/mL），28℃，倒置培养2d，重复3次，确定头孢菌素C380对根癌农杆菌EHA105的最低抑制浓度。2.2.3根癌农杆菌介导蛹虫草转化根癌农杆菌活化及诱导培养：取-80℃冻存的分别含有pCAMBIA1300-35S1-RNRM、pCAMBIA1300-35S1-RNRL和pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL重组载体的EHA105根癌农杆菌细胞，加入6mL含有50μg/mLKan，25μg/mLRif，50μg/mLGent的LB液体培养基，28℃，200rpm培养至OD600为1.5左右，离心收集菌体，用诱导培养基（IM）调节OD600为0.15-0.3，28℃，200rpm继续培养至OD600达到0.8左右。根癌农杆菌介导蛹虫草孢子转化：取100μL蛹虫草菌孢子悬液（106个/mL）分别与上述三株活化的EHA105细胞（即：分别含有pCAMBIA1300-35S1-RNRM、pCAMBIA1300-35S1-RNRL和pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL重组载体的根癌农杆菌）100μL混匀，分别将三支混合菌液均匀涂布到表面铺有滤纸的共培养培养基（CO-IM）上，23℃避光培养2d；2d后，将滤纸转移到含有潮霉素B800μg/mL，头孢霉素C380100μg/mL，（另含硫酸链霉素和青霉素各60μg/mL）的改良PDA固体抗性平板上，23℃继续培养2-5d，挑取单个蛹虫草菌转化子移至新的PDA抗性平板上。2.3转化子鉴定2.3.1转化子总DNA的提取分别挑取上述3个抗性平板上的单个转化子，于含有10mL改良PDA液体28 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文培养基的锥形瓶中，23℃，200rpm培养7d，将菌液移至50mL离心管，5000rpm离心10min，收集菌丝，改良CTAB法提取蛹虫草菌丝总DNA[29]。（1）研磨。将收集的蛹虫草菌丝，置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉，取约100mg菌丝粉于1.5mLEP管，加入2×CTAB溶液约100μL，枪头吹打混匀。（2）将上述混匀的粘稠状菌丝混合液置于65℃水浴1h；（3）抽提。加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）溶液（100μL），12000r/min离心10min，取上清。（4）沉淀。加入等体积冰异丙醇（-20℃预冷），混匀后于-20℃沉淀1h，12000r/min离心10min，弃去上清。（5）洗涤。加入300μL70%的乙醇清洗沉淀，12000r/min离心10min，弃去上清，37℃烘干10min。（6）溶解。加入40μL水溶解DNA沉淀，Nanodrop2000测定总DNA含量，DNA溶液-20℃保存。2.3.2重组蛹虫草菌的PCR鉴定采用PCR扩增法检测目的片段，以pCAMBIA1300载体上的潮霉素B抗性基因为参考，设计上下游引物，HygB-F：5'-GGAGTTTAGCGAGAGCCTGACC-3'，hygB-R：5'-GGCGTCGGTTTCCACTATCG-3'，片段长1026bp，菌丝总DNA提取物为模板进行PCR扩增，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，PCR鉴定阳性菌可用于后续表达检测。2.4重组蛹虫草菌RNRL、RNRM基因荧光定量PCR检测荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。其反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，目前已经广泛应用于各个行业。本章采用此方法对重组菌RNRL、RNRM基因进行分子水平表达的分析检测。重组菌总RNA的提取：取在23℃，200rpm振荡培养5d的未作任何处理的蛹虫草菌菌液10mL作阴性对照，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM重组质粒T-DNA区域的重组菌株记为CM-M，含pCAMBIA1300-35S1-RNRL重组质粒29 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文T-DNA区域的重组菌株记为CM-L，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL重组质粒T-DNA区域的重组菌株记为CM-M-L。取23℃，200rpm振荡培养5d的CM-M，CM-L，CM-M-L重组菌株以及阴性对照菌10mL，5000rpm离心10min，弃去上清，取菌体沉淀，加入液氮迅速研磨，按第二章2.2项下方法提取菌丝总RNA。按RTreagentKitwithgDNAEraser（Takara，日本）试剂盒操作步骤操作，将RNA反转录合成cDNA-20℃保存。目的基因RNRM、RNRL以及蛹虫草内参基因β-actin的荧光定量PCR引物如表2-1所示。表2-1RNRL,RNRM,β-actin的实时定量PCR引物Table2-1RealtimequantitativePCRprimerofRNRL,RNRMandβ-actin引物名称引物序列qRNRL-F5'-CGACTCGGTCAACACTAGCGACG-3'qRNRL-R5'-TTGTCTTCTGACTGGCCCTCAACC-3'qRNRM-F5'-TGAAGAACCGTGCCAGCAAAGAGG-3'qRNRM-R5'-AGAAGTTCGTCTTGCCGCCCAG-3'β-actin-F5'-TATTCTTACCCTCCGCTACC-3'β-actin-R5'-GGCGTGGGGAAGAGCGAAAC-3'实时荧光定量PCR反应由25L的反应体系组成：2×UltraSYBRMixture12.5L，上下游引物终浓度均为0.2M，模板cDNA10ng，无菌的ddH2O补足体系。反应在CFXConnectTMOpticsModule仪上进行，每个样品做三次平行实验。设定试验中PCR扩增效率为2（理论值），目的基因RNRL和RNRM的相对量按公式计算，目的基因=2ΔCt，其中ΔCt表示的是重组组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数[30]。ΔCt=AvgCt,q—AvgCt,cb，其中AvgCt,q为重组组目的基因Ct的平均值与内参基因Ct平均值的差值。AvgCt,cb为对照组目的基因的Ct平均值与内参基因Ct平均值的差值。2.5重组蛹虫草菌RNRL、RNRM蛋白WesternBlot检测蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。WesternBlot是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。30 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文具体实验操作步骤如下：(1)样品处理：将收集的新鲜蛹虫草菌丝（阴性对照、CM-M、CM-L、CM-M-L）置于研钵中，迅速加入液氮研磨成粉，取约100mg加入100L2×SDSPAGE上样buffer，100℃煮沸10min。冷却后，12000rpm离心，5min。(2)取25L上清上样，用12%SDS-PAGE分离凝胶进行电泳。以80V电压跑出浓缩胶，110V电压跑完分离胶。(3)电泳完毕后取出凝胶，将其浸泡在转膜缓冲液中，浸泡平衡。(4)根据凝胶的大小剪取PVDF膜和4张滤纸，将滤纸放入转膜缓冲液中，浸泡平衡10min，将PVDF膜在甲醇溶液中浸泡激活15s，然后转移到膜转移缓冲液中。(5)三明治结构夹板的黑色面在下，按照海绵-2层滤纸-凝胶-PVDF膜-2层滤纸-海绵的顺序放好，注意膜与凝胶之间不要有气泡。(6)将转膜装置放入转膜槽中，黑色面对应黑色面，倒入膜转移缓冲液，加入冰袋，插上电极，整个转膜装置置于冰浴中，恒流250mA，70min进行转膜。(7)转膜结束后，将杂交膜取出，用TBST洗一次，在膜的右下角做标记。将膜置于5%脱脂奶粉中封闭，蛋白面朝上，4℃过夜或室温摇动封闭2h。(8)孵育偶联抗体：抗体用5%的脱脂奶粉按1:5000比例稀释，加入15mL稀释后的抗体，室温摇2h或4℃孵育过夜。(9)回收偶联抗体，将膜用TBST溶液洗涤3次，每次10min。(10)曝光。加入PierceTMECLWesternBlottingSubstrate(检测试剂1：检测试剂2=1:1)。曝光，结果拍照保存。3.结果与分析3.1根癌农杆菌转化子鉴定冻融法转化根癌农杆菌，菌液涂布于固体LB抗性平板（50μg/mLKan，25μg/mLRif，50μg/mLGent），28℃，倒置培养2d后，平板菌落生长情况如图2-1所示。分别随机挑取23个单菌落进行菌落PCR，鉴定阳性转化子，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM重组质粒的农杆菌EHA105细胞PCR产物均出现与RNRM大小一致的条带，含pCAMBIA1300-35S1-RNRL重组质粒的EHA105细胞均出现与RNRL大小一致的条带，含pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL31 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文重组质粒的EHA105细胞同时出现与RNRM、RNRL大小一致的条带，说明该方法转化根癌农杆菌较为成功，转化效率较高。ABC图2-1.根癌农杆菌转化子抗性LB平板生长情况Fig.2-1GrowthofAgrobacteriumtumefacienstransformantsonresistantLBplates3.2蛹虫草孢子显微图新鲜的蛹虫草由四川久远生物技术有限公司提供，子实体体试镜如图2-2所示。无菌水冲洗蛹虫草子实体，获取蛹虫草孢子，普通光学显微镜下观察蛹虫草孢子并拍照，如图2-3所示，蛹虫草孢子数目较多，呈明亮的球形。用血球计数板计数孢子量，并稀释至106个/mL。图2-2蛹虫草子实体体试镜图Fig.2-2PhotoofCordycepsmilitarisfruitbodyunderanexaminationmicroscope32 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图2-3蛹虫草孢子显微图（40×）Fig.2-3MicrographofCordycepsspores3.3根癌农杆菌、蛹虫草孢子抗生素敏感性结果取蛹虫草孢子悬液，按100μL/板均匀涂布于含有不同浓度潮霉素B的改良PDA平板（0，200，400，600，800，1200μg/mL），23℃，培养5d，蛹虫草菌生长情况如图2-4所示，结果表明：潮霉素对蛹虫草菌的生长表现出一定的抑制作用，且具有浓度依赖性，当潮霉素含量达到800μg/mL时，几乎可以抑制蛹虫草菌的生长。取根癌农杆菌EHA105，均匀涂布于含有不同头孢菌素C380的LB平板（0，50，100μg/ml），28℃，培养2d，根癌农杆菌生长情况如图2-5所示，结果表明：在同一接种量及培养条件下，当头孢菌素C380的浓度达到100μg/mL时可完全抑制根癌农杆菌EHA105的生长，故实验选用潮霉素作用浓度为800μg/mL，头孢菌素作用浓度为100μg/mL。图2-4.蛹虫草孢子在不同浓度潮霉素PDA平板的生长情况Fig.2-4ThegrowthofCordycepsmilitarissporesonPDAplatescontainingdifferentconcentrationsofhygromycinB33 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图2-5.根癌农杆菌在不同浓度头孢菌素LB平板的生长情况Fig.2-5GrowthofAgrobacteriumtumefaciensatdifferentconcentrationsofcephalosporinLBplates3.4蛹虫草阳性转化子PCR鉴定以pCAMBIA1300上的潮霉素基因为参考设计引物，进行转化子的PCR鉴定，结果如图2-6所示，其中三个重组蛹虫草菌均扩增得到大小约为1026bp的片段，与阳性对照条带大小相等，表明采用根癌农杆菌介导法成功将目的片段重组到蛹虫草菌染色体基因组内。图2-6重组蛹虫草菌中潮霉素基因RCR电泳图Fig.2-6HygromycingeneagarosegelelectrophoresisinrecombinantCordycepsmilitarisM:Trans2KDNAMarker；1:未处理的阴性对照；2～4：CM-M重组菌株；5-7：CM-L重组菌株；8-10：CM-M-L重组菌株3.5实时荧光定量PCR根据2.4项进行荧光定量PCR操作，得到β-actin、RNRM、RNRL三个基因的熔解曲线和扩增曲线如图2-7及图2-8所示，由图2-7可知，内参基因β-actin、目的基因RNRL和RNRM的熔解曲线都是单峰，由此可以说明，引物具有良好34 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文的特异性，熔融曲线并未出现非特异性扩增，也未反应出引物二聚体对实验结果的干扰，引物精确可用，结果可靠。同时，由图2-8可知，内参基因β-actin、目的基因RNRL和目的基因RNRM扩增曲线清晰，而且基线平直，无明显上扬现象，整体平行性较好，说明实验结果良好，数据可靠，可用于下一步目的基因表达的分析检测。β-actin基因熔解曲线RNRM基因熔解曲线35 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文RNRL基因熔解曲线图2-7β-actin、RNRL、RNRM实时定量PCR熔融曲线Fig.2-7RealtimequantitativePCRmeltingcurveofActin,RNRLandRNRMβ-actin基因扩增曲线RNRM基因扩增曲线RNRL基因扩增曲线36 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图2-8β-actin、RNRL和RNRM实时定量PCR扩增曲线Fig.2-8β-actin,RNRLandRNRMrealtimequantitativePCRamplificationcurveAB图2-9RNR大小亚基的相对表达量Fig.2-9TherelativeexpressionofRNRsubunitsA：RNRL基因相对表达量；B：RNRM基因相对表达量A:RelativeexpressionofRNRLgene;B:RelativeexpressionofRNRMgene各重组菌株RNR基因表达情况见图2-9，由图可知：CM-M和CM-M-L菌中RNRM基因的表达量分别为未处理的阴性对照组的2.93和2.40倍，CM-L和CM-M-L菌中RNRL基因的表达量分别为阴性对照组的1.95和3.07倍。表明重37 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文组的RNR外源基因成功在蛹虫草菌内转录表达。3.6WesternBlot检测分析重组的蛹虫草菌在23℃，120rpm条件下分别培养5、10、15d。通过WesternBlot实验，均检测到带有FLAG标签的RNRL和RNRM蛋白。其蛋白分子量分别约为102KDa和47KDa，与由核酸推测的蛋白质分子量大小一致（图2-10），表明外源RNR的大小亚基分别在蛹虫草菌中成功表达，可用于后续虫草素的检测。AB图2-10RNRL和RNRM的WesternBlot图Fig.2-10RNRLandRNRMidentifiedbyWesternBlotA：RNRM蛋白质免疫印迹图；B：RNRL蛋白质免疫印迹图A:RNRMproteinimmunoblotmap;B:RNRLproteinimmunoblotmap4.讨论根癌农杆菌介导的遗传转化，需要毒性蛋白vir(virulence)基因的活化，即T-DNA转移至植物或真菌细胞依赖于毒性系统。而乙酰丁香酮可以诱导根癌农杆菌Vir基因活化。Zheng等研究表明，在诱导培养基及共培养培养基中添加乙酰丁香酮，转化效率可达88%，而不添加乙酰丁香酮转化率仅为67%。实验通过添加乙酰丁香酮诱导根癌农杆菌从而大大提高了转化效率。潮霉素对于蛹虫草菌生长表现出一定的抑制作用，且具有浓度依赖性，随着浓度的升高，抑制作用越明显。文献报道，潮霉素浓度达到500μg/mL即可抑制蛹虫草菌生长，然而实验发现，当浓度达到800μg/mL时才基本抑制蛹虫草菌生长，与文献报道有所出入，推测可能是不同菌种对于潮霉素抗性表现出一定的差异。本章建立了一套完善的由根癌农杆菌介导的蛹虫草菌遗传转化方法，根癌农38 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文杆菌进入细胞后，可将T-DNA区域完整的插入并整合到植物或真菌染色体基因组中，故得到的重组菌株具有稳定遗传的特性。且通过实时荧光定量PCR及WesternBlot发现，RNRM与RNRL基因均在蛋白水平表达。故可将具有高产虫草素的菌种保留下来，方便进一步研究基因的功能，同时其稳定遗传的特点也将为人工发酵获取虫草素提供坚实的物质基础。39 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文第三章蛹虫草转化子虫草素含量检测本实验成功的将核糖核苷酸还原酶RNR的大小亚基RNRL及RNRM转入蛹虫草菌中，分别获得了含有RNRM基因的CM-M菌株，含有RNRL基因的CM-L菌株，及同时含有RNRM和RNRL基因的CM-M-L菌株。并通过荧光定量PCR及WesternBlot检测了其在蛹虫草菌中基因水平和蛋白水平的成功表达，故各重组菌株及未作处理的蛹虫草原始菌株在虫草素含量上的表达差异成为本章的研究重点。本章通过高效液相色谱法（HPLC）对虫草素含量测定的方法进行了方法学考察，包括精密度实验、稳定性实验以及加样回收实验，确定了虫草素含量测定的色谱条件：ZORBAXEclipsePlusC-18柱（250mm4.6mm,5m）；流动相为甲醇(B)-水(A)，梯度洗脱，0～20min，5%～10%B；20～25min，10%～40%B；25～30min，40%B，体积流量1mL/min；检测波长260nm，柱温25℃。通过检测各重组菌株及未处理的对照菌株的虫草素含量，发现只转化了RNRM基因的蛹虫草重组菌虫草素表达量明显高于未作处理的阴性对照菌（p<0.01），只转化了RNRL基因的重组菌含量无明显变化，而同时转化了RNRM和RNRL的重组菌虫草素含量反而较阴性对照有所降低。推测RNRM基因对于虫草素的合成具有重要作用，RNRL基因对于虫草素合成无影响。而当RNRM与RNRL共同存在时，聚合形成核糖核苷酸还原酶RNR，在一定情况下，其更多的参与到腺苷代谢途径，生成2'-脱氧腺苷，造成虫草素合成途径受阻，从而虫草素产量降低。1材料1.1实验材料3组重组蛹虫草菌株（CM-M，CM-L，CM-M-L）及未作处理的蛹虫草原始菌株为实验室保存。1.2实验试剂甲醇为色谱纯(Fisher，美国)，水为超纯水（自制），虫草素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110858-201503），其他试剂均为分析纯。1.3实验仪器40 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文仪器名称型号仪器来源高效液相色谱仪(双泵)G4288C(LC-20日本岛津公司A)优普系列超纯水器UPH-II-10T成都超纯科技有限公司恒温培养振荡器ZWY-100H上海智城分析仪器制造有限公司数控超声波清洗器KQ-500DE昆山市超声仪器有限公司电热鼓风干燥箱GZX-9240MB上海博讯实业有限公司医疗E设备厂高速离心机LegendMicroThermoFisherScientific17超净工作台SW-CJ-2D苏净安泰2方法2.1样品制备2.1.1对照品溶液的制备精密称取虫草素对照品0.81mg置于10mL容量瓶中，精确加水至容量瓶刻度线，称定重量，超声振荡5min溶解，冷却后，再次称定重量，补足失重，制成含虫草素81g/mL的对照品母液，经0.22m微孔滤膜过滤后置于样品瓶中，待上机分析。2.1.2供试品溶液的制备样品处理：分别随机挑取3组重组蛹虫草菌（CM-M，CM-L，CM-M-L）及未作任何处理的蛹虫草原始菌株各3株（其中未作处理的原始菌株作阴性对照），置于改良PDA液体培养基中，23℃，120rpm振荡培养，分别取培养5天，10天，15天的蛹虫草菌20mL，常温下5000r/min离心10min，弃去上层培养基，沉淀菌丝，60℃烘干至恒重，液氮研磨粉碎备用。HPLC供试品溶液的制备：精密称取菌体粉末0.125g，分别置于5mL锥形瓶中，分别精密加水至刻度线，称定重量，超声提取30min，放冷后再称定重量，用水补足失重。分别转移至10mL离心管中5000rmp离心10min，取上清液，经0.22m微孔滤膜过滤后置于样品瓶中，既得供试品溶液。2.2色谱条件[31]色谱柱ZORBAXEclipsePlusC-18柱（250mm4.6mm,5m）；流动相为甲醇(B)-水(A)，梯度洗脱，0～20min，5%～10%B；20～25min，10%～40%B；41 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文25～30min，40%B，体积流量1mL/min；检测波长260nm，柱温25℃。2.3虫草素标准曲线的制备取2.1.1项下已配制好的虫草素对照品母液，配制成不同浓度梯度的虫草素对照品溶液，使溶液中虫草素8.10g/mL，20.25g/mL，40.50g/mL，60.75g/mL，81.00g/mL。2.4方法学考察2.4.1精密度试验按照2.2项下色谱条件，对虫草素对照品溶液连续进样5次进行测定。2.4.2稳定性试验按照2.1.2项下方法处理28℃震荡培养5天的未作处理的蛹虫草对照菌样品，制备供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h后进样，按照2.2项下色谱条件进行检测。2.4.3加样回收试验取28℃震荡培养5天蛹虫草阴性对照菌样品粉末3份，每份0.5g，根据其虫草素含量，分别同时加入lmL合适浓度的混合标准品溶液，使加入量分别为样品中含量的120%、100%和80%。按照2.1项下方法处理样品，制备供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进行检测。2.5虫草素含量测定取2.1项下虫草素对照品溶液和各组供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进行检测。3结果与分析3.1虫草素标准曲线按照2.2项下色谱条件进样，测定虫草素对照品的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），虫草素浓度为横坐标（X），制作标准曲线。计算线性回归方程。经回归分析，线性回归方程为y=127287x-157188，R2=0.9992（n=3），线性范围为0-81.00g/mL，如图3-1。42 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图3-1虫草素标准曲线图Fig.3-1StandardCurveofCordcepin3.2精密度试验按照2.2项下色谱方法，对虫草素对照品溶液连续进样5次进行测定，以保留时间和峰面积为指标，计算RSD值，结果见表3-1。表3-1精密度试验Table3-1PrecisionTest进样编号12345RSD%tR(min)虫草素27.32527.23527.38227.38727.3820.21进样编号12345RSD%峰面积虫草素5108415206305209405156485176350.72由表3-1数据可知，虫草素对照品的保留时间和峰面积的RSD值分别是0.21%和0.72%，表明仪器精密度良好，可用于后续实验。3.3稳定性试验按照2.1.2项下方法处理28℃震荡培养5天的蛹虫草对照菌样品，并制备供43 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h后进样，按照2.2项下色谱条件进行测定。以虫草素峰面积为指标，计算RSD值，实验结果见表3-2。表3-2稳定性试验Table3-2StabilityTest时间(h)024812RSD%峰面积虫草素114095611413311097208111395510859392.01由表3-2结果可知，由28℃培养5天的蛹虫草对照菌样品制备的供试品溶液中虫草素的峰面积RSD值是2.01%，表明蛹虫草供试品在12h内相对稳定。3.4加样回收试验取在28℃震荡培养5天的蛹虫草对照菌样品粉末3份，每份0.5g，分别同时加入lmL虫草素浓度为217.6g/mL、181.4g/mL、145.1g/mL的混合标准品溶液，即加入量分别为样品中量的120%、100%和80%。按照2.1.2项下方法处理样品，制备供试品溶液，按照2.2项下方法进行测定，结果见表3-3。表3-3加样回收率试验(n=3)Table3-3RecoveriesTest(n=3)样品中回收率加入量测定量回收的量平均RDS%(g)（g）率%(g)值%217.6397.199.5虫草素181.4181.4362.599.999.90.37145.1327.8100.4试验结果表明，虫草素平均加样回收率为99.9%，RSD值小于1.0%。说明该方法准确度良好，实验结果准确可信。3.5虫草素含量测定结果与分析将虫草素对照品溶液和各组重组蛹虫草菌样品制备的供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样。虫草素对照品和各组供试品溶液（震荡培养15天）的HPLC色谱图如图3-2，各个重组蛹虫草菌虫草素含量如图3-3，由图可知，蛹虫草中虫草素含量较高，且转化了RNRM基因的CM-M重组蛹虫草菌较未处理的阴性44 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文对照组虫草素的表达量有明显的提高，在第10天时，其表达量为对照组的1.8倍，说明RNRM基因对虫草素的合成可能起着重要的作用。转化了RNRL基因的重组蛹虫草菌较阴性对照组无明显变化，推测RNRL基因对虫草素的合成无影响。而同时含有RNRM和RNRL大小亚基的重组蛹虫草菌的虫草素表达量较阴性对照组低，推测可能是RNRM与RNRL相结合形成核糖核苷酸还原酶RNR，而RNR酶是腺苷代谢途径的关键酶，从而腺苷更多的通过RNR酶催化的路径，分解形成2'-脱氧腺苷。由于腺苷也是虫草素的前体物质，腺苷量大量代谢，故而引起了虫草素含量的降低，该结果与预期推测有所出入，RNR基因在虫草素合成途径中的作用还有待进一步深入探究。同时由图可发现，蛹虫草菌虫草素含量与生长发酵时间成正比，在一定时间内，培养时间越长，其虫草素含量越高，重组菌与未处理的菌均表现出相同趋势。A.虫草素对照品B.阴性对照样品（培养15天）45 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文C.CM-M样品（培养15天）D.CM-L样品(培养15天)E.CM-ML（培养15天）图3-2虫草素对照品及各样品HPLC图谱Fig.3-2HPLCchromatogramsofcordycepinreferencesubstanceandrecombinantsofCordycepsmilitaris46 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文图3-3重组蛹虫草菌虫草素含量a:CM-M与阴性相比,p<0.01;b:CM-L与CM-M相比,p<0.01;c:CM-ML与阴性相比，p<0.01;d:CM-M-L与CM-M相比,p<0.01;e:CM-M-L与CM-L相比,p<0.01;f:CM-M-L与阴性相比,p<0.01;Fig.3-3.Cordycepincontentofrecombinantcordycepsmilitarisfungia:CM-Mvscontrol,p<0.01;b:CM-LvsCM-M,p<0.01;c:CM-M-Lvscontrol,p<0.01;d:CM-MLvsCM-M,p<0.01;e:CM-M-LvsCM-L,p<0.01;f:CM-M-Lvscontrol,p<0.01;4.讨论由第二章可知，RNRM与RNRL基因分别成功转入蛹虫草菌基因组中，并成功表达。本章通过高效液相色谱法（HPLC）检测各个重组菌株中虫草素含量，发现蛹虫草菌内虫草素含量在一定时间内，与菌丝生长发酵时间成正比，培养时间越长，菌丝内虫草素含量越高。根据冬虫夏草转录组分析与腺苷代谢途径推测的虫草素合成路径如图3-4所示，图中实线部分为已经证实的腺苷代谢途径，虚线为推测的虫草素合成途径。由本章分析结果可知：转化了冬虫夏草RNRM基因的重组蛹虫草菌虫草素含量明显高于未处理的阴性对照，而共转了RNRM与RNRL基因的重组菌虫草素含量显著降低，暗示可能是RNRM在虫草素合成过程中起着重要作用。而RNR酶是腺苷代谢形成2'-脱氧腺苷的关键酶，推测共转的RNRM与RNRL结合形成RNR酶，菌体内RNR酶含量升高，腺苷通过图中实线路径大量代谢生成2'-脱氧47 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文腺苷，因前体物质腺苷的减少，造成虫草素含量降低，而RNRM在虫草素合成过程中的作用及其作用机制有待进一步深入的探究。核糖核苷酸还原酶RNR是生物体内唯一能够催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸的酶，冬虫夏草RNR酶是Ia类RNR，全酶由大小两个亚基组成，两个亚基均为二聚体，结构为α2β2，大亚基具有与底物及变构效应物结合的部位，小亚基RNRM是一个铁硫蛋白，通过酪氨酸残基的苯环形成特异的自由基而参加催化反应，即是负责底物转化的催化区，又携带接触抑制区[32]。小亚基是一个同源二聚体，形成两个相同的二价铁中心，稳定一个酪氨酰自由基，这些对催化过程中触发电子运输有着十分重要的作用[33]。本章实验显示，RNR确实对虫草素地合成具有一定地影响，其小亚基RNRM对虫草素的合成表现出促进作用，大亚基RNRL未发现明显作用，而共转RNR大小亚基后，虫草素含量反而降低，这一结果有待进一步的研究，如图3-4推测左右两个路径竞争腺苷，RNR酶将ADP转化为2’-dADP，共转化左侧路径增强，更多消耗前体物质，致使虫草素含量降低；但RNRM在虫草素合成代谢过程中的具体作用及作用机制，以及RNR酶在虫草素代谢过程的作用有待深入的研究探讨。图3-4虫草素生物合成预测途径Fig.3-4Aputativebiosynthesispathwayforcordycepin48 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文结论本实验以前期课题组对冬虫夏草子实体转录组分析推测出的虫草素合成关键酶—核糖核苷酸还原酶（RNR）的基因为目的基因，通过遗传转化的方法探究其基因功能。利用cDNA克隆技术获取冬虫夏草子实体的RNR基因大小亚基（RNRL、RNRM）基因的全长。通过设计带有FLAG表达标签以及相应酶切位点的引物，成功构建了三个重组质粒，pCAMBIA1300-35S-RNRM、pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL。根癌农杆菌介导的方法成功将三个重组质粒的T-DNA片段插入蛹虫草菌染色体基因组中，通过抗性筛选及PCR鉴定成功获取三组重组菌株（CM-M、CM-L、CM-M-L），并利用荧光定量PCR及WesternBlot鉴定，结果重组菌株的外源RNR基因均在基因和蛋白水平表达，证明转化成功。利用高效液相色谱法检测三个重组菌及蛹虫草阴性对照菌在虫草素表达上的差异，结果发现：整合了RNRM基因的蛹虫草重组菌较对照组，虫草素含量明显升高，整合了RNRL基因的蛹虫草重组菌较对照组无明显变化，而同时共转了RNRM与RNRL基因的蛹虫草重组菌较对照组虫草素含量低，推测：RNRM基因对虫草素合成起着重要作用，而RNRM与RNRL相结合形成核糖核苷酸还原酶RNR，而RNR酶是腺苷代谢分解形成2'-脱氧腺苷途径的关键酶，RNR含量增多腺苷更多的代谢生成2'-脱氧腺苷，由于前体物质腺苷减少，引起了虫草素含量的降低，但RNRM在虫草素合成过程中的具体作用尚不明确，有待进一步深入探究。49 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文文献综述中药有效成分生物合成的研究进展1中药基因组学随着高通量测序技术和生物信息学的发展，借助于模式生物学的经验，以中药原物种为研究对象的中药基因组学已逐渐成为当今中药现代化研究的重点。中国医学科学院药用植物研究所陈士林课题组已完成了赤芝、紫芝、茯苓、丹参等物种的基因组框架图，其中赤芝基因组研究结果发表在《NatureCommunications》[34]，详细解析了灵芝细胞色素、转运蛋白、转录因子等次级代谢产物的合成、运输、调控相关的基因，为次生代谢产物合成及调控的研究奠定了基础。此外，三七[35]、人参[36]、西洋参[37]、甘草[38]等一大批重要中药原物种的转录组测序分析也相继完成。中药基因组学研究不仅为揭示中药活性成分合成途径奠定基础，同时还为中药合成生物学提供了丰富的生物学元件，进一步促进了基因功能的研究。中药基因组学与合成生物学相互促进，为创新型药物的发展提供了新的手段。中药基因组学主要利用第二代和第三代的高通量测序技术，快速获取中药原物种的遗传信息，结合蛋白组学、代谢组学，对重要的功能基因进行高效的挖掘和鉴定，从而在分子水平上促进中药合成生物学的研究。中药基因组学主要分为转录组学、结构基因组学、基因组标记、功能基因组4个研究方向[39]。1.1中药转录组学研究转录组是特定细胞在某一生理状态下全部转录产物的总和，通过转录组学分析可以全方位地研究生物体基因在不同生理条件的表达水平以及形成这种特定表达状况的调控机制[40]，即从RNA水平研究基因的表达水平。通过构建不同部位、不同生长时期的转录组文库，可以有效的挖掘和鉴定与次级代谢产物合成及调控相关的基因，进而分析中药有效成分的生物合成途径及其调控机制。由于目前大量中药原物种缺乏全基因组信息，因此，转录组学分析逐渐成为分析克隆新基因、研究基因功能的重要手段。目前，已有大量重要中药原物种完成转录组测序分析，如：人参、西洋参、丹参[41]、三七、甘草、银杏[42]、喜树[43]等。1.2结构基因组学研究50 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文结构基因组学是研究基因组的组织结构、基因数量、基因组成、基因定位的一门学科，以建立具有高分辨的基因组遗传图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱为主要内容。结构基因组学早期主要应用于模式生物和农作物中，由于缺乏药用模式物种，中药生物学研究受到很大限制，目前尚处于起步阶段。陈士林等[44]于2010年提出本草基因组计划，随后获得了赤芝、紫芝、茯苓等药用真菌的精确基因组图谱，以及丹参的基因组框架图。通过对具有典型次级代谢途径的中药原物种进行全基因组测序和结构基因组分析，建立药用模式种，推动中药现代化的研究。1.3中药基因组标记研究基于生物个体或种群间基因组中核苷酸序列的变异，对中药原物种进行分类验证、质量控制等，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。中药转录组学和中药结构组学研究的发展为中药基因组标记的研究提供了大量的遗传资料。其中，微卫星标记（SSR）和DNA条形码为目前应用较为广泛的基因组标记。微卫星标记含量丰富、片段较小、在基因组中分布较为均匀[45]，可从转录组和结构基因组中获取丰富的SSR数据，已成为目前基因组研究的必选标记类型。陈子易等[46]成功利用SSR数据，实现了人参和西洋参的种间鉴定。DNA条形码通用性较好，核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组均可作为DNA条形码序列，可广泛应用于动植物中。陈士林等通过对蔷薇科[47]、菊科[48]、大戟科[49]、芸香科[50]等科属的分析，验证了ITS2鉴定的通用性，首次在国际上建立了中药材DNA条形码鉴定技术[51]。随着中药基因组标记技术研究的深入，可为中药原物种分子育种及道地性遗传机制的研究提供更多数据基础。1.4中药功能基因组学研究基于基因组序列信息，将各种组学信息与基因功能以及表型结合起来，全面分析基因的功能，使生物学研究从单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行的系统研究。中药功能基因组学已取得一定的进展，如：已成功鉴定的参与人参皂苷合成相关的达玛烷合酶、人参二醇合酶等[52][53]。但大量的中药原物种遗传背景不清晰[40]，导致相关基因研究进展缓慢，目前随着测序技术的发展，中药功能基因组学的研究也将会迎来快速的发展。51 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文2中药有效成分生物合成2.1中药生物合成研究简介中药药用活性成分是中药发挥药效的物质基础[54]，也是新药的重要来源[55]。中药有效成分获取的途径有：化学合成、提取分离、植物组织培养或发酵培养等，然而许多珍稀中药材生长条件苛刻、生长缓慢、难以人工种植；活性成分含量较低，提取率较低，结构复杂，人工合成过程冗长，且易造成环境污染，难以满足市场需求。中药合成生物学的出现，将有效的改善这一现状。中药基因组学为中药合成生物学提供了大量的遗传资料，在此基础上，通过对基因组学提供的药物生物合成相关生物元件的挖掘、功能验证等，重建合成途径和代谢网络，从而实现活性成分的定向、高效合成。中药有效成分生物合成研究，首先要从大量基因中筛选有效的候选基因，候选基因的筛选途径有：时空表达分析获得有效候选基因、诱导共表达获得有效候选基因、组学数据系统整合分析获得候选基因、以及其他借鉴于模式生物的获取候选基因方法。其中利用组学数据系统整合分析为当今研究热点，利用转录组和代谢组整合分析有效成分生物合成及代谢路径，有效的锁定关键候选基因，进行新基因功能验证，为有效成分的研究提供理论依据。对于候选基因的功能验证，主要分为体外验证和体内验证。体外验证是通过设计和组装将候选基因与各个生物元件（如：启动子、转录单元、质粒骨架、接合转移元件、转座子、蛋白质编码区等DNA序列,也包括核糖体绑定位点和终止子等RNA序列以及蛋白质结构域）整合成具有生物学功能的生物学装置，再将其转入特定的模式表达系统中，常用的异源表达系统有大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌等，由于其具有生长快速、遗传操作简单、适合大规模培养、工业化控制简便等优点，利于后期有效成分的检测与量化生产。体内验证，针对于遗传转化体系较为成熟的物种，目前体内基因功能验证的方法包括过表达，用以上调基因表达；RNA干扰或病毒诱导的基因沉默等下调基因表达，以及TALEN、CRISPR-Cas9等基因定点敲除和修饰技术等[56]。随着生物合成学的快速发展，挖掘生物合成途径中的有效基因，选择合适的底盘细胞，重建合成途径，优化表达系统，一方面可以成功构建微生物工程菌株，高效生产所需有效成分，另一方面，通过对原有物种的改造，可有效提高其有效52 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文成分含量，改良高产菌株。2.2遗传转化体系构建的研究在生物合成过程中，基因功能的验证需要选择一个稳定有效的底盘细胞，来提供表达体系，常用的异源表达系统有大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌等，但许多参与合成有效次级代谢产物的基因常以基因家族的形式出现，很多情况下，需要通过体内功能验证基因功能，因此，建立高效稳定的遗传转化体系在生物合成中也尤为重要。目前，根癌农杆菌介导法在植物与真菌遗传转化中为最常用的遗传转化手段之一。下面将针对根癌农杆菌介导真菌遗传转化展开详细的介绍。2.2.1根癌农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化研究为深入的探究基因的功能，探究相关基因的表达和调控体系，建立一个高效稳定的真菌遗传转化体系尤为重要。目前，常见的真菌转化方法有:原生质体转化法、醋酸锂转化法、电穿孔转化法和根癌农介导转化法(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT)等[57]。根癌农杆菌介导的转化体系克服了常规的PEG介导的原生质体转化以及限制酶介导的插入突变等需要制备原生质体、转化效率低等缺点，为真菌的遗传转化和基因功能的研究提供了可靠的工具，具有操作方法简单、转化受体多样、单拷贝、转化效率较高、遗传稳定等优点。现已被广泛运用于真菌的遗传操作，是一种最为简单有效的转化方法。在虫草相关真菌中利用ATMT法成功建立转化体系的已报道的有：蛹虫草菌、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌等[58]。2.2.2根癌农杆菌介导转化的机理根癌农杆菌(Agrobacteriumbacterium)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，其细胞中含有Ti(Tumourinducing)质粒，Ti质粒上有一段T-DNA(TransferringDNA)，自然情况下，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入并整合到植物基因组中[59]，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代。据此，将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的侵染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植株。同时，根癌农杆菌介导的遗传转化，需要毒性蛋白vir(virulence)基因的活化，即T-DNA转移至植物或真菌细胞依赖于毒性系统[60]。2005年，Michieise等[61]利用不同毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变菌株转化泡盛曲霉（Aspergillusawamori），以探究不同毒性53 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文蛋白在T-DNA转移时的作用。研究表明，任何一个调节蛋白(VirA，VirG)，或者转运通道蛋白(virB)，或是T链复合物形成蛋白(VirD，VirC，VirE2)的失活都会降低转化效率。然而，VirE3，VirH，VirF毒性蛋白[62-64]，在农杆菌转化A．awamori的过程中是非必需的。因此，根癌农杆菌转化介导真菌遗传转化的机理还有待更深入的探究。最初根癌农杆菌被广泛的应用于植物的遗传转化中。1995年，Bundock等[65]尝试用根癌农杆菌介导酵母的遗传转化，发现根癌农杆菌可以成功转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，随后deGroot等[66]又用根癌农杆菌成功转化了丝状真菌，大大拓宽了根癌农杆菌介导遗传转化的应用，在多种情况下，根癌农杆菌介导丝状真菌的遗传转化既简单，又表现出很好的可重复性[67]。目前根癌农杆菌介导法已用于大量真菌遗传转化中。2.2.3根癌农杆菌介导真菌遗传转化步骤（1）构建含有目的基因的双元载体，根据实验目的，选取带有合适抗性筛选基因的载体，确定酶切位点，将目的基因及空载体进行双酶切，将酶切片段及载体用DNA连接酶进行连接。筛选并测序得到正确的重组质粒。（2）载体的农杆菌转化，制备根癌农杆菌感受态细胞。常用的根癌农杆菌感受态细胞转化法有：冻融法、电转法、电击法等，其中冻融法最为常用。筛选得到含有重组质粒的农杆菌；（3）用含有诱导剂乙酰丁香酮（AS，acetosyringon）的诱导培养基培养农杆菌至合适的浓度待用；（4）取适量诱导的农杆菌与等量的真菌孢子悬液混匀，涂布于共培养培养基的承载介质上，培养合适的时间。（5）将介质移至含有抗性的培养基上，至长出单菌落，挑取单菌落进行鉴定。（6）筛选阳性转化子，进行基因表达验证（荧光定量PCR基因检测及WesternBlot蛋白检测）；（7）进行相关基因功能验证。2.3中药生物合成研究的应用2.3.1青蒿素前体生物合成的研究2003年，Martin等[68]在大肠杆菌中导入了包括合成MvA的编码基因以及ADS基因在内的9个基因，通过重建MVA途径和紫穗槐-4，11-二烯合成途径，成功检测到了青蒿素中间产物紫穗槐-4，11-二烯。2006年，Lindalil等[69]将含ADS基因的质粒导入酿酒酵母中，另将ADS基因整合到酵母染色体上，分别获54 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文得600和100g/L的紫穗槐-4，11-二烯。首次在真核生物中生产出青蒿素前体。同年，Ro等[70]将ADS、CYP71AVI基因导入酿酒酵母中，重建青蒿酸代谢途径，通过优化培养条件，获得了115mg/L青蒿酸。青蒿酸可分泌到培养基中，大大地简化了分离纯化过程，进一步降低了成本。2008年，Zhang等[71]将新DBR2基因与其它几个关键酶基因一起转进酵母，同时获得青蒿酸和双氢青蒿酸。青蒿酸经过4步简单的化学反应可合成青蒿素[72]。2.3.2人参皂苷生物合成的研究人参皂苷为三萜类化合物，其生物合成包括20余步连续的酶促反应[73]。王康宇等[74]利用实时荧光定量PCR测定人参15个组织器官中法尼基焦磷酸合酶、鲨稀合成酶、鲨稀环氧酶、氧化鲨稀环化酶、β-香树素合酶和细胞色素P450超家族基因的相对表达量，发现6种参与人参皂苷合成的酶基因调控人参总皂苷与单体皂苷的生物合成。Yan等[75]从人参cDNA文库中筛选出糖基转移酶基因UGTPg1，并将人参皂苷合成相关酶基因与UGTPg1一起导入酿酒酵母中，成功构建了能产生稀有人参皂苷CompoundK的工程菌。2.3.3丹参酮生物合成的研究丹参酮为二萜醌类化合物，其生物合成途径起始于萜类化合物的通用途径即生成异戊二烯基焦磷酸的甲羟戊酸途径和生成二甲烯丙基焦磷酸的丙酮酸/磷酸甘油醛途径[76]。早期研究中，主要针对萜类上游通用途径开展丹参酮生物合成研究，获得了大量萜类合成途径中的催化酶及其编码基因。GuoJ等[77]将已知的丹参酮途径在酵母中重构，获得了可以合成丹参酮前体弥罗松酚的酵母细胞，经过元件优化，使其发酵产量达到了10.5mg/L。马莹等[78]通过Gateway技术构建RNA干扰载体，并通过发根农杆菌介导转染丹参叶片，建立了高效的丹参CYP76AHl干扰毛状根体系，为RNA干扰技术在丹参代谢途径基因功能的研究应用上提供了基础。55 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:115.[2]向丽.冬虫夏草保护生物学研究[D].北京协和医学院,2013.[3]张博华,陈晶.冬虫夏草药理作用研究进展[J].中医药信息,2012,29(1):134-135.[4]WuWC,HsiaoJR,LianYY,etal.TheapoptoticeffectofcordycepinonhumanOEC-M1oralcancercellline[J].CancerChemotherapyandPharmacology,2007,60(1):103-111.[5]LiaoY,LingJ,ZhangG,etal.CordycepininducescellcyclearrestandapoptosisbyinducingDNAdamageandup-regulationofp53inLeukemiacells[J].CellCycle,2015,14(5):761-771.[6]王玉贤,王艺璇,陈蓉,等.冬虫夏草蛋白提取物抗A549肺癌细胞及免疫活性分析[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(01):79-84.[7]王建芳,杨春清.蛹虫草有效成分及药理作用研究进展[J].中医药信息,2005,5(1):30-32.[8]KimHO,YunJW.AcomparativestudyontheproductionofexopolysaccharidesbetweentwoentomopathogenicfungiCordycepsmilitarisandCordycepssinensisinsubmergedmycelialcultures[J].JournalofAppliedMicrobiology,2005,99(4):728-738.[9]ZhengZ,HuangC,CaoL,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationasatoolforinsertionalmutagenesisinmedicinalfungusCordycepsmilitaris[J].FungalBiology,2011,115(3):265-274.[10]CunninghamKG,MansonW,SpringFS,etal.Cordycepin,ametabolicproductisolatedfromculturesofCordycepsmilitaris[J].LinkNature,1950,166(4231):949.[11]梁宗琦.中国真菌志.第三十二卷.北京:科学出版社.1-19.[12]李春如,黄勃,南圣姬,等.具抗癌活性的RCEF0718虫草菌株的鉴定研究.莱阳农学院学报,2006,23(24):263-267.[13]LiaoY,LingJ,ZhangG,etal.CordycepininducescellcyclearrestandapoptosisbyinducingDNAdamageandup-regulationofp53inLeukemiacells[J].CellCycle,2015,14(5):761-771.[14]王文婷.虫草素合成相关酶基因克隆与表达[D].山东师范大学,2016.[15]LennonMB,SuhadolnikRJ.Biosynthesisof3'-deoxyadenosinebyCordycepsmilitaris.Mechanismofreduction[J].Biochimicaetbiophysicaacta,1976,425(4):532-536.[16]ZhengP,XiaY,XiaoG,etal.GenomesequenceoftheinsectpathogenicfungusCordycepsmilitaris,avaluedtraditionalChinesemedicine[J].GenomeBiology,2011,12(11):116.[17]XiangL,LiY,ZhuY,etal.TranscriptomeanalysisoftheOphiocordycepssinensis,fruitingbodyrevealsputativegenesinvolvedinfruitingbodydevelopmentandcordycepinbiosynthesis[J].Genomics,2014,103(1):154-159.[18]倪贺,李海航,黄文,等.核糖核苷酸还原酶研究[J].科技导报,2008(8):79-83.56 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文[19]黄羽琪,童锌芯,陶向,等.基于转录组测序的冬虫夏草虫草素生物合成研究[J].中草药,2017,48(19):4044-4050.[20]FangW,ZhangY,YangX,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofBeauveriabassianausinganherbicideresistancegeneasaselectionmarker[J].Journalofinvertebratepathology(medsci),2004,85(1):18-24.[21]张平.虫草属真菌研究进展.生物学杂志[J],2003,20(6):43-45.[22]王杰,王全,田娜,等.不同植物组织RNA提取方法的比较分析[J].北京农学院学报,2015,30(1):76-80.[23]ZhangY,AnX,StubbeJ,etal.InvestigationofinvivorolesoftheC-terminaltailsofthesmallsubunitofSaccharomycescerevisiaeribonucleotidereductase:contributiontocofactorformationandintersubunitassociationwithintheactiveholoenzyme[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2013,288(20):13951-13959.[24]ReichardP.FromRNAtoDNA,whysomanyribonucleotidereductases?[J].Science,1993,260(5115):1773-1777.[25]田华,李红,张立行,等.核糖核苷酸还原酶亚基RRM1、RRM2和RRM2B表达对肝细胞癌患者预后的影响[J].肿瘤,2014,34(5):458-463.[26]MichielseCB,HooykassPJ,vandenHondelCA,etal.Agrobacterium-mediatedtransformationasatoolforfunctionalgenomicsinfungi.CurrGenet.2005,48:1-17.[27]ZhengZL,HuangCH,CaoL,,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationasatoolforinsertionalmutagenesisinmedicinalfungusCordycepsmilitaris[J].BritishMycologicalSociety.2011,115(3):265-274.[28]郭维.根癌农杆菌介导深红虫草菌株C033遗传转化的研究[D].江西农业大学,2013.[29]房凌旭.一种改进的CTAB法提取真菌DNA[J].赤子(上中旬),2015,24(23):198.[30]朱玉贤,李毅,郑晓峰,等.现代分子生物学第四版[M].北京:高等教育出版社,2013:239.[31]程元柳.基于核苷类指标性成分的冬虫夏草质量控制研究[D].成都中医药大学,2015．[32]BeplerG.UsingtranslationalresearchtotailortheuseofchemotherapyinthetreatmentofNSCLC[J].LungCancer,2005,50(1):S13-S14.[33]SmithBD,KarpJE.Ribonucleotidereductase:anoldtargetwithnewpotential[J].LeukemiaResearch,2003,27(12):1075.[34]ChenSL,XuJ,LiuC,etal.GenomesequenceofthemodelmedicinalmushroomGanodermalucidum[J].NatCommun,2012,3:913.[35]LuoHM,SunC,SongJY,etal.AnalysisofthetranscriptomeofPanaxnotoginsengrootuncoversputativetriterpenesaponin-biosyntheticgenesandgeneticmarkers[J].BMCGenomics,2011,12(5):5.[36]ChenSL,LuoHM,LiY,etal.454ESTanalysisdetectsgenesputativelyinvolvedin57 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文ginsenosidebiosynthesisinPanaxginseng[J].PlantCellReport,2011,30:1593−1601.[37]SunC,LiY,WuQ,etal.DenovosequencingandanalysisoftheAmericanginsengroottranscriptomeusingaGSFLXTitaniumplatformtodiscoverputativegenesinvolvedinginsenosidebiosynthesis[J].BMCGenomics,2010,11:262.[38]LiY,LuoHM,SunC,etal.ESTanalysisrevealsputativegenesinvolvedinglycyrrhizinbiosynthesis[J].BMCGenomics,2010,11:268.[39]陈士林,朱孝轩,李春芳,等.中药基因组学与合成生物学[J].药学学报,2012,47(08):1070-1078.[40]WuCY,SongJY,ChenSL,etal.Applicationofexpressedsequencetagstostudyonmedicinalplant[J].ChineseTraditionalHerbDrugs.2008,39:778−782.[41]LiY,SunC,LuoHM,etal.TranscriptomecharacterizationforSalviamiltiorrhizausing454GSFLX[J].ActaPharmaceuticaSinica.2010,45:524−529.[42]LinXH,ZhangJ,LiY,etal.Functionalgenomicsofalivingfossiltree,Ginkgo,basedonnext-generationsequencingtechnology[J].PhysiolPlant,2011,143:207−218.[43]SunYZ,LuoHM,LiY,etal.PyrosequencingoftheCamptothecaacuminatatranscriptomerevealsputativegenesinvolvedincamptothecinbiosynthesisandtransport[J].BMCGenomics,2011,12:533.[44]ChenSL,SunYZ,XuJ,etal.StrategiesofthestudyonHerbGenomeProgram[J].ActaPharmaceuticaSinica.2010,45:807−812.[45]LiuZJ.AquacultureGenomeTechnologies[M].NewJersey:BlackwellPublishing,2007.[46]ChenZY,LuXN,ChengZ,etal.ApplicationofmicrosatellitemarkerstodifferentiatePanaxginsengC.A.MeyerfromPanaxquinquefoliusL[J].JournalofFudanUniversity(NaturalScience).2011,50:185−191.[47]PangXH,SongJY,ZhuYJ,etal.ApplyingplantDNAbarcodesforRosaceaespeciesIdentification[J].Cladistics,2011,27:165−170.[48]GaoT,YaoH,SongJY,etal.EvaluatingthefeasibilityofusingcandidateDNAbarcodesindiscriminatingspeciesofthelargeAsteraceaefamily[J].BMCEvolutionaryBiology,2010,10:324.[49]PangXH,SongJY,ZhuYJ,etal.UsingDNAbarcodingtoidentifyspecieswithinEuphorbiaceae[J].PlantaMedica,2010,76:1784−1786.[50]LuoK,ChenSL,ChenKL,etal.AssessmentofcandidateplantDNAbarcodesusingtheRutaceaefamily[J].ScienceinChinaSeriesC-lifeSciences,2010,53:701−708.[51]ChenSL,PangXH,YaoH,etal.IdentificationsystemandperspectiveforDNAbarcodingtraditionalChinesemateriamedica[J].WorldSciTechnolModTraditChinMed.2011,13:747−754.[52]LiangY,ZhaoS.Progressinunderstandingofginsenosidebiosynthesis[J].PlantBiology.2008,10:415−421.[53]DeviBS,KimYJ,SathiyamoorthyS,etal.Classificationandcharacterizationofputative58 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文cytochromeP450genesfromPanaxginsengC.A.Meyer[J].Biochemistry(Mosc),2011,76:1347−1359.[54]NewmanDJ,CraggGM.Naturalproductsassourcesofnewdrugsoverthelast25years[J].NaturalProductReports,2007,70:461−477.[55]NewmanDJ.Naturalproductsasleadstopotentialdrugs:anoldprocessorthenewhopefordrugdiscovery[J].JournalofMedicinalChemistry,2008,51:2589−2599.[56]马莹,郭娟,毛亚平,等.药用植物有效成分生物合成途径解析及其应用[J].中华中医药杂志,2017,32(05):2079-2083.[57]FangW,ZhangY,YangX,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofBeauveriabassianausinganherbicideresistancegeneasaselectionmarker[J].Jinvertebrpathol,2004,85:18-24.[58]张平.虫草属真菌研究进展.生物学杂志[J],2003,20(6):43-45.[59]YanP,LuoXC,ZhouQ,etal.AdvanceandProspectofFilamentousFungiGeneEngineering[J].ProgressinBiotechnology,1999,3(01):36-41.[60]黄亚丽,潘玮,蒋细良,等.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J].生物技术通报,2007,6(3):111-114.[61]MichielseCB,HoykaasPJ,vanden,etal.Agrobacterium-mediatedtransformationastoolforfunctionalgenomicsinfungi[J].GurrGenet,2005,48(1):1-17.[62]MichielseC,SalimK,RagasP.DevelopmentofasystemforintegrativeandstabletransformationofthezygomyceteRhizopusoryzaebyAgrobacterium-mediatedDNAtransfer.MolecularGeneticsandGenomics,2004,27(1):499-510.[63]MichielseC,RamA,Hooykaas,P.RoleofbacterialvirulenceproteinsinAgrobacteriummediatedtransformationofAspergillusawamori.FungalGeneticsandBiology.2004,4(1):571-578.[64]FinchamJRS.Transformationinfungi.MicrobiologyReview,1989,17:148-170.[65]BundockP,denDulk-RasA,BeijersbergenA,etal.Trans-kingdomT-DNAtransferfromAgrobacteriumtumefacienstoSaccharomycescerevisiae.EmboJournal,1995,14(13):3206-3214.[66]deGrootMJA,BundockP,HooykassPJJ,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi.NatBiotechnol,1998,16:839-842.[67]杨长得,刘刚,郑易之,等.根癌农杆菌在丝状真菌转化中的应用[J].生物技术通讯,2006,17(5):784-787.[68]MartinVJJ,PiteradJ,WithersST,etal.EngineeringamevalonatePathwayinEseherichcoliforProductionofterpenoids.NatBiothehnol,2003,21:796-803.[69]LindahlAL,OlssonME,MerckeP,etal.ProductionoftheartemisininPrecursoramorpha-4,11-dienebyengineeredSaeeharomycescerevisiae.BioteehnolLett,2006,28:571-580.59 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文[70]RoDK,ParadiseEM,OuelletM,etal.Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast[J].Nature,2006,440(7086):940.[71]ZhangY,TeohKH,ReedDW,etal.ThemolecularcloningofartemisinicaldehydeDelta11(13)reductaseanditsroleinglandulartrichome-dependentbiosynthesisofartemisinininArtemisiaannua[J].JournalofBiologicalChemistry,2008,283(31):21501-21508.[72]PaddonCJ,WestfallPJ,PiteraDJ,etal.High-levelsemi-syntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin[J].Nature,2013,496(7446):528.[73]魏来,罗志勇.人参皂苷生物合成及关键酶的研究进展[J].湖南中医志,2017,33(10):212-215.[74]王康宇,张美萍,李闯,等.人参15个组织器官中皂苷量与6种人参皂苷生物合成基因表达的相关性研究[J].中国中药杂志,2015,40(16):3168-3173.[75]YanX,FanY,WeiW,etal.ProductionofbioactiveginsenosidecompoundKinmetabolicallyengineeredyeast.[J].CellResearch,2014,24(6):770-773.[76]刘薇薇,陈军峰,肖莹,等.丹参中主要活性成分生物合成的研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2016,18(11):1891-1898.[77]GuoJ,ZhouYJ,HillwigML,etal.CYP76AH1catalyzesturnoverofmiltiradieneintanshinonesbiosynthesisandenablesheterologousproductionofferruginolinyeasts[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(29):12108-12113.[78]马莹,马晓惠,马晓晶,等.丹参酮生物合成途径CYP76AH1基因RNA干扰体系的建立及干扰效果研究[J].中国中药杂志,2015,40(08):1439-1443.60 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文致谢本课题在我的研究生导师国锦琳教授的悉心指导下完成。研究生期间国老师在学习、生活等方面给予了我很大的关怀和帮助，是我成长路上的指路明灯。导师认真的工作态度和严谨的科研精神让我敬佩，对学生无微不至的关怀让我感动。在此向国老师表示崇高的敬意和最衷心的感谢。感谢师奶奶万德光教授的点拨。感谢题组童芯锌老师对实验过程与论文撰写过程中巨大帮助。感谢侯飞侠老师、赵美莲老师、李阳老师、陈璐老师对我的指导与帮助。感谢中药资源与中药鉴定教研室全体老师的帮助。三年时光如白驹过隙，感谢807实验室的叶茂师兄、王茜师姐、黄羽琪师兄、黄彪师兄、陈蓉、王艺璇、王沙沙、曹静、张涵同学在实验与生活上给予我的支持与关心，最后向一直支持和帮助我完成学业、健康成长的家人表示深深的谢意。感谢母校成都中医药大学多年的培养！61 成都中医药大学药学院2018届硕士研究生学位论文在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果成果鉴定、颁奖部门及奖励类序本人署名成果（论文、专著、获奖项目）名称别、等级或发表刊物与出版单号次序位、时间1冬虫夏草蛋白提取物抗A549肺中国实验方剂学2017.91癌细胞及免疫活性分析2JournalofMedicinalFood1ProteinExtractfrom2018投稿OphiocordycepssinensisInducedApoptosisinA549LungCancerCellbyMediationBax,Bcl-2andCaspaseDependentPathway3基于转录组测序的冬虫夏草虫草中草药20174素生物合成研究62
此文档下载收益归作者所有
